浸泡免疫中的抗原呈遞及其佐劑研究進(jìn)展

鞏華，胡軍娜，任燕，賴迎迢，黃志斌

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁藥創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；廣東省免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510380；2. 河南省漯河市源匯區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，河南 漯河 462000)

魚(yú)用疫苗可安全高效地預(yù)防水生動(dòng)物疫病，對(duì)環(huán)境友好，已成為全球水產(chǎn)疫病防控的主流技術(shù)和研究方向[1-3]。其中，浸泡免疫可對(duì)魚(yú)群整體接種，操作簡(jiǎn)單、短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)批量接種、對(duì)魚(yú)體刺激小、對(duì)魚(yú)種魚(yú)苗接種效果更佳，具有良好推廣價(jià)值，在歐美、東亞等國(guó)家和地區(qū)有較多浸泡免疫產(chǎn)品[3-10]。浸泡免疫過(guò)程中存在疫苗用量大、個(gè)體獲得免疫力弱和成本高的問(wèn)題。浸泡免疫成功與否很大程度上與選擇的佐劑有關(guān)[3]。佐劑，是一種非特異性的免疫增強(qiáng)劑，與抗原一起使用，可以增強(qiáng)抗原的免疫原性、促進(jìn)(或調(diào)節(jié))機(jī)體對(duì)抗原的特異性免疫應(yīng)答的水平(或類型)[3-4]。隨著浸泡免疫機(jī)理研究的不斷進(jìn)步，魚(yú)用浸泡免疫佐劑研究向著開(kāi)發(fā)“高效穩(wěn)定、廉價(jià)實(shí)用”的新型佐劑方向發(fā)展，具有重要理論意義和實(shí)踐價(jià)值。

1 浸泡免疫中抗原呈遞的研究進(jìn)展

1.1 抗原呈遞途徑和部位

浸泡免疫過(guò)程中，抗原如何被抗原呈遞細(xì)胞攝取、加工并呈遞給T細(xì)胞是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的關(guān)鍵[5]。大量研究表明，抗原攝取主要依賴于硬骨魚(yú)的鰓、皮膚、側(cè)線和胃腸道等部位黏膜組織的吞噬作用。可溶性牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)和熒光乳汁微球不溶顆粒浸泡斑點(diǎn)叉尾鮰(IetalurusPunetaus)后，都被檢測(cè)到由皮膚的上皮組織進(jìn)入機(jī)體；而在虹鱒(Oncorhynchusmykiss)浸泡接種BSA后，皮膚和鰓組織都檢測(cè)到顆粒物質(zhì)的吸收[6]；在鯉(Cyprinuscarpio)高滲浸泡免疫后，皮膚和鰓的上皮組織會(huì)形成暫時(shí)性孔道，表明皮膚和鰓都是重要的抗原攝取部位[7]。Moore等[8]研究虹鱒浸泡在與1 μL熒光乳膠結(jié)合的BSA微球懸液中，檢測(cè)微球在不同組織的分布，結(jié)果表明皮膚和鰓都參與攝取，皮膚起主要作用，微球至少在皮膚和鰓組織中保留了24 d，而少數(shù)微球被轉(zhuǎn)移到脾臟和頭、腎；通過(guò)定量分析表明，側(cè)線和體表剩余皮膚之間的攝取率沒(méi)有差異[9]。對(duì)大菱鲆(Scophthalmusmaximus)腸道相關(guān)淋巴組織(GALT)中的淋巴群體進(jìn)行免疫球蛋白染色，結(jié)果顯示，有許多淋巴細(xì)胞存在，但在上皮細(xì)胞中很少檢測(cè)到免疫反應(yīng)細(xì)胞，而經(jīng)常在上皮細(xì)胞中觀察到固有層，推測(cè)為GALT的一部分并參與黏膜免疫反應(yīng)[10]，目前尚未有確切的途徑在所有魚(yú)類中取得一致性意見(jiàn)。

1.2 抗原呈遞細(xì)胞

從細(xì)胞水平上看，確定專屬的抗原呈遞細(xì)胞(Antigen presenting cell，APC)是研究如何提高免疫效率的前提和基礎(chǔ)。浸泡免疫后，鯉鰓部顆粒性抗原通過(guò)上皮細(xì)胞進(jìn)入單核巨噬細(xì)胞，即抗原被上皮細(xì)胞攝取，轉(zhuǎn)運(yùn)到鰓部的吞噬細(xì)胞[9]。而在發(fā)生吞飲現(xiàn)象的細(xì)胞中可見(jiàn)大量吞飲小泡和線粒體分布[11]，這種特點(diǎn)與哺乳類、鳥(niǎo)類的膜性細(xì)胞(Membranous cell, M細(xì)胞)相似。M細(xì)胞主要分布于哺乳動(dòng)物體內(nèi)小腸回腸段Peyer區(qū)淋巴濾泡上皮中，能對(duì)外源性抗原、微粒、微生物及功能因子等外源性物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)、呈遞，激發(fā)腸道黏膜免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)[12]。近年來(lái)，樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)或類DCs在魚(yú)類多種組織中被發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞與哺乳動(dòng)物的DCs相似，可吞噬細(xì)菌、激活B細(xì)胞、刺激T細(xì)胞增殖，活化抗原特異性CD4+T細(xì)胞及混合淋巴細(xì)胞[13]。在虹鱒體內(nèi)的類DCs可以吞噬脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)小顆粒，激活 Toll樣受體在體內(nèi)遷移，GALT或鰓免疫相關(guān)組織中有巨噬細(xì)胞能夠吸收這些顆粒，并將其運(yùn)入血液循環(huán)中[14]。虹鱒造血組織中還有表面可表達(dá)MHCII分子的DCs，與B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞相比，這種單獨(dú)的樹(shù)突細(xì)胞具有更強(qiáng)的促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖和分化的能力[15]。當(dāng)然，有些抗原可產(chǎn)生相對(duì)獨(dú)特的免疫反應(yīng)，如遲緩愛(ài)德華氏菌(Edwardsiella tarda)弱毒活疫苗可以黏附和定植在粘膜表面，不需要攝取和呈遞，即可高度刺激相關(guān)T細(xì)胞(CD4+、CD8+)和B細(xì)胞，直接誘導(dǎo)粘膜表面的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生免疫保護(hù)[16]。

1.3 抗原呈遞影響因素

可影響浸泡免疫中抗原攝取呈遞的因素很多，如疫苗(抗原)劑量、浸泡時(shí)間、滲透壓、魚(yú)體規(guī)格、抗原狀態(tài)(顆粒狀或可溶性)和水溫等[1,3,11,17-20]，每一種因素的影響力需在一定條件范圍內(nèi)發(fā)揮作用，超過(guò)范圍會(huì)發(fā)生另外的變化。以浸泡時(shí)間為例，浸泡時(shí)間顯然與浸泡液濃度相關(guān)，浸泡接種常在濃縮液中短時(shí)間進(jìn)行，也可在稀釋液中長(zhǎng)時(shí)間浸泡。與長(zhǎng)時(shí)間浸泡在低濃度細(xì)菌疫苗液中相比，牙鲆(Paralichthysolivaceus)在高濃度浸泡短時(shí)間免疫保護(hù)效果更好，可能有更多抗原能夠快速進(jìn)入機(jī)體[17]。而在魚(yú)體攝取BSA-PLGA顆粒后檢測(cè)這些乳膠微球結(jié)果顯示，低濃度長(zhǎng)時(shí)間浸泡有助于提高浸泡效果[8]，BSA在高滲條件下攝取數(shù)量隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)而提高[18]，Nuno等[19]在研究中發(fā)現(xiàn)原液100 s或10 min浸泡后抗原的攝取顯著少于1∶100疫苗稀釋液中浸泡2 h(P<0.05)。但并非所有的時(shí)間延長(zhǎng)都會(huì)增加效果，Tatner等[20]證明采用1∶10稀釋的疫苗浸泡5 s和10 s時(shí)，抗原的攝取差異不顯著(P>0.05)。牙鲆在106和107CFU/mL疫苗液中長(zhǎng)時(shí)間浸泡確實(shí)比短時(shí)間浸泡效果好，但在高濃度疫苗液(108和109CFU/mL)中浸泡時(shí)間進(jìn)一步增加，抗原攝取反而會(huì)下降，這些結(jié)果表明，疫苗濃度和浸泡時(shí)間的適當(dāng)組合將更好地激活粘膜上皮細(xì)胞吞噬作用，可能有佐劑促進(jìn)抗原進(jìn)入并誘導(dǎo)更強(qiáng)免疫反應(yīng)的活性，但如果浸泡處理超出實(shí)驗(yàn)魚(yú)的耐受范圍，會(huì)導(dǎo)致對(duì)疫苗接種反應(yīng)能力的喪失[17]。

2 浸泡免疫佐劑研究現(xiàn)狀

2.1 佐劑及其分類

添加佐劑是提高免疫效率常用的辦法。佐劑可形成緩慢釋放的抗原儲(chǔ)存庫(kù)；在接種部位誘導(dǎo)局部炎癥反應(yīng)和免疫細(xì)胞遷移；促進(jìn)APC對(duì)抗原的攝取；誘導(dǎo)其他固有免疫細(xì)胞分泌相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子；活化炎性體促進(jìn)分泌IL-1β等促炎細(xì)胞因子；可調(diào)節(jié)抗原提呈途徑及其他尚未發(fā)現(xiàn)的佐劑作用機(jī)制[21]。目前添加佐劑的目的可分為兩大類：一是增強(qiáng)有效抗原誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答水平，降低抗原劑量或減少免疫次數(shù)；二是調(diào)節(jié)或改變疫苗特異性免疫應(yīng)答的類型，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的功能類型，促進(jìn)免疫記憶，提升免疫應(yīng)答速度，改變免疫應(yīng)答的廣譜性、特異性和親和力等[22]。疫苗佐劑分類目前尚未有公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)來(lái)源可以分為礦物鹽佐劑、礦物油佐劑、植物來(lái)源佐劑、動(dòng)物來(lái)源佐劑、微生物來(lái)源佐劑、細(xì)胞來(lái)源佐劑、核酸來(lái)源佐劑和人工合成有機(jī)佐劑等；根據(jù)作用機(jī)制可以分為疫苗投遞載體佐劑、免疫刺激佐劑以及復(fù)合佐劑；根據(jù)性狀可以為分為可溶性佐劑、水包油佐劑(O/W)、油包水佐劑(W/O)、水包油包水佐劑(O/W/O)和顆粒佐劑等，其中按來(lái)源分類相對(duì)簡(jiǎn)單清晰，在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)應(yīng)用較多[3-4,18,21]。能用于魚(yú)類浸泡免疫中的佐劑大多在實(shí)驗(yàn)室研究階段，少量實(shí)現(xiàn)商品化，如IMS1312、Montanide系列佐劑[18]等。

2.2 漁用浸泡佐劑研發(fā)現(xiàn)狀

2.2.1 礦物鹽佐劑

礦物鹽佐劑應(yīng)用最早、最廣泛，20世紀(jì)20年代就開(kāi)始研究并應(yīng)用于獸醫(yī)生物制品生產(chǎn)中[3]，主要包括鋁和鈣化合物，如氫氧化鋁、磷酸鋁和磷酸鈣等。這類佐劑對(duì)大分子蛋白質(zhì)、多糖等吸附能力很強(qiáng)，延緩抗原釋放，加強(qiáng)與巨噬細(xì)胞及其他APC接觸，如鋁鹽晶體與DCs膜上的鞘磷脂、膽固醇等脂類物質(zhì)的直接相互作用，誘導(dǎo)DCs的ITAM受體的聚集、并活化下游的SyK及P13K信號(hào)通路，強(qiáng)化誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞活化和體液免疫應(yīng)答，提高抗體數(shù)倍乃至成百倍的增長(zhǎng)[23]。該類佐劑性質(zhì)穩(wěn)定，便于運(yùn)輸和儲(chǔ)存。鋁佐劑還可減輕全身反應(yīng)，尤其對(duì)提純的制品，如類毒素、細(xì)菌疫苗等已經(jīng)成為不可缺少的組成部分[18]。氫氧化鋁的吸附能力強(qiáng)，是唯一一種被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)用于人用疫苗的佐劑，納米磷酸鈣具有可減少注射局部的炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)Th1細(xì)胞反應(yīng)優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)得到了美國(guó)專利委員會(huì)的授權(quán)[24]。很多注射類的疫苗都使用鋁膠作佐劑，而在浸泡中僅有少量應(yīng)用[25]。用含0.5%氫氧化鋁膠的大菱鲆虹彩病毒(TRBIV)滅活疫苗2次浸泡免疫大菱鲆，實(shí)驗(yàn)室相對(duì)保護(hù)率(Relative percentage survival，RPS)為83.3%，養(yǎng)殖場(chǎng)的RPS可達(dá)90.5%，類似于虹鱒、鯰(Silurusssp.)、真鯛(Pagrosomusmajor)、大西洋鮭(Salmosalar)和石斑魚(yú)(Epinephelussp.)的疫苗效果[26]。鋁鹽佐劑也存在一些問(wèn)題：鋁鹽難以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答；有副作用和安全性問(wèn)題，如有腎毒性和皮下反應(yīng)、可導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)和腦部疾病等；不能誘導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)及其對(duì)多糖抗原作用有限；特別不適合應(yīng)用于凍干工藝中，也不能冷凍儲(chǔ)存[4,18,27]。

2.2.2 礦物油佐劑

此類佐劑在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)臨床中常用的主要有弗氏佐劑、佐劑-65(礦物油+植物油)、白油Span佐劑、MF-59、SAF、Montanide系列配方等，其中弗氏佐劑最常用，有弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，用于注射免疫。在牙鲆注射免疫實(shí)驗(yàn)中，弗氏不完全佐劑、氫氧化鋁、磷酸鋁可分別提高遲緩愛(ài)德華氏菌滅活疫苗的RPS 為47%、19%和35%，比單用礦物鹽佐劑效果好[25]。弗氏佐劑效力高，但其高毒性、潛在的不良反應(yīng)和高成本，不適合用于水產(chǎn)疫苗[4]。法國(guó)賽比克(Seppic)公司開(kāi)發(fā)應(yīng)用于魚(yú)用疫苗的Montanide系列佐劑，以礦物油、非礦物油及其混合物為基礎(chǔ)，加入表面活性劑(如甘露糖、角鯊烯等)形成乳化液，其類型涵蓋W/O、O/W、W/O/W等形式;美國(guó)默克公司(Merck)的殺鮭氣單胞菌疫苗和鮭傳染性貧血病病毒疫苗中分別應(yīng)用Montanide ISA711、Montanide ISA763A佐劑[18]。這些商品化的疫苗佐劑用量大，在實(shí)際操作中，763A與抗原的用量一般為1∶1～2∶1，否則無(wú)法包裹抗原出現(xiàn)分層[28]。

IMS1312是一種商品化的O/W型復(fù)合佐劑，首先應(yīng)用于畜禽臨床，能誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，刺激產(chǎn)生大量的特異性IgG1[29]。這種佐劑應(yīng)用于浸泡嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)疫苗中能大幅度提高銀鯽(Carassiusauratusgibelio)抗體效價(jià)(1∶64和1∶32)和RPS(67.0%和56.0%)，增強(qiáng)免疫應(yīng)答效果，利于抗原懸浮，促進(jìn)魚(yú)鰓、體表及腸道對(duì)抗原的吸收及其在體內(nèi)的擴(kuò)散[30]。鱖(Sinipercachuatsi)浸泡嗜水氣單胞菌滅活疫苗后，添加佐劑IMS1312實(shí)驗(yàn)組的RPS(77.8%)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于無(wú)佐劑實(shí)驗(yàn)組(44.4%)，且實(shí)驗(yàn)魚(yú)皮膚黏液中抗體滴度最高可達(dá)210，而血清抗體滴度14 d時(shí)峰值為214.3，顯著高于無(wú)佐劑疫苗組(P<0.05)[31]。但該佐劑成本高，目前其價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于所用疫苗。

2.2.3 植物來(lái)源佐劑

植物中多種有機(jī)物，能有效刺激免疫系統(tǒng)，提高抗原識(shí)別能力。皂角苷，是從皂樹(shù)中分離的一類多環(huán)式化合物配基的配糖體表面活性劑的總稱，能在細(xì)胞膜上形成“孔洞”，誘導(dǎo)產(chǎn)生相關(guān)細(xì)胞因子(如Th1 型免疫因子)，引起局部炎癥反應(yīng)，使抗原穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)行抗原呈遞。其中QS-21皂角苷應(yīng)用最廣泛，可提高牙鲆鰻弧菌(Vibrioanguillarum)滅活口服疫苗、羅非魚(yú)(Oreochromisspp.)點(diǎn)狀氣單胞菌(A.punctata)滅活疫苗浸泡免疫效果，RPS可達(dá)72.0% 和78.5%，無(wú)佐劑組的RPS分別為27.0%和54.1%[32]。皂角苷在鰻弧菌滅活疫苗浸泡免疫大菱鲆實(shí)驗(yàn)中，RPS顯著提高(P<0.05)[33]。此外，皂角苷能提高對(duì)蝦非特異性免疫力、刺激魚(yú)類生長(zhǎng)，但會(huì)使脊椎動(dòng)物的紅細(xì)胞溶血，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂逐漸溶解[34]。

山莨菪堿是從山莨菪[Anisodustanguticus(Maxim.)Pascher]中提取的一種生物堿，通過(guò)提高細(xì)胞膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)能力，使疫苗更容易進(jìn)入魚(yú)體內(nèi)，提高魚(yú)體免疫功能。在浸泡嗜水氣單胞菌疫苗中加入終濃度為5 mmoL/L的山莨菪堿免疫鯽，魚(yú)類對(duì)藥物不存在應(yīng)激反應(yīng)，可提高疫苗的RPS[35]。山莨菪堿能促進(jìn)受免疫草魚(yú)血清中凝集抗體效價(jià)較迅速地上升，能顯著提高受免疫草魚(yú)血液中吞噬細(xì)胞的吞噬活性(P<0.01)，促使草魚(yú)出血病疫苗浸泡免疫RPS達(dá)85.0%，遠(yuǎn)高于對(duì)照組30.0%～50.0%[36]，在鱖的嗜水氣單胞菌滅活疫苗浸泡免疫中也顯示了較好的作用，可以達(dá)到60.0%[31]。在嗜水氣單胞菌滅活疫苗浸泡免疫銀鯽中的RPS達(dá)80.0%，無(wú)佐劑實(shí)驗(yàn)組RPS為56.0%[37]。

中草藥中含有植物多糖、生物堿、皂甙、蒽類、揮發(fā)油和有機(jī)酸等，可明顯刺激動(dòng)物的免疫功能，促進(jìn)抗體生成、增強(qiáng)免疫細(xì)胞活力、促進(jìn)細(xì)胞集落的發(fā)育、保護(hù)細(xì)胞免受生物氧化過(guò)程傷害[38]，鱖浸泡接種添加甘草素的嗜水氣單胞菌滅活疫苗后，頭腎中白細(xì)胞的吞噬活性和經(jīng)活菌攻毒后的RPS顯著高于未添加的免疫組(P<0.05)，但凝集抗體效價(jià)和補(bǔ)體活性則沒(méi)有明顯差別(P>0.05)[39]，可能與浸泡免疫的機(jī)制有關(guān)，浸泡過(guò)程中黏膜免疫發(fā)生機(jī)制與系統(tǒng)免疫不同[5,40]。由于魚(yú)類缺乏分化誘導(dǎo)性與效應(yīng)性粘膜位點(diǎn)，這可能與魚(yú)類細(xì)胞膜相關(guān)淋巴組織存在更多獨(dú)立的作用機(jī)制有關(guān)[16]，結(jié)果需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

2.2.4 動(dòng)物來(lái)源佐劑

殼聚糖是僅次于纖維素的天然聚合物，其商品化產(chǎn)品主要來(lái)源于甲殼動(dòng)物的幾丁質(zhì)，被證明具有良好的生物粘附性，含有的羥基和氨基可參與氫鍵的官能團(tuán)，且聚合物鏈在一定程度上是柔性鏈[41]。殼聚糖懸浮液或微粒具有免疫刺激活性[42]，其質(zhì)子化伯胺基團(tuán)在酸性條件下，可與帶負(fù)電荷的生物分子(如蛋白質(zhì)抗原)相互作用[43]，增加巨噬細(xì)胞和多形核細(xì)胞的積累和活化，增強(qiáng)抗體反應(yīng)，提高遲發(fā)型超敏反應(yīng)和細(xì)胞毒性反應(yīng)[44]，具有良好免疫調(diào)節(jié)特性，且無(wú)毒，有良好的生物降解能力和粘膜粘附特性等，被廣泛用作免疫佐劑。虹鱒浸泡接種殼聚糖DNA疫苗時(shí)[41]，殼聚糖濃度為5.0～10.0 μg/mL時(shí)無(wú)死亡，而短期暴露于殼聚糖后致死的報(bào)道，可能由于聚合物上質(zhì)子化的氨基與粘膜層的唾液酸及其他陰離子之間相互作用導(dǎo)致的，即使已有研究證明酸化殼聚糖低濃度對(duì)虹鱒是有毒的[42]。因此該佐劑的應(yīng)用，應(yīng)注意安全條件，目前很多做成納米顆粒廣泛應(yīng)用[44]。

蜂膠是指蜜蜂將采集的樹(shù)膠，混入其上顎腺分泌物和蜂蠟等形成的具有芳香氣味的膠狀固體物質(zhì)，含有黃酮類、有機(jī)酸、萜烯類、芳香醛、酯類、醇類及多種氨基酸、維生素、酶、礦物質(zhì)等，有效成分主要是黃酮類化合物。蜂膠能調(diào)節(jié)體液免疫力，具有抗病毒、抗菌、抗氧化、抗腫瘤等特點(diǎn)，然而僅有少數(shù)國(guó)家將其作為疫苗佐劑研究，主要是中國(guó)，其次是巴西、古巴、保加利亞、俄羅斯、埃及以及瑞典[4]。其水提取物被用作嗜水氣單胞菌滅活疫苗佐劑，注射后增加了異育銀鯽的白細(xì)胞活性，提高了相對(duì)存活率[45]；其醇提取物作為大菱鲆鰻弧菌等五聯(lián)滅活疫苗佐劑，其效果和黃芪多糖、弗氏佐劑相當(dāng)[46]。目前尚未有蜂膠作為浸泡佐劑應(yīng)用于生產(chǎn)方面的報(bào)道，但其能被黏膜吸收，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的流動(dòng)和擴(kuò)散[4]，具有作為浸泡佐劑的潛力。

2.2.5 微生物來(lái)源佐劑

細(xì)菌來(lái)源佐劑主要來(lái)自細(xì)菌表面的LPS、霍亂毒素、β-葡聚糖、大腸桿菌不耐熱腸毒素、鞭毛蛋白和菌蛻等[2]，能提高非特異性免疫和黏膜免疫，目前關(guān)于LPS的研究較多。LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的組分之一，能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)魚(yú)產(chǎn)生特異性抗體，提高魚(yú)體內(nèi)巨噬細(xì)胞的分裂、游走和吞噬能力[47]。用溶藻弧菌(V.alginolyticus)LPS注射免疫石斑魚(yú)后，既可刺激魚(yú)體產(chǎn)生良好的體液免疫應(yīng)答，又可顯著提高實(shí)驗(yàn)魚(yú)血清中相關(guān)免疫酶活性，提高魚(yú)體的RPS(P<0.05)[48]。LPS和β-葡聚糖作為疫苗免疫刺激劑使用可顯著增強(qiáng)牙鲆的免疫應(yīng)答水平，提升遲鈍愛(ài)德華氏菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶蛋白亞單位疫苗的免疫效果[49]，在耶爾森氏菌LPS注射和浸泡免疫45天后的攻毒實(shí)驗(yàn)表明，處理組的RPS顯著高于對(duì)照組(P<0.05)[50]，當(dāng)然浸泡處理的LPS保護(hù)效果比注射疫苗組低。LPS 是已知最活躍的病原體相關(guān)分子模式之一，但天然LPS往往會(huì)增加疫苗的反應(yīng)性，具有一定的內(nèi)毒素活性，可以通過(guò)對(duì)LPS結(jié)構(gòu)進(jìn)行化學(xué)修飾來(lái)降低其毒性，同時(shí)觸發(fā)針對(duì)特定病原體所需的適當(dāng)免疫反應(yīng)，是其在佐劑應(yīng)用中的關(guān)鍵，如單磷脂A是通過(guò)對(duì)脂質(zhì)A進(jìn)行修飾，降低其內(nèi)毒素活性并保留其佐劑效應(yīng)[51]。

細(xì)菌菌蛻(Bacterial ghosts，BGs)是革蘭陰性菌的細(xì)菌空殼，細(xì)菌表面保存完好的結(jié)構(gòu)含有天然的免疫刺激劑(如LPS、鞭毛蛋白等)，體內(nèi)外試驗(yàn)研究表明，BGs具有免疫佐劑效應(yīng)，能夠誘導(dǎo)多種細(xì)胞產(chǎn)生前炎癥細(xì)胞因子，后者可招募T細(xì)胞和B細(xì)胞聚集淋巴結(jié)，在小鼠進(jìn)行口服免疫時(shí)，引起更大的CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，進(jìn)而激活一系列體液免疫、細(xì)胞免疫及黏膜免疫應(yīng)答[52]。采用腹腔注射、口服、浸泡接種菌蛻疫苗后歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)的RPS分別為75.0%、52.5%、37.5%，分別高于無(wú)佐劑實(shí)驗(yàn)組的55.0%、40.0%、32.5%，且BGs疫苗組死亡時(shí)間明顯推后，表明BGs疫苗的免疫保護(hù)效果優(yōu)于福爾馬林滅活疫苗，免疫后歐洲鰻鱺血清抗體效價(jià)均明顯升高，而血清抗體效價(jià)無(wú)顯著性差異[53]，BGs單獨(dú)作為抗原其優(yōu)勢(shì)不大，但作為DNA疫苗佐劑，能顯著提高機(jī)體的免疫應(yīng)答[52]。

2.2.6 人工合成有機(jī)佐劑

細(xì)胞因子佐劑和核酸來(lái)源佐劑等很少應(yīng)用于浸泡免疫中，可能存在在環(huán)境中穩(wěn)定性差、細(xì)胞微環(huán)境中易降解等問(wèn)題[54]，而有些人工合成有機(jī)佐劑性狀穩(wěn)定，在實(shí)驗(yàn)中被證明具有浸泡佐劑效果。左旋咪唑(Levamisole，LMS)是一種具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫作用的合成藥物，可使受抑制的吞噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、顆粒細(xì)胞等恢復(fù)正常，提高對(duì)細(xì)菌、病毒等的保護(hù)[55]。Baba等[56]采用10.0 μg/mL的LMS與痘瘡滅活疫苗浸泡鯉24 h，實(shí)驗(yàn)組感染率從35.0%下降到28.0%，表明該藥物可用作病毒疫苗佐劑。當(dāng)然LMS更多應(yīng)用于單殖吸蟲(chóng)的防控，在125.0 mg/L潑灑LMS來(lái)控制和治療魚(yú)類養(yǎng)殖中的單殖吸蟲(chóng)感染，有很好的安全性和提高免疫效果[57]。

人工合成的不可溶聚合物納米微顆粒作為疫苗佐劑，已成為近年來(lái)的關(guān)注熱點(diǎn)，由于其良好的安全性、生物相容性和生物降解性而廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。在魚(yú)類口服免疫時(shí)常用的有效佐劑為免疫刺激復(fù)合物(Immune stimulating complex，ISCOM)。ISCOM是由嵌入佐劑皂甙、膽固醇、卵磷脂與抗原在溶液中按1∶1∶1∶1的比例，相互作用形成脂質(zhì)小泡，能誘導(dǎo)宿主同時(shí)產(chǎn)生體液免疫、細(xì)胞免疫和非特異性免疫。ISCOM安全性好，性質(zhì)穩(wěn)定，能通過(guò)粘膜接種而用于浸泡免疫[58]。創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)ISCOM疫苗通過(guò)注射、浸泡和灌胃接種途徑接種歐洲鰻鱺均健活、無(wú)毒副作用[59]。嗜水氣單胞菌β-hemA-ISCOMs疫苗浸泡免疫歐洲鰻鱺，其RPS、淋巴免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和血清抗體效價(jià)均顯著高于其他試驗(yàn)組(P<0.05)[60]。該佐劑適用于膜來(lái)源抗原，對(duì)基因重組蛋白抗原等很難實(shí)現(xiàn)可重復(fù)的、有效的抗原裝載，其中高劑量的皂甙會(huì)加重ISCOM的副反應(yīng)，再次免疫接種抗體水平增強(qiáng)不明顯，且很難大批量生產(chǎn)[58]，這些問(wèn)題制約了該項(xiàng)技術(shù)商品化應(yīng)用。目前該佐劑已被納入許多商業(yè)化的陸生動(dòng)物疫苗中，挪威法瑪克(Pharmaq)水產(chǎn)醫(yī)藥公司正在研究如何將該佐劑引入商業(yè)化的魚(yú)類疫苗產(chǎn)品中[44]。

3 研究展望

3.1 浸泡免疫基礎(chǔ)理論研究待深入

浸泡免疫研究在抗原的攝取、加工、呈遞和反應(yīng)等方面不斷取得新進(jìn)展，但魚(yú)體內(nèi)經(jīng)典的黏膜免疫反應(yīng)單元目前尚未發(fā)現(xiàn)。DCs是已知的功能最強(qiáng)的APC，是激活高等動(dòng)物初始T淋巴細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)的唯一細(xì)胞，在先天性免疫、適應(yīng)性免疫以及維持自身免疫耐受方面具有重要作用，而在硬骨魚(yú)類中，對(duì)于DCs的分子標(biāo)記還不確定，而且分布數(shù)量少[13]。關(guān)于魚(yú)類的黏膜免疫球蛋白IgZ和IgT的功能還不清晰[14]，目前在虹鱒中發(fā)現(xiàn)了嗅覺(jué)器官內(nèi)的骨髓和淋巴細(xì)胞的擴(kuò)散網(wǎng)絡(luò)，CD8+T細(xì)胞、IgT+B細(xì)胞聚集在嗅層的粘膜頂端，MHCII+細(xì)胞位于更靠近鼻腔內(nèi)腔的神經(jīng)上皮區(qū)域，免疫細(xì)胞的分布表明硬骨魚(yú)嗅覺(jué)器官有獨(dú)特的局部免疫環(huán)境，不干擾感覺(jué)功能；且參與后天和先天免疫的基因在鼻腔組織中均有表達(dá)，表明鼻腔內(nèi)腔是重要的免疫器官[61]，但尚未有關(guān)于細(xì)胞遷移和歸巢等經(jīng)典的黏膜免疫反應(yīng)活動(dòng)的報(bào)道。因此對(duì)于浸泡過(guò)程中魚(yú)類如何識(shí)別抗原和非抗原，同時(shí)如何抵御病原侵襲，特別是在抗原的呈遞方面，體液免疫和粘膜表面局部免疫如何緊密聯(lián)系，如何誘導(dǎo)全身免疫反應(yīng)，并形成免疫記憶，如何快速、有效、穩(wěn)定的刺激機(jī)體產(chǎn)生長(zhǎng)效免疫保護(hù)等方面，需要繼續(xù)深入研究。

3.2 新佐劑材料的篩選和構(gòu)建

納米微球佐劑具有副作用少、緩釋、長(zhǎng)效、保護(hù)疫苗抗原不被水解，增強(qiáng)疫苗有效成分呈遞的效果，已開(kāi)展的納米鋁、納米鈣的佐劑研究效果明顯[24]。1995年首次開(kāi)展了大西洋鮭PLGA納米微球口服研究，PLGA在七帶石斑魚(yú)(E.septemfasciatus)神經(jīng)壞死病毒(NNV)活疫苗的免疫保護(hù)研究中發(fā)現(xiàn)，其效果明顯(93.7%/9.8%)，且保護(hù)作用能夠持續(xù)10個(gè)月[62]；對(duì)虹鱒、牙鲆、石斑魚(yú)、草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)和鯽等開(kāi)展了PLGA、聚-DL-乳酸-聚乙二醇共聚物(DL-polylactide-co-polyethylene glycol，PELA)納米微球研究，均有較好的口服免疫增效作用[2]。野田村病毒滅活疫苗制成PLGA納米粒后，浸泡接種免疫斜帶石斑魚(yú)苗，RPS可以從39.0%～43.0%提高到85.0%，有效降低神經(jīng)壞死造成的死亡率[63]。目前該項(xiàng)技術(shù)限于成本和技術(shù)成熟度問(wèn)題，尚未實(shí)際應(yīng)用，但為病毒滅活疫苗的研究開(kāi)發(fā)提供了新的思路。這些載體疫苗佐劑可以和免疫增強(qiáng)類佐劑復(fù)合使用，能最大程度增強(qiáng)疫苗的免疫應(yīng)答，減少抗原的降解，誘發(fā)不同類型的免疫反應(yīng)，上調(diào)對(duì)機(jī)體的全面保護(hù)，在醫(yī)學(xué)上已成為佐劑發(fā)展的一大趨勢(shì)[21]。

3.3 新投遞方式的輔助

一些投遞方式和佐劑聯(lián)合使用可提高免疫保護(hù)。鯉浸泡在4.5%的氯化鈉高滲環(huán)境中，體表約5.0%的上皮細(xì)胞變圓脫落留下細(xì)胞大小的孔，到淡水去離子后20 min，這些小孔大部分被封閉，皮膚整體形態(tài)與對(duì)照組相同；在此過(guò)程中鰓絲上皮細(xì)胞很少脫落，但片層內(nèi)部明顯受到干擾，上皮明顯隆起，形成半細(xì)胞大的孔隙。這些孔隙可以增加APC與抗原接觸，加快攝取速度，提高浸泡免疫效果[7]。高滲環(huán)境(1.5%的氯化鈉)與葡聚糖佐劑在嗜水氣單胞菌滅活疫苗對(duì)鱖的免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)中效果相當(dāng)(RPS均為66.7%)，高于單用疫苗結(jié)果(44.4%)[31]，提高鹽度可明顯提升疫苗的免疫保護(hù)。在浸泡過(guò)程中還可通過(guò)高壓槍或超聲波等方式提高疫苗的遞送效率。Navot等[64]發(fā)現(xiàn)低頻超聲波能提高浸泡BSA后金魚(yú)(C.auratus)APC的促進(jìn)吸收作用、皮膚抗原轉(zhuǎn)運(yùn)能力和抗體的產(chǎn)生，因此所需要抗原量?jī)H為無(wú)超聲浸泡的1/5。Zhou等[65]用脈沖式超聲波處理青石斑魚(yú)(E.awoara)可以顯著提高溶藻弧菌滅活疫苗浸泡免疫效果(P<0.05)，浸泡2 min，連續(xù)施加35 kHz的超聲波2 min，再次浸泡2 min，4周和8周后攻毒RPS與注射免疫效果相當(dāng)。這些輔助手段需大型設(shè)備或額外操作，勞動(dòng)強(qiáng)度大，魚(yú)體應(yīng)激大，需進(jìn)一步簡(jiǎn)化操作，細(xì)化參數(shù)和安全問(wèn)題。

使用佐劑提高免疫效率，是解決浸泡免疫效率不高的直接辦法。目前對(duì)浸泡佐劑和操作技術(shù)的篩選，缺乏切實(shí)的針對(duì)性，不能有效應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)，制約了產(chǎn)業(yè)發(fā)展。隨著新材料新技術(shù)的應(yīng)用，越來(lái)越多的佐劑及使用技術(shù)將引入浸泡免疫研究中，將會(huì)改變水產(chǎn)疫苗的構(gòu)建、生產(chǎn)和使用方式，促進(jìn)魚(yú)病防治技術(shù)進(jìn)步，特別是重大疫病的防控。