酶聯(lián)免疫分析法測(cè)定水產(chǎn)苗種中喹乙醇代謝物

梁娟，于盟盟，潘玉蘭，馬騰*，安萍，王芳

(1.日照市海洋與漁業(yè)研究院，山東 日照 276826；2.乳山市海洋與漁業(yè)監(jiān)督監(jiān)察大隊(duì)，山東 威海 264500)

喹乙醇(Olaquindox, OLA)是一種非抗生素類(lèi)抗菌促生長(zhǎng)劑，具有良好的廣譜抗菌效果[1]，同時(shí)還能促進(jìn)蛋白質(zhì)同化，極大地提高動(dòng)物機(jī)體對(duì)飼料的轉(zhuǎn)化率和利用率，縮短動(dòng)物的生長(zhǎng)周期[2]，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的促進(jìn)生長(zhǎng)、抗菌治療和水生動(dòng)物疾病的預(yù)防[3]。20世紀(jì)90年代開(kāi)始，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，OLA及其主要代謝產(chǎn)物3-甲基-喹噁啉-2-羧酸(3-methyl-quinoxaline-2-carboxylic acid, MQCA)具有明顯的蓄積毒性、免疫毒性、遺傳毒性和致畸性，不但對(duì)水生動(dòng)物的健康造成威脅，而且通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體后會(huì)造成人體慢性中毒、產(chǎn)生耐藥性，對(duì)人類(lèi)健康造成致畸、致癌、致突變等潛在危害[4-5]。早在1998年，OLA就已經(jīng)被歐盟禁止作為飼料添加劑[6]；原農(nóng)業(yè)部第2638號(hào)公告也明確規(guī)定停止在食品動(dòng)物中使用OLA；原農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY 5070—2002《無(wú)公害食品 水產(chǎn)品中漁藥殘留限量》[8]中規(guī)定OLA在水產(chǎn)品中不得檢出。但該類(lèi)藥物價(jià)格低廉，抗菌促生長(zhǎng)效果好，違規(guī)添加現(xiàn)象仍時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重危害人體健康。

OLA穩(wěn)定性差，在動(dòng)物體內(nèi)代謝快，代謝產(chǎn)物多，其中絕大多數(shù)代謝產(chǎn)物穩(wěn)定性差，不具備檢測(cè)條件，而MQCA代謝過(guò)程長(zhǎng)、殘留量比較穩(wěn)定，是國(guó)際食品法典委員會(huì)認(rèn)定的OLA殘留標(biāo)示物[4,9]，也被國(guó)內(nèi)漁業(yè)質(zhì)量安全監(jiān)管部門(mén)作為OLA殘留的監(jiān)控對(duì)象。

近幾年來(lái)，關(guān)于MQCA的檢測(cè)方法報(bào)道很多，經(jīng)查閱文獻(xiàn)[1,4-5,7,9-11]和現(xiàn)行有效標(biāo)準(zhǔn)[12-15]，液相色譜法和液相色譜—質(zhì)譜串聯(lián)法等大型精密儀器分析法為主流檢測(cè)模式，檢測(cè)集中在畜禽肉[5,10-11,13,16]、蛋類(lèi)[9]、水產(chǎn)品[1-3,8,15,17-18]、牛、豬的肝臟、肌肉等動(dòng)物組織[13]以及奶類(lèi)[12]等食品相關(guān)領(lǐng)域，針對(duì)水產(chǎn)苗種中MQCA殘留的檢測(cè)方法未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。水產(chǎn)苗種作為一類(lèi)特殊品種，其繁育周期短、季節(jié)性強(qiáng)，適合國(guó)內(nèi)漁業(yè)質(zhì)量安全監(jiān)管部門(mén)監(jiān)督抽查和執(zhí)法的期限非常短，特別是蝦、蟹等甲殼類(lèi)苗種，適合銷(xiāo)售的時(shí)間只有短短3～4 d。大型精密儀器分析方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，常作為藥物殘留檢測(cè)的確證方法。然而，水產(chǎn)苗種樣品用大型精密儀器進(jìn)行檢測(cè)，受限于前處理技術(shù)復(fù)雜、檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)、檢測(cè)結(jié)果滯后等原因，國(guó)內(nèi)漁業(yè)質(zhì)量安全監(jiān)管部門(mén)應(yīng)對(duì)陽(yáng)性樣品執(zhí)法銷(xiāo)毀時(shí)，該苗種已流向養(yǎng)殖環(huán)節(jié)。此種情況，不但貽誤最佳執(zhí)法時(shí)機(jī)，而且從養(yǎng)殖源頭造成水產(chǎn)品質(zhì)量安全隱患。因此，建立一種準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法具有重要意義。酶聯(lián)免疫法靈敏度高、特異性強(qiáng)，且操作簡(jiǎn)單、快捷，還能避免產(chǎn)生大量有機(jī)廢液，具有對(duì)人體傷害和環(huán)境污染危險(xiǎn)性小等優(yōu)點(diǎn)，是目前MQCA殘留定性、定量篩選的主要方法[2,18-19]，特別適用于多品種、大批量水產(chǎn)苗種中MQCA殘留的快速批量篩查。

本試驗(yàn)以中國(guó)對(duì)蝦(Penaeuschinensis)、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)、刺參(Stichopusjaponicus)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)等常見(jiàn)苗種作為研究對(duì)象，在MQCA酶聯(lián)免疫反應(yīng)試劑盒的基礎(chǔ)上，通過(guò)采取HCl溶液替代H2SO4溶液、純水飽和正己烷脫脂除雜等措施對(duì)方法進(jìn)行優(yōu)化，以有效減少前處理過(guò)程中MQCA的損失，降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，提高方法靈敏度和準(zhǔn)確度，做出方法學(xué)論證，以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同基質(zhì)水產(chǎn)苗種中MQCA的高效、快速檢測(cè)，旨在治理水產(chǎn)苗種繁育過(guò)程中使用違禁藥物，為嚴(yán)厲打擊違法行為提供及時(shí)的技術(shù)支撐，提高執(zhí)法工作的時(shí)效性，確保漁業(yè)質(zhì)量安全。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

MK3型微孔板酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；微量移液器、多道微量移液器，賽默飛世爾科技有限公司；PL202-L型電子精密天平，梅特勒托利多儀器上海有限公司；SHZ型水浴恒溫振蕩器，龍口市先科儀器公司；渦旋混合器，美國(guó)Talboys公司；DC-24型水浴氮吹儀，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；10D經(jīng)濟(jì)型純水儀，上海摩勒科學(xué)儀器有限公司；DNP-9002BS-III型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；TG16-WS2臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司；96孔MQCA檢測(cè)試劑盒，大連柏爾食品安全技術(shù)有限公司；去離子水；乙酸乙酯(AR)、正己烷(AR)，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；HCl(AR)、H2SO4(AR)，天津科密歐試劑有限公司。

1.2 樣品

本研究以中國(guó)對(duì)蝦、三疣梭子蟹、刺參、牙鲆等常見(jiàn)苗種為目標(biāo)基體，分別用聚乙烯桶培育4種不同基質(zhì)苗種的陽(yáng)性樣本和陰性樣本作為試驗(yàn)對(duì)象。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制

將1.1中濃HCl與H2O按照1∶2(V/V)配制濃度為4 mol/L HCl溶液，濃H2SO4與H2O按照 1∶8(V/V)配制濃度為2 mol/L H2SO4溶液；將試劑盒自帶濃縮復(fù)溶液用等體積的純水稀釋?zhuān)渲茦颖緩?fù)溶液；將試劑盒自帶20倍濃縮洗滌液與純水按照1∶19(V/V)稀釋為1倍工作洗液。

1.3.2 樣品制備與提取

挑出樣品中餌料等雜質(zhì)，用去離子水清洗、瀝干，攪碎成糜狀，充分混合均勻；準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品(1.00±0.05) g置于25 mL聚丙烯離心管中，加入8.0 mL乙酸乙酯和1.0 mL H2O，振蕩5 min；加入1.4 mL 4 mol/L HCl溶液，渦旋振蕩30 s，(22.5±2.5)℃ 4 000 r/min離心5 min；移取4 mL上清液，置于10 mL聚丙烯離心管中，(55±0.5) ℃水浴氮?dú)獯蹈?；加?.00 mL純水飽和正己烷溶解干燥物，旋渦振蕩30 s；加入1.00 mL樣本復(fù)溶液，旋渦振蕩30 s；(22.5±2.5) ℃ 2 000 r/min離心5 min；棄去上層，下層溶液供酶標(biāo)儀檢測(cè)。

1.3.3 試驗(yàn)方法

分別移取標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本溶液各50 μL置于對(duì)應(yīng)的板孔中，再按以上順序依次加入50 μL酶標(biāo)記物和50 μL抗體，輕敲微孔板邊緣混勻1 min，用蓋板膜蓋板后，(22.5±2.5)℃避光孵育30 min；揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，每孔及時(shí)加入洗滌液250 μL，輕敲微孔板邊緣混勻1 min，將孔內(nèi)液體甩干，重復(fù)洗板步驟4次，每次間隔15～30 s，最后一次洗板后，應(yīng)使板盡量甩干并在吸水紙上倒扣、排干(排干后若有氣泡，先用洗耳球吹破，再拍干)；依次加入50 μL底物緩沖液和50 μL TMB底物，輕敲微孔板邊緣混勻1 min，用蓋板膜蓋板后，(22.5±2.5)℃避光孵育15 min；將板孔加入50 μL的終止液終止顯色反應(yīng)，輕敲微孔板邊緣混勻1 min，穩(wěn)定1 min后，450 nm上機(jī)測(cè)定(上機(jī)前30～40 min打開(kāi)酶標(biāo)儀，使儀器狀態(tài)穩(wěn)定)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑的選擇

ELISA試劑盒操作規(guī)范規(guī)定乙酸乙酯為提取劑。經(jīng)查文獻(xiàn)，樣品中MQCA常用提取劑有甲醇[1]、乙腈[10]和乙酸乙酯[15]等有機(jī)試劑。本試驗(yàn)考察了3種有機(jī)試劑的提取效果：將添加濃度為10.0 μg/kg的加標(biāo)樣品，分別用甲醇、乙腈、乙酸乙酯進(jìn)行提取。結(jié)果表明：用甲醇提取，提取液較為渾濁、干擾成分較多，不利于正己烷凈化；乙腈有利于沉淀蛋白，有一定的凈化作用，提取液澄清[10]，但回收率僅為46.3%～59.2%，可能是乙腈與水互溶，有機(jī)相與水相不能分層，提取液中含有較多水分，氮吹時(shí)間延長(zhǎng)，導(dǎo)致樣品中MQCA損失較多，影響回收率。用乙酸乙酯作為提取劑，4種不同基質(zhì)樣品回收率得到明顯提高，為66.7%～73.4%。故本方法采用乙酸乙酯作為提取劑。

2.2 酸解試劑的優(yōu)化

MQCA為有機(jī)強(qiáng)酸，極性較強(qiáng)，在動(dòng)物體內(nèi)通過(guò)共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)以結(jié)合狀態(tài)存在，需將MQCA水解為游離態(tài)之后再對(duì)其進(jìn)行提取。經(jīng)查閱文獻(xiàn)得知，有酸水解[11]、堿水解[5-6]和酶水解[17]等多種方法可供選擇。酶水解過(guò)程溫和但耗時(shí)長(zhǎng)，需要16～18 h[6,10]，堿水解通常反應(yīng)較為劇烈[5-6]，會(huì)造成MQCA降解。以這2種方式進(jìn)行水解，后續(xù)還要加酸調(diào)節(jié)pH至酸性，樣品凈化處理過(guò)程煩瑣，不能滿足簡(jiǎn)單、快捷的需求。程春霞等[11]研究發(fā)現(xiàn)，采用酸水解的方式可有效沉淀蛋白質(zhì)，減少雜質(zhì)干擾，保證較高的提取效率[9,11]。因此，本研究選用酸水解方法。

ELISA試劑盒操作規(guī)范規(guī)定酸解液為1 mL濃度為2 mol/L H2SO4溶液，考慮到水產(chǎn)苗種樣品是整只攪碎混勻[20]，其中蟹殼、蝦殼和魚(yú)骨中的CaCO3成分極易與H2SO4溶液反應(yīng)生成CaSO4，CaSO4微溶于水，會(huì)包在樣品顆粒表面，阻礙MQCA的充分提取，用HCl溶液進(jìn)行酸解可有效避免這一現(xiàn)象。為驗(yàn)證這種可能性，本試驗(yàn)通過(guò)H+等摩爾濃度換算，將2 mol/L H2SO4溶液優(yōu)化為4 mol/L HCl溶液，將 4種不同基質(zhì)陰性樣品各稱(chēng)取6份，均添加10.0 μg/kg加標(biāo)水平，分別設(shè)置H2SO4溶液和HCl溶液2種酸解條件，每種條件3組平行(表1)。結(jié)果表明，酸解液由H2SO4溶液優(yōu)化為HCl溶液后，除刺參苗種的平均檢出水平差異不大外，其他3種苗種的平均檢出水平明顯提高。由此可見(jiàn)酸解試劑優(yōu)化的必要性。

表1 不同酸解條件下MQCA的檢出水平Tab.1 Detection level of MQCA under different acidolysis conditions

2.3 凈化試劑的優(yōu)化

水產(chǎn)品中含有豐富的維生素、糖類(lèi)、色素、蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)，基質(zhì)復(fù)雜[2,6,19]，且育苗水體中含有微生物制劑，水質(zhì)粘性大，苗種體表清洗不徹底，導(dǎo)致樣品化學(xué)成分復(fù)雜，乳化現(xiàn)象比較嚴(yán)重，基質(zhì)效應(yīng)增加。為有效解決這一問(wèn)題，本研究用純水飽和正己烷對(duì)樣品進(jìn)行凈化，在去除脂溶性雜質(zhì)的同時(shí)將水溶性雜質(zhì)一并去除，達(dá)到良好的凈化效果，以提高方法靈敏度和準(zhǔn)確性。用MQCA陰性樣品添加10.0 μg/kg加標(biāo)水平，分別用正己烷試劑和純水飽和正己烷去脂，每種去脂方式設(shè)3組平行，分別計(jì)算平均檢出水平。結(jié)果如表2顯示，用飽和正己烷去脂的樣品檢出濃度較高，基質(zhì)效應(yīng)明顯降低，方法準(zhǔn)確度和靈敏度得到提高。

表2 不同去脂條件MQCA檢出水平比對(duì)Tab.2 Comparison of MQCA detection levels under different degreasing conditions

2.4 酸解條件的優(yōu)化

在HCl溶液固定濃度為4 mol/L的試驗(yàn)條件下，本試驗(yàn)考察了不同HCl溶液添加量對(duì)樣品中MQCA回收率的影響。稱(chēng)取4種不同基質(zhì)陰性樣品，均添加10.0 μg/kg加標(biāo)水平，每種基質(zhì)樣品3組平行，HCl溶液添加量為1.0 mL條件下，做加標(biāo)回收試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，刺參苗種的回收率為74.3%，其準(zhǔn)確度滿足食品中禁用藥物的質(zhì)量控制要求[21]，中國(guó)對(duì)蝦苗種和牙鲆苗種的回收率處于合格范圍最低限值(60%)附近，三疣梭子蟹苗種回收率最低，只達(dá)到40.3%，考慮蟹殼、蝦殼和魚(yú)骨中的CaCO3成分與HCl溶液發(fā)生反應(yīng)，影響了酸解效果。后續(xù)又將4種不同基質(zhì)陰性樣品分別稱(chēng)取5組，每組3個(gè)平行，均添加10.0 μg/kg加標(biāo)水平。分別添加HCl溶液1.10、1.20、1.30、1.40和1.50 mL。如圖1所示，在1.10～1.40 mL范圍內(nèi)，刺參苗種回收率依然無(wú)明顯變化，其他3種苗種的平均回收率隨著HCl溶液的增加而提高，1.40 mL時(shí)達(dá)到最大值；HCl溶液添加量為1.50 mL時(shí)，回收率與1.40 mL相比無(wú)明顯差異。最終確定該方法HCl溶液的添加量為1.40 mL。

圖1 HCl溶液不同添加量對(duì)MQCA回收率的影響Fig.1 Effect of different addition amount of HCl solution on MQCA recovery

2.5 線性范圍及檢出限

用本研究所建立的方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，采用試劑盒提供的MQCA標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并使用試劑盒專(zhuān)業(yè)分析軟件進(jìn)行定量分析，在0.400～32.400 μg/kg范圍內(nèi)，MQCA呈良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=-18.193ln(x)+37.074，相關(guān)系數(shù)R2=0.996?？紤]到漁業(yè)監(jiān)管部門(mén)規(guī)定水產(chǎn)品中OLA殘留限量為50.000 μg/kg，本研究將標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高點(diǎn)質(zhì)量濃度配制為60.0 μg/kg。結(jié)果表明，該方法MQCA在0.400 ～ 60.000 μg/kg范圍內(nèi)依然呈良好的線性關(guān)系。在4種不同基質(zhì)陰性樣品中添加MQCA標(biāo)準(zhǔn)溶液，在曲線最低濃度做加標(biāo)回收試驗(yàn)，其回收率和精密度均能滿足質(zhì)量控制要求[21]。該方法樣本稀釋倍數(shù)為2倍，根據(jù)結(jié)果，確定此方法MQCA檢出限為0.400 μg/kg，中國(guó)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)對(duì)水產(chǎn)品中OLA和MQCA的檢出限分別為50.000 μg/kg[22]和4.000 μg/kg[15,17]，表明該方法的靈敏度較高，優(yōu)于現(xiàn)行有效標(biāo)準(zhǔn)，能滿足檢測(cè)要求。

2.6 回收率與精密度

考慮到本方法只是篩選方法，陽(yáng)性樣品還需用原農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-5-2008[15]規(guī)定的HPLC法進(jìn)行確證，以4種不同基質(zhì)MQCA陰性樣品作為空白基質(zhì)，分別進(jìn)行4.00、8.00和40.00 μg/kg的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平設(shè)6組平行。按1.3對(duì)樣品進(jìn)行提取和測(cè)定，各基質(zhì)樣品的加標(biāo)回收率均在71.4%～95.7%之間，精密度范圍為3.9%～7.9%(表3)，3個(gè)不同加標(biāo)水平均能滿足回收率在60.0%～120.0%、精密度≤15.0%[21]的質(zhì)量控制要求。

表3 MQCA加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of adding standard recoveryand precision tests of MQCA n=6

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

考慮到OLA及其MQCA在動(dòng)物體內(nèi)吸收、代謝、轉(zhuǎn)化過(guò)程均需要一定的時(shí)間，試驗(yàn)開(kāi)始前，分別培育4種不同基質(zhì)苗種陽(yáng)性樣本作為試驗(yàn)對(duì)象，每種基質(zhì)樣品均稱(chēng)取2組，每組3個(gè)平行，分別用上述方法和HPLC法[15]進(jìn)行測(cè)定。由試驗(yàn)結(jié)果(表4)得知，2種方法結(jié)果均為陽(yáng)性，且相對(duì)偏差范圍為5.7～14.9，滿足實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范要求[15]。與HPLC法相比，ELISA法前處理操作步驟簡(jiǎn)單，上機(jī)時(shí)間明顯縮短，能夠較好地滿足提高漁業(yè)質(zhì)量安全監(jiān)管部門(mén)執(zhí)法時(shí)效性的需要。

表4 ELISA法和HPLC法測(cè)定MQCA結(jié)果比對(duì)Tab.4 Comparison of ELISA and HPLC results of MQCA

3 結(jié)論

本研究在MQCA酶聯(lián)免疫反應(yīng)試劑盒的基礎(chǔ)上，對(duì)前處理過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，通過(guò)采取HCl溶液替代H2SO4溶液、純水飽和正己烷脫脂除雜等措施優(yōu)化樣品前處理技術(shù)，建立了一種測(cè)定不同基質(zhì)水產(chǎn)苗種中MQCA殘留的檢測(cè)方法，以期為水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管部門(mén)的快速執(zhí)法提供技術(shù)支撐。通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證和實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果得知，中國(guó)對(duì)蝦苗種、三疣梭子蟹苗種、刺參苗種、牙鲆苗種4種不同基質(zhì)樣品在0.400～60.000 μg/kg加標(biāo)水平范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.996，4.00、8.00和40.00 μg/kg 3個(gè)不同加標(biāo)水平回收率為71.4%～95.7%，精密度為3.9%～7.9%，方法的準(zhǔn)確度與精密度均滿足藥物殘留分析的要求[21]。該方法具有前處理過(guò)程簡(jiǎn)單快速、結(jié)果可靠、適用性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于多品種、大批量水產(chǎn)苗種中MQCA殘留的快速批量篩查，有效解決了檢測(cè)結(jié)果滯后、執(zhí)法時(shí)效性差等問(wèn)題。運(yùn)用靈敏度高、特異性強(qiáng)的酶聯(lián)免疫法對(duì)大批量樣品進(jìn)行定性、定量盲篩，后續(xù)結(jié)合大型精密儀器對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行確證，能夠較好的滿足漁業(yè)質(zhì)量安全監(jiān)管部門(mén)的需要，是目前水產(chǎn)苗種質(zhì)量安全監(jiān)督抽查中值得推廣的方法。