復(fù)方丹參滴丸調(diào)控LOX-NF-κB炎癥途徑治療心肌缺血的機(jī)制研究

曹博雅，陳家黎，石曉溪，李東岳，盧令慧，高 闊，王 偉，曹俊嶺, 5，張 建

復(fù)方丹參滴丸調(diào)控LOX-NF-κB炎癥途徑治療心肌缺血的機(jī)制研究

曹博雅1，陳家黎2，石曉溪3，李東岳2，盧令慧2，高 闊2，王 偉4，曹俊嶺1, 5*，張 建6*

1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029 3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029 4. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510700 5. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100029 6. 北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100029

基于動(dòng)物心肌缺血模型及體外心肌細(xì)胞損傷模型探究復(fù)方丹參滴丸調(diào)控脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）-核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）途徑抑制炎癥反應(yīng)治療心肌缺血的作用機(jī)制。采用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎術(shù)制備大鼠心肌缺血模型，心電圖檢測(cè)心肌缺血情況；Western blotting檢測(cè)心肌組織LOX途徑關(guān)鍵酶LOX5、LOX12、LOX15及下游分子p-NF-κB p65和白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的蛋白表達(dá)。體外培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，采用缺氧缺糖6 h誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷模型，熒光倒置顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)；MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力；Western blotting檢測(cè)LOX-NF-κB途徑相關(guān)蛋白表達(dá)。復(fù)方丹參滴丸顯著抑制心肌缺血大鼠心肌組織中LOX5、LOX12、LOX15和IL-1β的蛋白表達(dá)及NF-κB p65的磷酸化水平（＜0.01、0.001）。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示復(fù)方丹參滴丸明顯改善H9c2心肌細(xì)胞缺氧缺糖損傷，顯著提高心肌細(xì)胞存活率（＜0.01、0.001），降低LOX5、LOX12、LOX15和IL-1β的蛋白表達(dá)及NF-κB p65的磷酸化水平（＜0.05、0.01、0.001）。復(fù)方丹參滴丸可通過(guò)抑制LOX-NF-κB炎癥途徑減輕心肌缺血損傷。

復(fù)方丹參滴丸；心肌缺血；炎癥；脂氧合酶；核因子-κB

心肌缺血性損傷是全球心血管疾病死亡的十大主要原因之一，是危害人類(lèi)健康的最常見(jiàn)、最嚴(yán)重的疾病之一[1]。心肌缺血是指心臟血液灌注減少，心臟供氧量降低，心肌能量代謝異常，從而不能維持心臟正常功能的病理狀態(tài)[1-2]。心肌缺血會(huì)引發(fā)心臟病理性炎癥，持續(xù)失調(diào)的炎癥反應(yīng)會(huì)加重心肌組織損傷，導(dǎo)致心肌缺血最終發(fā)展為心衰[3-4]。研究表明，脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）途徑介導(dǎo)的花生四烯酸代謝及其代謝產(chǎn)物引發(fā)的炎癥反應(yīng)與心肌缺血密切相關(guān)[5-8]。LOX是參與花生四烯酸代謝的關(guān)鍵酶之一，在刺激炎癥反應(yīng)中起重要作用[9]。經(jīng)LOX代謝途徑產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物白三烯（leukotrienes，LTs）是炎癥反應(yīng)中的炎性介質(zhì)之一，具有增加血管通透性、引起血漿滲出和白細(xì)胞趨化等功能[10]，這些產(chǎn)物還會(huì)觸發(fā)炎癥信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)如核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的激活[11-12]，NF-κB在機(jī)體的免疫反應(yīng)、炎癥過(guò)程中參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、增殖及應(yīng)激反應(yīng)，是細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵信號(hào)通路之一[13-16]，且NF-κB信號(hào)通路對(duì)于誘導(dǎo)各種炎癥相關(guān)細(xì)胞因子和介質(zhì)至關(guān)重要，包括白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等[17-18]。研究表明，抑制炎癥反應(yīng)及減少炎癥因子釋放可治療心肌缺血[19-22]。因此，抑制炎癥反應(yīng)可以是減輕心肌缺血損傷的有效策略之一。

復(fù)方丹參滴丸由丹參、三七和冰片3味中藥組成，具有活血化瘀、理氣止痛的功效，主治氣滯血瘀所致的胸痛，是中醫(yī)治療冠心病、心絞痛等心臟疾病的常用藥。大量研究表明，復(fù)方丹參滴丸具有抗炎[23]、促進(jìn)冠脈微循環(huán)[24]、抑制血小板活化和聚集[25-26]、改善心肌能量代謝[27-28]等多種藥理活性，但其通過(guò)抗炎而抑制心肌缺血損傷的機(jī)制尚不完全清楚。基于LOX-NF-κB炎癥途徑在介導(dǎo)心肌缺血損傷中的重要作用，本研究探究了復(fù)方丹參滴丸通過(guò)抗炎而治療心肌缺血的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞

48只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量220～240 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)SCXK（京）-2016-0006。動(dòng)物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房，溫度（23±2）℃，濕度（40±5）%，12 h光照和黑暗循環(huán)，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)BUCM-4-2021100904-4166）。

H9c2大鼠心肌細(xì)胞購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方丹參滴丸（批號(hào)Z10950111）購(gòu)自天津天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司；卡維地洛（批號(hào)0K0254D26）購(gòu)自齊魯制藥有限公司；戊巴比妥鈉購(gòu)自德國(guó)Merck公司；Zileuton（批號(hào)15663）購(gòu)自美國(guó)MCE公司；PD146176（批號(hào)4079269）、黃芩素（批號(hào)MKCL8512）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清（批號(hào)2059461RP）、DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)8121011）、青霉素/鏈霉素雙抗（批號(hào)2240831）、0.25%胰酶（批號(hào)2188970）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Earle’s平衡鹽溶液（批號(hào)H23N11B131963）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；MTT（批號(hào)20200606）購(gòu)自北京百瑞極生物科技有限公司；2.5 L厭氧產(chǎn)氣袋（批號(hào)0176LJ-4）和2.5 L密封厭氧罐（批號(hào)C-31）購(gòu)自日本三菱公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)2021J1DP1511）、蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（批號(hào)02511800）、ECL超敏發(fā)光液（批號(hào)2021F0CP1050）購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；LOX5抗體（批號(hào)ab169755）、LOX15抗體（批號(hào)ab244205）、磷酸化NF-κB p65（S536）抗體（批號(hào)ab76302）、IL-1β抗體（批號(hào)ab254360）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；NF-κB p65抗體（批號(hào)80979-1-RR）購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；LOX12抗體（批號(hào)PA578760）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號(hào)AB0037）購(gòu)自上海泊灣生物科技有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG多克隆抗體（批號(hào)C1309）購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

1.3 儀器

MCO-18AIC型CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）；Epoch酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）；ECLIPSE TE2000-S型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；Mini-PROTEAN Tetra電泳及電轉(zhuǎn)設(shè)備、ChemiDocTMMP凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

2.1.1 分組、造模與給藥 48只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、復(fù)方丹參滴丸（170 mg/kg，臨床等效劑量）組和卡維地洛（25 mg/kg，臨床等效劑量）組，每組12只。大鼠ip 1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉后，仰臥位固定，手術(shù)區(qū)備皮，用碘伏消毒，進(jìn)行氣管插管，連接呼吸機(jī)，呼吸機(jī)參數(shù)：潮氣量6 mL，呼吸頻率80次/min，呼吸比1∶2。于3、4肋間逐層開(kāi)胸暴露心臟，破心包膜，取5/0手術(shù)縫合線于左心耳下2 mm處結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，在心臟表面滴1滴利多卡因，清除胸腔血污，用2/0縫合線逐層關(guān)胸，脫離呼吸機(jī)。大鼠ip利多卡因0.2 mL、呋塞米0.2 mL、青霉素鈉（4×105U/kg）。待手術(shù)后的大鼠恢復(fù)自主呼吸后置于電熱毯上至蘇醒。假手術(shù)組對(duì)冠狀動(dòng)脈左前降支只穿線不結(jié)扎，其他步驟相同。

術(shù)后對(duì)大鼠行心電圖檢測(cè)，將麻醉后的大鼠仰臥位固定，參照人十二導(dǎo)聯(lián)心電圖連接電極，設(shè)定走紙速度25 min/s，出現(xiàn)6～8個(gè)導(dǎo)聯(lián)病理性Q波為造模成功，剔除未成模的動(dòng)物。術(shù)后24 h各給藥組開(kāi)始ig藥物，假手術(shù)和模型組ig等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)14 d，保持每天給藥時(shí)間一致。

2.1.2 大鼠心電監(jiān)測(cè)、心臟取材及心臟損傷觀察 在給藥的第5天對(duì)大鼠行心電圖檢測(cè)，觀察藥物是否在缺血的急性期就已發(fā)揮心肌保護(hù)作用。在缺血恢復(fù)期給藥后的第14天進(jìn)行心臟組織取材，手術(shù)剪開(kāi)胸，取出全心，置于預(yù)冷生理鹽水中泵凈心臟中殘留的血液，冰上剔凈心耳和其他殘余組織，各組典型心臟形態(tài)拍照記錄。切取梗死邊緣區(qū)組織，液氮速凍保存，留作Western blotting檢測(cè)。假手術(shù)組心臟在與模型組相同位置做相同處理。

2.1.3 Western blotting檢測(cè)大鼠心肌組織相關(guān)蛋白表達(dá) 使用RIPA裂解液（100 g/L）和手持勻漿器將心肌組織破碎成組織勻漿液，于4 ℃、12 000×離心10 min，取上清。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，完成定量后100 ℃煮沸變性10 min，冷卻后儲(chǔ)存于?20 ℃冰箱。樣品經(jīng)SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜，封閉后，分別孵育相應(yīng)的一抗和二抗后曝光并顯影，采用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

2.2 體外實(shí)驗(yàn)

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) H9c2細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在細(xì)胞融合度為90%時(shí)傳代。

2.2.2 氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）模型的建立 H9c2細(xì)胞培養(yǎng)到實(shí)驗(yàn)所需的密度，棄去原有培養(yǎng)液，PBS清洗2次，加入Earle’s無(wú)糖平衡鹽溶液，放入缺氧小室內(nèi)，并放入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋，蓋緊缺氧小室的盒蓋，放入培養(yǎng)箱進(jìn)行缺氧缺糖造模，時(shí)間分別為0、4、6、8 h，然后從缺氧小室中取出，選取當(dāng)細(xì)胞活力為50%左右的造模時(shí)間進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.3 細(xì)胞分組與給藥

（1）復(fù)方丹參滴丸的無(wú)細(xì)胞毒性濃度和保護(hù)作用濃度測(cè)定：復(fù)方丹參滴丸無(wú)細(xì)胞毒性濃度測(cè)定實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組和不同質(zhì)量濃度（2000、1000、500、250、125 μg/mL）的復(fù)方丹參滴丸組。復(fù)方丹參滴丸保護(hù)作用濃度篩選實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組、模型組（按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理）和不同質(zhì)量濃度（500、250、125 μg/mL）的復(fù)方丹參滴丸組（在缺氧缺糖時(shí)分別加入含不同濃度復(fù)方丹參滴丸的Earle’s平衡鹽溶液）。

（2）復(fù)方丹參滴丸調(diào)控LOX-NF-κB炎癥途徑的機(jī)制研究：設(shè)置對(duì)照組、模型組、復(fù)方丹參滴丸（500 μg/mL）組、LOX5抑制劑Zileuton（50 μmol/L）組、LOX12抑制劑黃芩素（1 μmol/L）組和LOX15抑制劑PD146176（1 μmol/L）組。各給藥組均在造模的同時(shí)給藥。

2.2.4 MTT測(cè)定細(xì)胞活力 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H9c2細(xì)胞，經(jīng)計(jì)數(shù)后稀釋為1×105個(gè)/mL，每孔100 μL接種到96孔板上，培養(yǎng)24 h，細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%時(shí)按“2.2.3（1）”項(xiàng)下進(jìn)行分組給藥，處理24 h，倒扣法倒出原有培養(yǎng)基，每孔加100 μL PBS洗滌2遍后，每孔加入100 μL以PBS配制的0.5 g/mL的MTT，放于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，棄去MTT溶液，每孔加150 μL DMSO溶解結(jié)晶，置于微量振蕩器待結(jié)晶完全溶解后，于酶標(biāo)儀570 nm處檢測(cè)吸光度（）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝實(shí)驗(yàn)/對(duì)照

2.2.5 熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H9c2細(xì)胞，經(jīng)計(jì)數(shù)后稀釋至2.5×105個(gè)/mL，接種于6孔板中，每孔1 mL，培養(yǎng)24 h后按“2.2.3（2）”項(xiàng)下進(jìn)行分組給藥，分別于給藥前、缺氧缺糖6 h時(shí)，于熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并拍照記錄。

2.2.6 Western blotting檢測(cè)H9c2細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H9c2細(xì)胞，經(jīng)計(jì)數(shù)后稀釋至2.5×105個(gè)/mL，接種于6孔板中，每孔1 mL，培養(yǎng)24 h后按“2.2.3（2）”項(xiàng)下進(jìn)行分組給藥，缺氧缺糖6 h后，棄上清，用預(yù)冷的PBS清洗2遍后，每孔加入100 μL預(yù)冷的RIPA裂解液裂解30 min，期間反復(fù)吹打細(xì)胞使其充分裂解，全程冰上操作。收集裂解液，4 ℃、20 000×離心20 min后收集上清。按“2.1.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行蛋白定量、樣品制備、Western blotting檢測(cè)以及灰度分析。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠心電圖及心臟形態(tài)比較

術(shù)后5 d心電圖（圖1）結(jié)果顯示，假手術(shù)組P波規(guī)律出現(xiàn)，P-R間期及R-R間期大致相同，QRS波波形規(guī)律，無(wú)寬大畸形，S-T段未見(jiàn)明顯壓低及抬高。模型組ST段明顯抬高，呈“弓背向上”型，為心肌梗死特異性指標(biāo)，且QRS波抬高、增寬。復(fù)方丹參滴丸組提示竇性心率，P波規(guī)律出現(xiàn)，P-R間期及R-R間期大致相同，QRS波波形規(guī)律，無(wú)寬大畸形，與模型組比較，S-T段抬高緩解。卡維地洛組心電圖提示竇性心率，P波規(guī)律出現(xiàn)，P-R間期及R-R間期大致相同，QRS波波形規(guī)律，無(wú)寬大畸形，與模型組比較，S-T段抬高緩解。提示復(fù)方丹參滴丸在缺血的急性期已開(kāi)始具有很好的心肌保護(hù)作用。術(shù)后14 d恢復(fù)期各組大鼠心臟取材后通過(guò)對(duì)損傷情況進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)復(fù)方丹參滴丸組和卡維地洛組大鼠心肌缺血損傷區(qū)域小于模型組，提示給藥組可在一定程度上減輕心肌缺血損傷。

圖1 各組大鼠心電圖及心臟形態(tài)

3.2 復(fù)方丹參滴丸對(duì)心肌缺血大鼠心肌組織相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖2所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中LOX途徑關(guān)鍵酶LOX5、LOX12和LOX15的蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01、0.001），提示LOX途徑激活，炎癥反應(yīng)增強(qiáng)；與模型組比較，復(fù)方丹參滴丸顯著降低LOX5、LOX12、LOX15和IL-1β的蛋白表達(dá)及NF-κB p65的磷酸化水平（＜0.01、0.001），表明復(fù)方丹參滴丸通過(guò)抑制LOX途徑關(guān)鍵酶的蛋白表達(dá)繼而降低NF-κB p65的磷酸化水平和IL-1β的表達(dá)，從而抑制心肌組織炎癥反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮抗心肌缺血作用。

3.3 H9c2細(xì)胞OGD模型的建立

為建立適宜的模型進(jìn)行機(jī)制驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，對(duì)細(xì)胞的缺氧缺糖時(shí)間進(jìn)行考察。將H9c2細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，分別缺氧缺糖培養(yǎng)4、6、8 h，觀察造模效果，如圖3所示，當(dāng)缺氧缺糖6 h時(shí)，細(xì)胞活力在50%左右，此時(shí)觀察藥物的保護(hù)作用較為合適，故將其作為模型的缺氧缺糖時(shí)間。

3.4 復(fù)方丹參滴丸對(duì)正常H9c2細(xì)胞活力的影響

當(dāng)藥物濃度過(guò)高時(shí)，會(huì)具有細(xì)胞毒性。為了探討復(fù)方丹參滴丸的藥理作用，首先篩選了復(fù)方丹參滴丸的無(wú)細(xì)胞毒性濃度。如圖4所示，與對(duì)照組比較，復(fù)方丹參滴丸質(zhì)量濃度為2000 μg/mL時(shí)對(duì)H9c2細(xì)胞活力表現(xiàn)出明顯抑制作用（＜0.05），因此選擇125、250、500、1000 μg/mL 4個(gè)質(zhì)量濃度考察復(fù)方丹參滴丸對(duì)H9c2細(xì)胞OGD模型的保護(hù)作用。

與假手術(shù)組比較：##P＜0.01 ###P＜0.001；與模型組比較：**P＜0.01 ***P＜0.001

與缺氧缺糖0 h比較：***P＜0.001

與對(duì)照組比較：*P＜0.05

3.5 復(fù)方丹參滴丸對(duì)OGD誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞活力的影響

如圖5所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞活力顯著降低（＜0.001）；與模型組比較，復(fù)方丹參滴丸在500、1000 μg/mL時(shí)均對(duì)心肌細(xì)胞活力表現(xiàn)顯著保護(hù)作用（＜0.01、0.001），其中復(fù)方丹參滴丸在500 μg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞活力的影響最大，因此選擇500 μg/mL的復(fù)方丹參滴丸作為后續(xù)探究其機(jī)制的質(zhì)量濃度。

與對(duì)照組比較：###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，圖7同

3.6 復(fù)方丹參滴丸保護(hù)OGD模型各時(shí)段H9c2細(xì)胞形態(tài)

在熒光倒置顯微鏡下觀察OGD模型各時(shí)段H9c2細(xì)胞形態(tài)，如圖6所示，給藥前，各組細(xì)胞貼壁狀態(tài)良好，大部分呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞邊緣結(jié)構(gòu)清晰，胞質(zhì)透亮。對(duì)照組細(xì)胞在各時(shí)段細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，增長(zhǎng)速度正常。模型組細(xì)胞在缺氧缺糖6 h后貼壁不牢，細(xì)胞皺縮，形態(tài)變得不規(guī)則，漂浮細(xì)胞增多，細(xì)胞數(shù)量顯著減少。復(fù)方丹參滴丸組細(xì)胞貼壁數(shù)量增加，細(xì)胞皺縮變形的現(xiàn)象得到改善。

圖6 復(fù)方丹參滴丸對(duì)H9c2心肌細(xì)胞形態(tài)的保護(hù)作用 (×100)

3.7 復(fù)方丹參滴丸對(duì)OGD誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖7所示，與對(duì)照組比較，模型組LOX途徑關(guān)鍵酶LOX5、LOX12和LOX15的蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.001），提示LOX途徑激活，炎癥反應(yīng)增強(qiáng)；與模型組比較，復(fù)方丹參滴丸組LOX5、LOX12、LOX15和IL-1β蛋白表達(dá)及NF-κB p65的磷酸化水平均顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），與LOX5抑制劑Zileuton、LOX12抑制劑黃芩素、LOX15抑制劑PD146176作用相似（＜0.01、0.001）。表明復(fù)方丹參滴丸通過(guò)抑制LOX途徑的激活繼而降低NF-κB p65磷酸化水平和IL-1β表達(dá)，從而抑制心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減少細(xì)胞丟失，發(fā)揮對(duì)OGD心肌細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用

圖7 復(fù)方丹參滴丸對(duì)OGD誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞LOX-NF-κB途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

4 討論

心肌缺血損傷會(huì)引起心肌細(xì)胞強(qiáng)烈的炎癥風(fēng)暴、凋亡、氧化應(yīng)激等病理過(guò)程，最終導(dǎo)致心力衰竭。LOX途徑關(guān)鍵酶對(duì)心肌缺血時(shí)炎癥反應(yīng)的調(diào)控具有重要作用[29-30]。研究表明，LOX15在冠心病患者心肌組織中的表達(dá)顯著增加[31]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠心肌缺血再灌注模型中LOX5蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)，該信號(hào)通路被顯著激活[32]，且LOX5抑制劑可通過(guò)減少NF-κB表達(dá)、抑制心肌細(xì)胞炎癥和凋亡從而減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷[33]。心肌缺血導(dǎo)致細(xì)胞中的LOX途徑被激活，該途徑產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物如羥基二十碳四烯酸、白三烯等表現(xiàn)出多種生物活性，如增加血管通透性、促進(jìn)血漿滲出以及使白細(xì)胞遷移到炎癥區(qū)域等[33-34]，這些代謝產(chǎn)物促進(jìn)了炎癥的發(fā)生發(fā)展[35]，如白三烯可促進(jìn)NF-κB的激活，而NF-κB是誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，激活的NF-κB會(huì)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)增強(qiáng)并促進(jìn)炎癥因子釋放，因此，抑制LOX-NF-κB炎癥途徑的激活，對(duì)于減輕心肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、改善心肌缺血損傷具有重要意義。

本研究首先采用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎術(shù)構(gòu)建了大鼠心肌缺血模型，在給藥的第5天對(duì)大鼠行心電圖檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)復(fù)方丹參滴丸在缺血的急性期已開(kāi)始具有很好的心肌保護(hù)作用。在缺血恢復(fù)期給藥后的第14天進(jìn)行心臟取材，通過(guò)心臟組織損傷情況比較，發(fā)現(xiàn)復(fù)方丹參滴丸可在一定程度上減輕心肌缺血損傷。繼而，對(duì)心肌組織LOX5、LOX12、LOX15和IL-1β的蛋白表達(dá)及NF-κB p65的磷酸化水平進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果顯示模型組大鼠心肌組織中上述蛋白表達(dá)水平均顯著升高，表明LOX-NF-κB介導(dǎo)的炎癥途徑在大鼠心肌缺血模型中被高度激活。復(fù)方丹參滴丸干預(yù)后可顯著降低上述蛋白的表達(dá)水平，減小大鼠心肌組織梗死面積，減輕心臟炎癥反應(yīng)，改善心肌缺血現(xiàn)象。隨后構(gòu)建H9c2心肌細(xì)胞氧糖剝奪模型，體外模擬心肌缺血的病理狀態(tài)，從LOX-NF-κB炎癥途徑探究復(fù)方丹參滴丸抗心肌缺血損傷的具體分子機(jī)制，結(jié)果同樣顯示，復(fù)方丹參滴丸給藥后LOX途徑關(guān)鍵酶LOX5、LOX12、LOX15表達(dá)水平顯著降低，其下游蛋白NF-κB p65的磷酸化水平和IL-1β的表達(dá)水平也顯著降低。由此表明復(fù)方丹參滴丸可通過(guò)抑制LOX途徑3個(gè)關(guān)鍵酶的表達(dá)水平，繼而降低了NF-κB p65的磷酸化水平，抑制炎癥因子IL-1β的釋放（圖8），從而減輕炎癥反應(yīng)和心肌細(xì)胞損傷，明顯改善OGD損傷后心肌細(xì)胞的形態(tài)，顯著緩解心肌細(xì)胞OGD損傷。

圖8 復(fù)方丹參滴丸對(duì)心肌缺血時(shí)LOX-NF-κB炎癥途徑及其下游分子的抑制作用

復(fù)方丹參滴丸是利用現(xiàn)代制劑工藝研制的一種中藥滴丸復(fù)方制劑，具有多效應(yīng)成分溶解快、易吸收、純度高且便于服用等優(yōu)點(diǎn)，在心肌缺血等心血管疾病的治療中也發(fā)揮了重要作用[36-38]。丹參酮IIA作為丹參的有效成分，可減少脂多糖刺激的RAW264.7巨噬細(xì)胞中促炎介質(zhì)的產(chǎn)生，其機(jī)制可能為通過(guò)抑制RAW264.7細(xì)胞中的NF-κB活化以發(fā)揮抗炎活性[39]；另有研究表明，三七的主要化學(xué)成分人參皂苷Rg1能下調(diào)脂多糖誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，減少Toll樣受體4和NF-κB的表達(dá)，減輕脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡[40]。更多復(fù)方丹參滴丸抑制炎癥反應(yīng)減輕心肌缺血的效應(yīng)成分需要被進(jìn)一步揭示，在動(dòng)物整體水平以及細(xì)胞分子水平上進(jìn)行確切驗(yàn)證。

本研究基于體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了復(fù)方丹參滴丸具有類(lèi)似LOX抑制劑的作用，通過(guò)抑制LOX途徑關(guān)鍵酶的激活，從而調(diào)節(jié)LOX-NF-κB炎癥途徑緩解心肌缺血損傷。為復(fù)方丹參滴丸靶向調(diào)控心肌缺血的分子機(jī)制闡明提供了科學(xué)依據(jù)，提示抑制炎癥因子釋放可能是預(yù)防和治療心血管疾病的潛在策略，同時(shí)為心肌缺血引發(fā)的心血管疾病的防治提供干預(yù)機(jī)制和治療思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of Compound Danshen Dripping Pills against myocardial ischemia based on LOX-NF-κB pathway

CAO Bo-ya1, CHEN Jia-li2, SHI Xiao-xi3, LI Dong-yue2, LU Ling-hui2, GAO Kuo2, WANG Wei4, CAO Jun-ling1, 5, ZHANG Jian6

1. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 2. School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 3. Third Affiliated Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 4. School of Basic Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510700, China 5. Dongfang Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 6. School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China

To explore the mechanism of Compound Danshen Dripping Pills (復(fù)方丹參滴丸) on treatment of myocardial ischemia by regulating lipoxygenase (LOX)-nuclear factor-κB (NF-κB) pathway to inhibit inflammatory response based on animal models of myocardial ischemia andmyocardial cell injury model.The rat model of myocardial ischemia was established by ligation of left anterior descending coronary artery, with myocardial ischemia detected by ECG; Protein expressions of LOX5, LOX12, LOX15, p-NF-κB p65 and interleukin-1β (IL-1β) were detected by Western blotting. H9c2 cardiomyocytes were cultured, and the model of myocardial cell injury was induced by deprivation of oxygen-glucose (OGD) for 6 h, morphology of myocardial cells was observed under fluorescence inverted microscope; Cell viability was detected by MTT; Western blotting was used to detect LOX-NF-κB pathway related protein expressions.Compound Danshen Dripping Pills significantly inhibited the protein expression levels of LOX5, LOX12, LOX15, p-NF-κB p65 and IL-1β in myocardial tissues of rats with ischemia (< 0.01, 0.001). Thecell experiments indicated that Compound Danshen Dripping Pills could dramatically improve the OGD injury of H9c2 myocardial cells, significantly increase the survival rate of myocardial cells (< 0.01, 0.001), and reduce LOX5, LOX12, LOX15 and IL-1β protein expressions and NF-κB p65 phosphorylation level (< 0.05, 0.01, 0.001).Compound Danshen Dripping Pills can alleviate myocardial ischemia injury by inhibiting LOX-NF-κB inflammatory pathway.

Compound Danshen Dripping Pills; myocardial ischemia; inflammation; lipoxygenase; nuclear factor-κB

R285.5

A

0253 - 2670(2023)01- 0151 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.01.018

2022-09-20

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82004095）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81903950）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81904169）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)（2021-JYB-XJSJJ031，2019-JYB-JS-095，2022-JYB-XJSJJ008）

曹博雅，碩士研究生，研究方向?yàn)樾难芩幚韺W(xué)。E-mail: bucmcby@163.com

通信作者：張 建，講師，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥防治心血管疾病的基礎(chǔ)研究。E-mail: zhangjian3428@126.com

曹俊嶺，主任藥師，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樗幚韺W(xué)、醫(yī)院藥學(xué)。E-mail: caojunling72@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]