點(diǎn)籃子魚形態(tài)特征及6種組織乳酸脫氫酶的電泳分析

張濤，周劍光，甘金華，何力

(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(武漢)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水魚類種質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223)

點(diǎn)籃子魚(Siganusguttatus)隸屬鱸形目(Perciformes)、籃子魚科(Siganidae)、籃子魚屬(Siganus)，主要分布在熱帶、亞熱帶的印度-太平洋及南海海域，從珊瑚礁到河口水域均有分布[1]。由于點(diǎn)籃子魚體色艷麗、無肌間刺、營養(yǎng)價值高而備受人們青睞，是一種兼具觀賞價值和較高經(jīng)濟(jì)價值的魚類。同時點(diǎn)籃子魚廣鹽、食性雜偏植食性、餌料成本低、生態(tài)幅度寬，使其成為一種優(yōu)良的養(yǎng)殖品種引起人們的關(guān)注。目前在中國的海南、廣東、江蘇、浙江、山東、遼寧等地區(qū)均有養(yǎng)殖，已形成“南北共養(yǎng)”的局面[2-3]。另一方面，點(diǎn)籃子魚喜食滸苔等藻類，與其他名貴養(yǎng)殖品種如刺參(Stichopusjaponicus)套養(yǎng)或混養(yǎng)，可有效控制養(yǎng)殖池中滸苔等藻類的過度生長，減少水質(zhì)破壞，既有利于主養(yǎng)品種的生長，又有利于點(diǎn)籃子魚的生長，屬環(huán)境友好型魚類[4]。目前有關(guān)點(diǎn)籃子魚的報道主要集中在養(yǎng)殖繁育[1, 5-7]、生理學(xué)特性[8-11]、營養(yǎng)學(xué)特性[12-14]、發(fā)育生物學(xué)[15]以及環(huán)境生態(tài)學(xué)[16]等方面，關(guān)于點(diǎn)籃子魚形態(tài)特征方面僅有少量報道[17-19]，未見生化遺傳特性方面的相關(guān)文獻(xiàn)。研究形態(tài)特征可為探討魚類生理功能提供基礎(chǔ)資料，同時也是種質(zhì)資源鑒定最為簡單直觀的首選指標(biāo)[18, 20]。同工酶作為一種生化遺傳參數(shù)，廣泛應(yīng)用在魚類的親緣關(guān)系與分類、物種鑒定中的基因表達(dá)與調(diào)控研究以及群體遺傳結(jié)構(gòu)分析等方面[21]。本研究借助形態(tài)學(xué)描述觀察、測定點(diǎn)籃子魚可數(shù)和可量性狀，并與已有研究結(jié)果比較，同時結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)分析不同組織中乳酸脫氫酶的表達(dá)情況，旨在進(jìn)一步豐富點(diǎn)籃子魚有關(guān)形態(tài)特征和生化遺傳方面的研究內(nèi)容，同時篩選出點(diǎn)籃子魚種質(zhì)的特征生化遺傳參數(shù)，為制定其種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)、促進(jìn)點(diǎn)籃子魚標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)和良種選育中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用點(diǎn)籃子魚于2019年1月采自海南，共30尾，所有試驗魚均為天然海域捕獲后經(jīng)人工馴養(yǎng)所得，無傷殘、無畸形，體重79.8～183.2 g，均值(134.68±28.06) g，體長14.2～27.4 cm，均值(16.52±2.31) cm。

1.2 實驗方法

1.2.1 形態(tài)測定

按照《養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢驗 第3部分：性狀測定》(GB/T 18654.3—2008)的規(guī)定，用游標(biāo)卡尺(精確到0.01 mm)對30尾樣本魚進(jìn)行測定?？蓴?shù)性狀包括背鰭、胸鰭、腹鰭和臀鰭的鰭式、脊椎骨數(shù)以及左側(cè)第一鰓弓外側(cè)鰓耙數(shù)，共計6個參數(shù)?？闪啃誀畎ㄈL、體長、體高、體厚、頭長、吻長、眼徑、眼間距、尾柄長和尾柄高，共計10個參數(shù)。

1.2.2 組織酶液的制備、電泳及染色

組織酶液的制備、電泳及染色參照張濤等[22]的方法。

1.2.5 模式圖的繪制

采用Bandscan 5.0電泳圖譜中的酶帶進(jìn)行灰度識別，并根據(jù)識別灰度繪制電泳圖譜模式圖。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0(IBM公司，美國)對實驗所得可量性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)描述及可數(shù)、可量性狀

觀測30尾點(diǎn)籃子魚(圖1)體呈橢圓形，側(cè)扁，背高，體背緣和腹緣淺弧形，頭較小，吻端至眼的背緣微凸；吻較短，口下位，口裂小，鰓蓋膜與峽部相連；眼中等偏大，上側(cè)位；側(cè)線完全，位高，與背緣平行，向后延伸至尾鰭基部。背鰭長，分為兩部分，前部分為棘組成，相連的后部分為分枝鰭條，起點(diǎn)位于腹鰭起點(diǎn)之前。胸鰭較大，后緣斜圓稍尖。腹鰭腹位，末端不達(dá)肛門。臀鰭長，后緣近圓弧形。尾柄短，尾鰭不分叉，外緣淺凹形。鰭式分別為：背鰭D. Ⅻ～XIV-9～11，胸鰭P. ⅱ-14～15，腹鰭V. Ⅰ-3-Ⅰ，臀鰭A. Ⅶ～Ⅷ-8～10。身體兩側(cè)上半部褐色，分布著許多橙黃色斑塊，下半部灰褐色，背鰭、胸鰭和腹鰭淺黃色，臀鰭和尾鰭淺灰褐色。

圖1 點(diǎn)籃子魚外觀形態(tài)Fig.1 Morphological measurement of Siganus guttatus

鰾1室，橢圓形。下咽齒3行。腹膜為灰黑色。第一鰓弓外側(cè)鰓耙數(shù)為21～25。點(diǎn)籃子魚可數(shù)、可量性狀分別見表1，表中范圍給出了所測各指標(biāo)的上下限，均值反映了所測數(shù)據(jù)的集中程度?？蓴?shù)性狀中側(cè)線鱗數(shù)變動范圍最大，背鰭條數(shù)不變?？闪啃誀钪兄饕泽w長和頭長為參照，給出了吻長、眼徑和眼間距等頭部主要參數(shù)與頭長的比例關(guān)系，也反映了體高、尾柄長和尾柄高等軀干部主要參數(shù)與體長的比例關(guān)系。

表1 點(diǎn)籃子魚的可數(shù)性狀和可量性狀的均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab.1 The mean values and standard deviation of countable and measurable characters of Siganus guttatus n=30

2.2 乳酸脫氫酶同工酶的表達(dá)

點(diǎn)籃子魚的LDH同工酶表達(dá)結(jié)果如圖2所示，在點(diǎn)籃子魚6種組織中共檢測到7條LDH酶帶，將靠近陽極最近的一條帶定義為LDH1，自陽極向陰極方向依次編號為LDH2、LDH3…LDH7。不同組織中酶帶數(shù)目和活性不同，呈現(xiàn)出明顯的組織特異性。心臟組織中共檢測到4條LDH酶帶，其中LDH1和LDH2活性較弱，LDH4活性最強(qiáng)，LDH3居中；眼睛晶狀體組織中共檢測到7條LDH酶帶，5尾樣本魚的LDH1和LDH2表達(dá)活性均較弱，LDH7表達(dá)活性最強(qiáng)，LDH6表達(dá)活性僅次于LDH7，5尾樣本魚的酶帶數(shù)和表達(dá)活性程度相同；肌肉組織中共檢測到3條LDH酶帶，LDH1表達(dá)活性最強(qiáng)，也是5尾樣本魚的唯一共有酶帶，LDH3僅在1號魚中有檢出，且表達(dá)活性較弱，LDH2在除1號魚和2號魚外的其余3尾樣本魚中有檢出，且4號魚中LDH2的表達(dá)活性程度較其余2尾魚弱；肝臟中共檢測到3條LDH酶帶，LDH3為5尾樣本魚的共有酶帶，且在2號魚和3號魚中表達(dá)活性程度較其余樣本魚強(qiáng)，LDH2僅在2號魚和3號魚中有檢出，且表達(dá)活性程度較弱，LDH1在除4號魚和5號魚外的其余3尾魚中有檢出，且在1號魚中的表達(dá)活性程度較其余2尾樣本魚弱；腎臟組織中共檢測到4條LDH酶帶，LDH1僅在1號魚中有檢出，表達(dá)活性程度較強(qiáng)，LDH2、LDH3和LDH4為5尾樣本魚的共有酶帶，5尾樣本魚中LDH4的表達(dá)活性程度較其余2條共有酶帶強(qiáng)，且2號魚和3號魚中LDH4表達(dá)活性程度較其余3尾魚強(qiáng)，1號魚中LDH2的表達(dá)活性程度較其余4尾樣本魚強(qiáng)；脾臟中共檢測到3條LDH酶帶，LDH3為5尾樣本魚的共有酶帶，5號魚中僅有LDH3檢出，LDH3在2號魚中的表達(dá)活性程度較其余4尾樣本魚強(qiáng)，LDH2的表達(dá)活性程度較其余2條酶帶弱，2號魚和3號魚中LDH1和LDH2的表達(dá)活性程度均較1號魚和4號魚強(qiáng)。

圖2 點(diǎn)籃子魚LDH電泳圖譜A、B、C、D、E和F分別表示點(diǎn)籃子魚心臟、眼睛晶狀體、肌肉、肝臟、腎臟和脾臟的LDH酶譜；1～5泳道分別表示不同個體的酶譜。Fig.2 Electrophoretogram of LDH isozymes in Siganus guttatusA, B, C, D, E, and F show the electrophoretograms of LDH isozymes expressed in heart, eye, muscle, liver, kidney and spleen, respectively；1-5 show the zymograms in different individuals.

2.3 點(diǎn)籃子魚特征生化遺傳參數(shù)

本研究中5尾樣本魚肌肉、肝臟、腎臟和脾臟組織LDH酶帶都有個體差異性，體現(xiàn)在不同樣本魚LDH酶帶數(shù)不同，或者即使酶帶數(shù)相同但不同樣本魚表達(dá)活性程度不同。雖然5尾樣本魚的心臟組織的LDH為單態(tài)即各樣本魚的LDH酶帶數(shù)和表達(dá)活性程度都相同，但有拖帶，分離效果并不是最佳，且制備心臟組織酶液時容易引入雜質(zhì)，影響酶帶分離，而所有樣本魚眼睛晶狀體LDH酶帶數(shù)和表達(dá)活性程度相同，各酶帶分離效果相對較好而且穩(wěn)定，所以初步確定以眼睛晶狀體LDH作為從生化遺傳特征層面鑒定點(diǎn)籃子魚種質(zhì)的備選對象。再選擇30尾樣本魚的眼睛晶狀體進(jìn)一步電泳以驗證眼睛晶狀體LDH酶帶表達(dá)情況，30尾樣本魚的眼睛晶狀體LDH酶帶表達(dá)情況一致，均為單態(tài)，8尾樣本魚眼睛晶狀體LDH同工酶圖譜(圖3)表達(dá)穩(wěn)定，分離效果好。鑒于此，本研究采用眼睛晶狀體LDH作為鑒定點(diǎn)籃子魚種質(zhì)的特征生化遺傳參數(shù)。

圖3 點(diǎn)籃子魚眼晶狀體LDH電泳圖譜1～8泳道分別表示不同個體的酶譜。Fig.3 Electrophoretogram of LDH isozymes expressed in eyes from Siganus guttatus1-8 show the zymograms in different individuals.

3 討論

3.1 點(diǎn)籃子魚的形態(tài)特征

形態(tài)特征是魚類等動物最直觀的種質(zhì)表現(xiàn)之一[23]。魚類身體的結(jié)構(gòu)是其生理功能的基礎(chǔ)，通過分析形態(tài)特征有助于了解、分析其捕食策略、攝食方式、運(yùn)動行為和繁殖習(xí)性等生態(tài)特性。本研究中點(diǎn)籃子魚背高、側(cè)扁、橢圓形的外形與其作為一種生活在近海、性情較溫順的魚類相適應(yīng)，其游泳速度不及紡錘型魚類如金槍魚屬魚類(Thunnus)。大多數(shù)魚類為1個背鰭，但鱸形目大多數(shù)魚類背鰭分前后兩部分，點(diǎn)籃子魚背鰭分前后兩部分也是其分類上屬于鱸形目的體現(xiàn)之一，此外前部分帶毒腺的棘也有利于其防御敵害。點(diǎn)籃子魚中等偏大的眼睛與其作為近海魚類，長期生存的水域光線相對充足有關(guān)，不同于生活在光照極弱或黑暗環(huán)境眼睛小甚至退化如穴居魚類[24]。點(diǎn)籃子魚口下位、口裂小便于其刮食珊瑚礁以及養(yǎng)殖網(wǎng)箱上附著藻類。形態(tài)特征是遺傳和環(huán)境因素共同作用的產(chǎn)物[25]。

形態(tài)度量是研究生物表觀形態(tài)性狀的手段，可提供目標(biāo)種類鑒別的關(guān)鍵形態(tài)指標(biāo)，同時也為其系統(tǒng)分類和進(jìn)化、種質(zhì)鑒定和遺傳育種目標(biāo)性狀篩選等研究提供技術(shù)支持[26]。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)中已報道點(diǎn)籃子魚的形態(tài)特征進(jìn)行比較，在可數(shù)性狀方面如鰭棘數(shù)、不分支鰭條數(shù)和鰓耙數(shù)等不同于鄒雄等[18]的研究，見表2。造成可數(shù)性狀差異的原因除了與樣本量大小有關(guān)外，還可能與計數(shù)者的主觀判斷有關(guān)，尤其對于小規(guī)格魚類的計數(shù)、鰭棘的計數(shù)以及相鄰不分支鰭條根部是否聯(lián)會的判斷，不同的研究者很容易出現(xiàn)研究結(jié)果不同，這一現(xiàn)象也在鯽屬魚類(Carassius)中出現(xiàn)過[27]。為避免一些埋于肌肉中的短小棘以及辨別數(shù)目不明顯的分枝鰭條被少數(shù)或多數(shù)，本研究將樣本魚通過高溫煮熟后在維持魚體自身骨骼結(jié)構(gòu)的前提下逐一計數(shù)鰭棘、不分支鰭條數(shù)，這種計數(shù)方法和鄒雄等[18]的研究方法都成本低廉，但容易出現(xiàn)主觀判斷誤差，以及人為剝離肌肉(無論煮熟與否)時的操作失誤。X光片觀察雖然相對昂貴，但直觀、準(zhǔn)確度高；愈豪祥[27]認(rèn)為不同研究者在鯽屬魚類鰭棘數(shù)目計數(shù)上的判斷誤差源于研究者未采用X光片觀察。筆者認(rèn)為在研究魚類可數(shù)性狀時結(jié)合X光片觀察能提高計數(shù)的準(zhǔn)確度。

表2 點(diǎn)籃子魚可數(shù)性狀的比較Tab.2 Comparison of countable characters of Siganus guttatus

在可量性狀方面，本研究體長/頭長、頭長/吻長和頭長/眼徑所得結(jié)果不同于鄒雄等[18]和馬強(qiáng)等[19]的研究結(jié)果，見表3，造成這一差異的原因除了與所測樣本魚的規(guī)格和樣本量大小有關(guān)，還可能與測量方法有關(guān)。當(dāng)然不排除養(yǎng)殖魚類與野生魚類在外部形態(tài)特征上的差異造成的。野生種群和養(yǎng)殖種群獲取餌料難易程度不同，養(yǎng)殖種群餌料充分有保障，受敵害、環(huán)境脅迫相對少，有利于其生長，而野生種群餌料供應(yīng)保障程度上不及養(yǎng)殖種群，而且相對養(yǎng)殖種群長期處于復(fù)雜多變的水生態(tài)環(huán)境，不利于其又好又快的生長[28]。

表3 點(diǎn)籃子魚可量性狀的比較Tab.3 Comparison of measurable characters of Siganus guttatus

3.2 點(diǎn)籃子魚乳酸脫氫酶同工酶的表達(dá)

本研究發(fā)現(xiàn)LDH同工酶在點(diǎn)籃子魚的各種組織中均有表達(dá)，說明LDH同工酶在點(diǎn)籃子魚體各組織中廣泛分布。從本研究結(jié)果來看，在點(diǎn)籃子魚各組織中表達(dá)的LDH同工酶具有組織特異性，具體體現(xiàn)在LDH在同一個體的不同組織或器官中表達(dá)的酶帶數(shù)和表達(dá)活性程度不同。同工酶是基因的生化反應(yīng)表現(xiàn)，在電泳圖譜上基因位點(diǎn)的表現(xiàn)形式以酶帶呈現(xiàn)，由于基因位點(diǎn)的表達(dá)對組織具有選擇性，致使某些基因位點(diǎn)僅在特定的某種或某幾種組織中有表達(dá)，反應(yīng)在不同組織電泳圖譜上酶帶數(shù)目就不同。本研究認(rèn)為同工酶組織特異性表現(xiàn)在不同組織酶帶數(shù)不同，與劉磊等[29]認(rèn)為位點(diǎn)的表達(dá)體現(xiàn)同工酶的組織特異性相同。不同組織LDH表達(dá)活性程度不同，可能是由于同一基因在不同組織中的表達(dá)含量不同造成的。同工酶是基因表達(dá)的產(chǎn)物，其表達(dá)受到溫度、壓力、激素、氧容量和營養(yǎng)等內(nèi)外因素的時空調(diào)控，致使其基因在各組織間的表達(dá)時間和強(qiáng)度不相一致，造成了不同組織同工酶酶譜的特異性[30]。

點(diǎn)籃子魚LDH同工酶組織特異性與各組織的生理功能相關(guān)。LDH是由A、B、C3個基因位點(diǎn)編碼的四聚體蛋白質(zhì)。A、B基因在脊椎動物各組織器官中普遍表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物依次對應(yīng)電泳圖譜上自陽極向陰極的5條酶帶，即LDH1=B4、LDH2=AB3、LDH3=A2B2、LDH4=A3B和LDH5=A4，但也有物種只表達(dá)A4、B4兩種和A4、A2B2和B4三種[31]。不同種同工酶代謝作用不同，其含量的差異能反應(yīng)組織器官所處的生理狀態(tài)。LDH1通過催化乳酸轉(zhuǎn)變成丙酮酸，丙酮酸在線粒體中進(jìn)行有氧氧化產(chǎn)生能量供機(jī)體所需，LDH1一般在有氧組織中表現(xiàn)出較高的活性。LDH5主要參與無氧酵解，催化丙酮酸轉(zhuǎn)變成乳酸以產(chǎn)生能量。LDH5主要在無氧條件下起作用。本研究中點(diǎn)籃子魚眼睛晶狀體LDH7對應(yīng)A4，在眼睛晶狀體這種厭氧組織中參與無氧酵解。肌肉組織LDH1對應(yīng)B4，其較高的含量說明點(diǎn)籃子魚肌肉運(yùn)動過程中消耗了大量的氧氣。點(diǎn)籃子魚心臟LDH4對應(yīng)A4，心臟作為非厭氧器官而A4含量較高，反應(yīng)了點(diǎn)籃子魚處于低氧或無氧條件時心臟極力通過血液循壞為機(jī)體提供氧分和能量。C基因的表達(dá)具有高度的組織選擇性，在綠色太陽魚(Lepomiscyanellus)、鱒(Salmo playtcephalus)、黑鱸(Micropterussalmoides)等魚類中，主要在神經(jīng)視網(wǎng)膜光接收細(xì)胞和腦組織中表達(dá)，稱為“眼帶”[31]。本研究中點(diǎn)籃子魚沒出現(xiàn)經(jīng)典的5條帶，可能因為部分基因表達(dá)含量過低未檢出或者未表達(dá)，對于眼睛晶狀體組織中共有7條酶帶，可能由于亞基的存在、某些位點(diǎn)產(chǎn)生了等位基因?qū)е翷DH酶帶數(shù)目的增多。唐章生等[31]在研究巴西鯛(Prochilodusscrofa)時發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。本研究中點(diǎn)籃子魚眼睛晶狀體LDH1和LDH2可能是同一個位點(diǎn)的兩個等位基因，LDH1和LDH2表現(xiàn)出陽極高遷移率，符合“眼帶”的電泳特性，推測LDH1和LDH2是由C基因表達(dá)的產(chǎn)物。

4 結(jié)論

本研究采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法觀察描述了點(diǎn)籃子魚的形態(tài)特征，測定其可數(shù)、可量性狀，并與已有研究結(jié)果進(jìn)行比較分析。點(diǎn)籃子魚形態(tài)結(jié)構(gòu)與其生態(tài)特性密切相關(guān)，不同研究者關(guān)于可數(shù)、可量性狀的測定結(jié)果不同，可能與樣本規(guī)格差異、樣本量、樣本來源和測量方法有關(guān)。同時通過聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳較為系統(tǒng)的對點(diǎn)籃子魚6種主要組織的LDH同工酶進(jìn)行了分析，初步確定了眼睛晶狀體組織中LDH表達(dá)豐富且活性穩(wěn)定，可作為鑒定點(diǎn)籃子魚種質(zhì)的特征生化遺傳參數(shù)。點(diǎn)籃子魚LDH同工酶具有組織特異性，表現(xiàn)在LDH在同一個體的不同組織器官中表達(dá)的酶帶數(shù)和表達(dá)活性程度不同，分析認(rèn)為基因的表達(dá)以及表達(dá)含量在不同組織中具有選擇性，導(dǎo)致LDH同工酶的組織特異性。這種特異性與組織執(zhí)行不同的生理功能是相適應(yīng)的。點(diǎn)籃子魚眼睛晶狀體組織中LDH1和LDH2可能是C基因表達(dá)的產(chǎn)物。