漢黃芩素對(duì)肺炎支原體肺炎小鼠肺組織中肺上皮間質(zhì)形成因子表達(dá)的影響

王斯楚，孫 一，王曉溪，王 欣，蒙艷麗，王偉明

漢黃芩素對(duì)肺炎支原體肺炎小鼠肺組織中肺上皮間質(zhì)形成因子表達(dá)的影響

王斯楚，孫 一，王曉溪，王 欣，蒙艷麗*，王偉明*

黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036

探討漢黃芩素通過(guò)調(diào)控肺上皮間質(zhì)形成因子的表達(dá)，治療肺炎支原體肺炎的作用機(jī)制。運(yùn)用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-Q-TOF-MS）技術(shù)檢測(cè)芩百清肺濃縮丸中的活性成分漢黃芩素，通過(guò)Biacore垂釣技術(shù)將其與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）進(jìn)行結(jié)合，動(dòng)力學(xué)分析驗(yàn)證其結(jié)合的特異性。采用Tripos Sybyl-X2.1.1以及Discovery Studio2016軟件對(duì)漢黃芩素和TGF-β1進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)藥物分子與受體蛋白的結(jié)合模式進(jìn)行可視化分析。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)制作小鼠肺部病理組織切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色、Masson染色，觀察其病理結(jié)構(gòu)形態(tài)。運(yùn)用實(shí)時(shí)（real-time，RT）-PCR、免疫組化（immunohistochemistry）技術(shù)檢測(cè)漢黃芩素對(duì)小鼠肺組織中TGF-β1、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、波形蛋白、E-鈣黏蛋白mRNA和蛋白的表達(dá)水平的影響。Biacore垂釣得到的樣品經(jīng)UPLC-Q-TOF-MS鑒定分析為漢黃芩素。漢黃芩素與TGF-β1存在較強(qiáng)的特異性結(jié)合。HE染色和Masson染色結(jié)果表明，漢黃芩素給藥組小鼠肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)與對(duì)照組相似。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組相比，漢黃芩素中、高劑量組TGF-β1、波形蛋白的表達(dá)均明顯減少（＜0.05、0.01），EGF、E-鈣黏蛋白的表達(dá)升高（＜0.05、0.01）。RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組相比，漢黃芩素各給藥組小鼠肺組織波形蛋白的mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.05、0.001），和E-鈣黏蛋白的mRNA表達(dá)顯著升高（＜0.05）。漢黃芩素能夠下調(diào)TGF-β1和波形蛋白的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)EGF和E-鈣黏蛋白的表達(dá)，從而達(dá)到治療肺炎支原體肺炎及肺組織纖維化的目的。

肺炎支原體；漢黃芩素；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；表皮生長(zhǎng)因子；E-鈣黏蛋白；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；波形蛋白

肺炎支原體肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）是一種常見(jiàn)的社會(huì)獲得性肺炎，其主要發(fā)病機(jī)制為肺炎支原體經(jīng)飛沫傳播，進(jìn)入呼吸道后黏附于氣道上皮細(xì)胞，導(dǎo)致上皮細(xì)胞破壞、死亡[1]，多發(fā)于學(xué)齡前和學(xué)齡期兒童，約占肺炎總數(shù)的30%，加之兒童免疫力低下可誘發(fā)混合感染，具有延綿不愈、易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[2]。MPP屬于間質(zhì)性肺炎，以肺間質(zhì)纖維素沉積為主要病理改變，有時(shí)并發(fā)支氣管肺炎，X線可出現(xiàn)兩肺中、下野彌散性網(wǎng)狀或結(jié)節(jié)狀陰影[3]。有研究表明，肺炎支原體反復(fù)感染肺部可導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維素沉積[4]，肺纖維細(xì)胞除了來(lái)源于肺內(nèi)固有的間充質(zhì)細(xì)胞外，還能由支氣管肺泡上皮細(xì)胞通過(guò)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）而來(lái)，且在炎癥反應(yīng)持續(xù)的情況下，EMT的過(guò)程也會(huì)持續(xù)存在，最終造成組織器官纖維化病變[5]。目前的臨床用藥常選用阿奇霉素等大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，但對(duì)于肺炎支原體反復(fù)發(fā)作慢性遷延導(dǎo)致纖維素沉積，其不具有預(yù)防和治療作用。且隨著抗生素的廣泛長(zhǎng)期使用，患者會(huì)產(chǎn)生耐藥性，從而對(duì)治療效果造成不良影響，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)導(dǎo)致藥物不良反應(yīng)[6]。因此開(kāi)發(fā)即殺滅肺炎支原體又預(yù)防和治療肺纖維素沉積的藥物顯得尤為重要。

芩百清肺濃縮丸（Qinbai Qingfei Concentrated Pills）是在臨床研究基礎(chǔ)上組成的具有治療肺炎支原體肺炎作用方藥[7]，Ⅲ期臨床觀察明確治療小兒支原體肺炎。漢黃芩素（wogonin）又名5,7-二羥基-8-甲氧基-2-苯基-4-1-苯并呋喃-4-酮，是中藥黃芩中的活性成分之一，也是芩百清肺濃縮丸中的主要活性成分。目前已有研究表明漢黃芩素有顯著的抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤等多種作用[8]，并且能夠明顯抑制肺組織炎癥相關(guān)因子的產(chǎn)生[9]，因此漢黃芩素很可能成為新一代治療MPP的藥物。

在EMT過(guò)程中上皮細(xì)胞喪失細(xì)胞極性，失去與基底膜的連接等上皮表型，獲得了較高的降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力等間質(zhì)表型[10]。其主要的特征有細(xì)胞黏附分子E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達(dá)減少、波形蛋白（vimentin）表達(dá)增加。且有研究表明，表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）在EMT轉(zhuǎn)變起關(guān)鍵作用[11]。TGF-β1作為最主要的一種強(qiáng)效致纖維化因子，通過(guò)激活下游多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，在肺組織中誘導(dǎo)纖維化[12]。

本研究通過(guò)驗(yàn)證漢黃芩素對(duì)TGF-β1、EGF、波形蛋白、E-鈣黏蛋白表達(dá)的影響，探討漢黃芩素治療MPP的作用機(jī)制，為芩百清肺濃縮丸的臨床使用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑及儀器

1.1.1 試劑 兔二步法檢測(cè)試劑盒（兔增強(qiáng)聚合物法檢測(cè)系統(tǒng)）購(gòu)自北京諾博萊德科技有限公司（產(chǎn)品編號(hào)PV-9001），二抗批號(hào)2214B0114；DAB試劑購(gòu)自Thermo公司（批號(hào)ZLI-9018）；Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司（批號(hào)19124-1-AP）；UltraSYBR一步法熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司（批號(hào)29520）；Biacore T200試劑盒、CM5芯片購(gòu)自GEHealthcare公司（批號(hào)10280148）；蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染液購(gòu)自南京建成公司；一抗TGF-β1（批號(hào)ab64715）、EGF（批號(hào)ab77815）、波形蛋白（批號(hào)ab45939）、E-鈣黏蛋白（批號(hào)ab76055）均購(gòu)自Abcam公司；引物合成自上海Invitrogen公司。

1.1.2 儀器 BIAcoreT200分子互作分析儀購(gòu)自美國(guó)GE公司；Reverse Transcribe PCR儀Tc-24/H（b）購(gòu)自中國(guó)博日生物公司；InfiniteM200PRO酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞士TecanKD-BM公司；Waters ACQUITYTM UPLC色譜儀，美國(guó)Waters公司；AB SCEIX Triple-TOF TM5600+高分辨質(zhì)譜，美國(guó)ABSCIEX公司；生物組織包埋機(jī)、KDTS3A自動(dòng)組織脫水機(jī)購(gòu)自浙江科迪儀器設(shè)備公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及病毒

6周齡SPF級(jí)BALB/c小鼠，雌雄各24只。體質(zhì)量20～22 g，購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（黑）2019-001，在GLP實(shí)驗(yàn)室室溫25 ℃、濕度60%條件下飼養(yǎng)。本研究中的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院保護(hù)和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)（許可證號(hào)SY3R-2020006），實(shí)驗(yàn)過(guò)程依照《黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行。肺炎支原體（ATCC 15531）購(gòu)自American Type Culture Collection。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥品

芩百清肺濃縮丸購(gòu)自天合力藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)CXZS1000045，規(guī)格為3 g/袋（相當(dāng)于生藥2.5 g）；漢黃芩素對(duì)照品由黑龍江省藥品檢驗(yàn)所提供（批號(hào)H01811804026），質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%以上；阿奇霉素分散片購(gòu)自石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司（批號(hào)274150404）。

2 方法

2.1 Biacore實(shí)驗(yàn)

2.1.1 預(yù)富集實(shí)驗(yàn)及配體耦聯(lián)實(shí)驗(yàn) 參照徐明杭等[13]的前期實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用Biacore T200測(cè)試系統(tǒng)，用化學(xué)耦聯(lián)法將TGF-β1蛋白偶聯(lián)到CM5芯片上，在最佳pH 4的條件下，配制TGF-β1蛋白溶液200 μL注入芯片表面，體積流量10 μL/min，耦聯(lián)時(shí)間600 s。

2.1.2 Biacore垂釣法釣取親和成分 稱取20 mg研磨成粉末狀的芩百清肺濃縮丸藥粉，加入1 mL超純水中充分溶解后，用0.22 μm濾膜過(guò)濾到另一EP管中備用（芩百溶液）。將配制好的芩百溶液（20 mg/mL）注入CM5芯片表面，體積流量5 μL/min，耦聯(lián)時(shí)間180 s。取2 μL樣品回收液（0.5%甲酸溶液）注入流動(dòng)池孵育20 s，使芩百溶液與TGF-β1的結(jié)合成分解離至樣品回收液中。改變傳感器表面樣品的流動(dòng)方向，使其朝相反方向流動(dòng)，將含有結(jié)合成分的回收液沉積到10 μL的碳酸氫銨溶液（50 mmol/L）中，循環(huán)次數(shù)20次。

2.2 UPLC-Q-TOF-MS鑒定有效成分

使用氮吹儀將Biacore垂釣所得樣品吹干后溶解于100 μL甲醇溶液，在4 ℃、12 000 r/min條件下離心20 min，吸取上清液上機(jī)檢測(cè)。色譜條件與質(zhì)譜條件參照徐明杭等[13]實(shí)驗(yàn)條件。

2.3 漢黃芩素與TGF-β1蛋白的結(jié)合能力測(cè)試

稱取1 mg漢黃芩素對(duì)照品，加入無(wú)核酸水配制成10 mg/mL的溶液。樣品以30 μL/min經(jīng)芯片表面，進(jìn)樣60 s，等待60 s，再生30 s。從輸出的傳感圖結(jié)果中觀察和分析響應(yīng)值（RU）。

2.4 漢黃芩素與TGF-β1的親和力分析

運(yùn)用Biacore軟件，根據(jù)漢黃芩素相對(duì)分子質(zhì)量將其分別稀釋成24.375、48.750、97.500、195.000、390.000 nmol/L的5個(gè)濃度梯度，再將不同濃度的溶液注入Biacore系統(tǒng)，注射60 s，體積流量30 μL/min，再生60 s。漢黃芩素溶液濃度97.500 nmol/L實(shí)驗(yàn)2次，總循環(huán)次數(shù)3次。最后利用軟件中的親和性分析模塊分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.5 分子對(duì)接模擬實(shí)驗(yàn)

利用軟件Tripos Sybyl-X2.1.1和Discovery Studio 2016模擬分析漢黃芩素與TGF-β1之間的相互作用模式，運(yùn)用Surflex-Dock軟件對(duì)漢黃芩素與TGF-β1蛋白進(jìn)行打分，判斷二者之間的結(jié)合活性。

2.6 體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.6.1 肺炎支原體培養(yǎng) 在無(wú)菌環(huán)境中復(fù)蘇肺炎支原體后培養(yǎng)在含胎牛血清的PPLO培養(yǎng)基中，37 ℃孵箱培養(yǎng)，每隔7 d傳代1次。

2.6.2 小鼠肺炎支原體肺炎模型的建立 將48只雌雄各半的BALB/c小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、阿奇霉素組（陽(yáng)性對(duì)照組）以及漢黃芩素高、中、低劑量組，每組8只。除對(duì)照組外，各組小鼠乙醚麻醉后鼻滴入20 μL 106CCu肺炎支原體，每天1次，持續(xù)3 d。造模完成后，根據(jù)芩百清肺濃縮丸人用劑量進(jìn)行折合計(jì)算，漢黃芩素各給藥組小鼠分別ig給予148.54、74.27、37.14 μg/(kg·d) 漢黃芩素；阿奇霉素組小鼠給予阿奇霉素32 mg/(kg·d)；對(duì)照組和模型組小鼠ig等體積的生理鹽水。連續(xù)給藥7 d后脫頸處死小鼠，剝離各組小鼠肺組織，一半置于10%甲醛溶液中，一半?80 ℃凍存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.7 免疫組化（immunohistochemistry，IHC）法檢測(cè)肺組織中TGF-β1、EGF、波形蛋白、E-鈣黏蛋白的表達(dá)水平

10%甲醛浸泡24 h后，取各組小鼠肺組織進(jìn)行包埋切片，依據(jù)兔二步法檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行免疫組化反應(yīng)。在光學(xué)顯微鏡下對(duì)比觀察各組小鼠肺組織中抗原分布，并對(duì)各組進(jìn)行IHC評(píng)分。

2.8 HE染色

取各組小鼠肺組織切片，二甲苯脫蠟后進(jìn)行HE染色，封片后置于顯微鏡下觀察各組間肺組織病理變化。

2.9 Masson染色

取各組小鼠肺組織切片，二甲苯脫蠟后依次進(jìn)行蘇木素染色、立春紅-酸性復(fù)紅染色、1%磷鉬酸染色和2%醋酸苯胺藍(lán)染色。梯度酒精脫水后二甲苯浸泡，中性樹(shù)脂封片后于顯微鏡下觀察。

2.10 RT-PCR檢測(cè)TGF-β1、EGF、波形蛋白、E-鈣黏蛋白mRNA的表達(dá)水平

取各組小鼠肺組織，根據(jù)RNA提取試劑盒提取各組小鼠肺組織總RNA，酶標(biāo)儀檢測(cè)各組RNA濃度。依照one-step reverse transcription PCR kit說(shuō)明書(shū)檢測(cè)、、波形蛋白和E-鈣黏蛋白 mRNA的表達(dá)水平。其中各引物基因序列如下：，F(xiàn)：5’-AGAAACGAGCAGAGGATTGAGC-3’，R：5’-CTGAAAGTGTGGCAGGGACAA-3’；，F(xiàn)：5’-GTCACCCACAGAAACAAT-3’，R：5’-AGGAGCGAACCTACTAAA-3’；E-鈣黏蛋白，F(xiàn)：5’- TAATTTTAGGTTAGAGGGTTATTGT-3’，R：5’-CACAACCAATCAACAACACA-3’；波形蛋白，F(xiàn)：5’-AATGGCTCGTCACCTTCG-3’，R：5’-CTAGTT- TCAACCGTCTTAATCAG-3’；β-actin，F(xiàn)：5’-CTGG- GACGACATGGAGAAAA-3’；R：5’-AAGGAAGGC-TGGAAGAGTGC-3’。

2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 UPLC-Q-TOF-MS鑒定垂釣產(chǎn)物

在前期垂釣實(shí)驗(yàn)中回收到多個(gè)提取物，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)其中1種提取物的裂解規(guī)律與漢黃芩素一致。如圖1-A、B所示，虛線部分為鏡像分割線，其上部分為樣品，下部分為漢黃芩素對(duì)照品，由圖可見(jiàn)，垂釣產(chǎn)物二級(jí)碎片均與漢黃芩素對(duì)照品一致，可以確定芩百清肺濃縮丸回收樣品中與TGF-β1蛋白結(jié)合的垂釣產(chǎn)物為漢黃芩素。見(jiàn)圖1。

3.2 漢黃芩素與TGF-β1蛋白結(jié)合結(jié)果

如圖2所示，漢黃芩素與TGF-β1存在結(jié)合解離峰，根據(jù)binding報(bào)告，二者的結(jié)合峰值為11.2 RU，而1 RU響應(yīng)值大致相當(dāng)于芯片表面結(jié)合物質(zhì)的濃度改變了1 pg/mm2，預(yù)估結(jié)果在2～10 RU為結(jié)合良好，說(shuō)明漢黃芩素與TGF-β1能夠較好地結(jié)合。

圖1 垂釣產(chǎn)物正(A)、負(fù)離子(B)模式下ESI-MS2質(zhì)譜圖

綠色線為2通道結(jié)合曲線；紅色線為1通道結(jié)合曲線；棕色線為2、1通道結(jié)合曲線

3.3 漢黃芩素與TGF-β1親和力分析結(jié)果

從圖3可以看出，信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度隨著漢黃芩素溶液濃度的增加而逐漸增大，呈濃度相關(guān)性。表明漢黃芩素在體外能夠與TGF-β1蛋白進(jìn)行特異性結(jié)合。

3.4 分子對(duì)接結(jié)果

通過(guò)蛋白晶體研究及與配體相互作用研究，發(fā)現(xiàn)TGF-β1的活性口袋位于圖4中紅色球體所示的位置，是一個(gè)由芳香族氨基酸、非極性氨基酸和極性氨基酸組成的疏水口袋；其中有多個(gè)參與小分子藥物作用的關(guān)鍵氨基酸殘基，如Ile211、Ala230、Lys232、Leu260、Tyr282等。運(yùn)用Surflex-Dock軟件對(duì)漢黃芩素與TGF-β1蛋白之間的相互作用進(jìn)行打分，判斷二者之間結(jié)合活性，所得分?jǐn)?shù)為5。利用軟件Tripos Sybyl-X2.1.1和Discovery Studio 2016分析漢黃芩素與TGF-β1之間的相互作用模式，如圖5所示。由圖可知，漢黃芩素與TGF-β1受體之間存在多種相互作用，例如與Asp351形成的1條氫鍵，以及與Ile211形成的疏水作用力，而這些構(gòu)成相互作用的氨基酸殘基均為先前分析活性位點(diǎn)時(shí)找到的關(guān)鍵氨基酸殘基；同時(shí)，漢黃芩素亦與活性口袋中其他關(guān)鍵氨基酸殘基形成了多種其他非鍵相互作用力。這說(shuō)明漢黃芩素確實(shí)可以有效地與TGF-β1受體結(jié)合。

圖3 梯度濃度的漢黃芩素與TGF-β1蛋白結(jié)合響應(yīng)值

圖4 漢黃芩素與TGF-β1模擬分子對(duì)接示意圖

3.5 IHC法檢測(cè)漢黃芩素對(duì)肺組織中TGF-β1、EGF、波形蛋白、E-鈣黏蛋白表達(dá)的影響

在200倍鏡下觀察各組小鼠肺組織的染色情況，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)不同的視野，對(duì)各組進(jìn)行IHC評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：組織切片IHC評(píng)分＝著色強(qiáng)度分×陽(yáng)性細(xì)胞著色比例分；著色強(qiáng)度分：不著色0分，弱著色1分，中等著色2分，強(qiáng)著色3分；陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分：0～5%陽(yáng)性0分，6%～25%陽(yáng)性1分，26%～50%陽(yáng)性2分，51%～74%陽(yáng)性3分，＞75%陽(yáng)性4分[14]。通過(guò)觀察，漢黃芩素中、高劑量組與模型組對(duì)比，TGF-β1、波形蛋白的表達(dá)均明顯減少（＜0.05、0.01），EGF、E-鈣黏蛋白的表達(dá)均不同程度有所升高（＜0.05、0.01），表現(xiàn)為褐色著色點(diǎn)加深。見(jiàn)圖6、7。

圖5 漢黃芩素與TGF-β1相互作用二維圖（軟件：Discovery Studio 2016）

3.6 HE染色

200倍顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖8所示，對(duì)照組小鼠肺組織形態(tài)正常，肺泡細(xì)胞排列緊密。模型組小鼠肺組織中肺泡壁有明顯增厚，且有大面積充血，肺泡腔多處塌陷。漢黃芩素各給藥組對(duì)比模型組，有少量肺泡壁充血和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，與對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照阿奇霉素組的肺組織相似，且漢黃芩素高劑量組的治療效果最好。

圖6 漢黃芩素對(duì)肺組織TGF-β1、EGF、波形蛋白、E-鈣黏蛋白表達(dá)的影響(×20)

與對(duì)照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

圖8 各組小鼠肺組織HE染色(×200)

3.7 Masson染色

將染色切片置于顯微鏡200倍鏡下觀察，結(jié)果如圖9所示，對(duì)照組小鼠肺組織切片組織排列緊密規(guī)則，在血管周?chē)嬖跇O少量纖維沉積。模型組小鼠肺組織形態(tài)紊亂，且有大量膠原纖維（呈藍(lán)色）分布，肺泡腔塌陷，肺泡壁周?chē)写罅垦仔约?xì)胞聚集。與模型組相比，漢黃芩素各給藥組藍(lán)色面積都有顯著減少，其組織形態(tài)與對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照阿奇霉素組的肺組織相似，且治療效果隨漢黃芩素劑量的降低而減弱。

3.8 RT-PCR檢測(cè)漢黃芩素對(duì)TGF-β1、EGF、波形蛋白、E-鈣黏蛋白mRNA表達(dá)的影響

漢黃芩素對(duì)、、波形蛋白、E-鈣黏蛋白mRNA表達(dá)的影響如圖10所示。與模型組相比，漢黃芩素各劑量組的和波形蛋白mRNA表達(dá)明顯降低，與E-鈣黏蛋白的mRNA表達(dá)均有不同程度升高（＜0.05、0.01、0.001）。

圖9 各組小鼠肺組織Masson染色(×200)

與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

4 討論

芩百清肺濃縮丸最早由黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院研發(fā)，在臨床上多用于止咳化痰平喘。目前已有的研究證實(shí)芩百清肺濃縮丸可抑制肺泡上皮細(xì)胞分化，促進(jìn)肺組織修復(fù)[15]，能降低MPP的纖維化因子表達(dá)，起到抗纖維素沉積的作用[16]。但對(duì)于其中的活性成分漢黃芩素的作用機(jī)制目前仍不明確。

肺炎支原體侵染肺組織致使的肺纖維化主要作用機(jī)制包括炎癥反應(yīng)、EMT等[17]。目前已有研究證實(shí)TGF-β1為EMT的主要誘導(dǎo)劑[18]，主要負(fù)責(zé)肺成纖維細(xì)胞的增殖和膠原的合成[19]。

本研究通過(guò)前期體外分子對(duì)接模擬漢黃芩素與TGF-β1的結(jié)合，以及后續(xù)的體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討漢黃芩素干預(yù)后小鼠肺組織中間質(zhì)形成相關(guān)因子表達(dá)水平的變化，以此確定MPP所致EMT的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，未施加漢黃芩素干預(yù)的模型組小鼠肺組織中有大量的TGF-β1和波形蛋白蛋白的表達(dá)，且通過(guò)切片觀察到肺各組織中發(fā)生了不同程度的病變，表現(xiàn)為肺泡壁塌陷，炎性細(xì)胞增多，肺泡周?chē)霈F(xiàn)大量膠原纖維沉積，這也進(jìn)一步證實(shí)在肺炎支原體侵染肺部組織時(shí)，存在TGF-β1誘導(dǎo)EMT的過(guò)程。而通過(guò)漢黃芩素治療后的MPP小鼠肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)治愈情況良好，肺組織中的膠原纖維和炎性細(xì)胞也有所減少，TGF-β1和波形蛋白的表達(dá)顯著減少。該結(jié)果表明漢黃芩素抑制小鼠肺部炎癥反應(yīng)和肺纖維化的形成可能是通過(guò)降低肺組織中TGF-β1的表達(dá)，以此來(lái)抑制EMT過(guò)程。而EGF對(duì)于細(xì)胞的增殖、分裂有著重要的作用，能夠促進(jìn)組織損傷部分的修復(fù)愈合[20]。伴隨著TGF-β1表達(dá)的降低，漢黃芩素各給藥組的mRNA表達(dá)量都有所升高，上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白的表達(dá)也與TGF-β1呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的趨勢(shì)。

綜上所述，漢黃芩素能夠起到治療MPP以及肺纖維化疾病的效果，其作用機(jī)制可能是一方面通過(guò)降低TGF-β1和波形蛋白的表達(dá)，抑制EMT過(guò)程的發(fā)生；另一方面提高EGF和E-鈣黏蛋白的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。且對(duì)比漢黃芩素各給藥劑量組之間的差異可以看出，高劑量的漢黃芩素治療效果最為突出。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of wogonin on expression of lung epithelial-mesenchymal formation factor in lung tissue of mycoplasma pneumoniae pneumonia mice

WANG Si-chu, SUN Yi, WANG Xiao-xi, WANG Xin, MENG Yan-li, WANG Wei-ming

Heilongjiang Academy of Chinese Medicine Sciences, Harbin 150036, China

To investigate the mechanism of wogonin in the treatment of mycoplasma pneumoniae pneumonia by regulating the expression of epithelial-mesenchymal formation factor.UPLC-Q-TOF-MS was used to detect the active ingredient wogonin in Qinbai Qingfei Concentrated Pills (芩百清肺濃縮丸), and it was bound to transforming growth factor-β1 (TGF-β1) by Biacore fishing technique, and the specificity of binding was verified by kinetic analysis. Tripos SYbyl-X2.1.1 and Discovery Studio2016 software was used to perform molecular docking between wogonin and TGF-β1, and the binding mode between drug molecules and receptor proteins was visualized. The lung pathological tissue sections of mice were prepared by animal experiments. Hematoxylin-eosin (HS) staining and Masson staining were performed to observe the pathological structure and morphology of the staining. The effects of wogonin on mRNA and protein expression levels of TGF-β1, epidermal growth factor (EGF), vimentin, E-cadherin in mouse lung tissue by real-time (RT) -PCR and immunohistochemistry method.The samples obtained from Biacore fishing were identified and analyzed as wogonin by UPLC-Q-TOF-MS. There was strong specific binding between wogonin and TGF-β1. The results of HE staining and Masson staining showed that the morphological structure of lung tissue in the wogonin group was similar to that of the control group. Immunohistochemical test results showed that compared with model group, the expression levels of TGF-β1 and vimentin in medium and high dose wogonin groups were significantly decreased (< 0.05, 0.01), and the expressions of EGF and E-cadherin were increased (< 0.05, 0.01). The results of RT-PCR showed that compared with the model group, the mRNA expression levels ofandin lung tissue of mice in wogonin administration groups was significantly decreased (< 0.05, 0.001), while the mRNA expression levels ofandwas significantly increased (< 0.05).Wogonin can down-regulate the expression of TGF-β1 and vimentin, and up-regulate the expression of EGF and E-cadherin, so as to achieve the purpose of treating mycoplasma pneumoniae pneumonia and lung tissue fibrosis.

mycoplasma pneumoniae; wogonin; epithelial-mesenchymal transitions; epidermal growth factor; E-cadherin; transforming growth factor-β1; vimentin

R285

A

0253 - 2670(2023)01 - 0172 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.01.020

2022-08-21

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（82174060）；黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LH2021H074）；黑龍江省衛(wèi)生健康委科研課題（20210202040011）

王斯楚（1998—），女，碩士研究生，主要從事中藥學(xué)研究。E-mail: 840074577@qq.com。

通信作者：蒙艷麗（1976—），女，碩士生導(dǎo)師，研究員，主要從事新藥研發(fā)。E-mail: mengyanli2000@163.com

王偉明（1966—），女，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幮庐a(chǎn)品研發(fā)、藥食同源中藥發(fā)酵。E-mail: wangweiming475@yahoo.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]