山荷復(fù)合酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化

陳 芳，瞿昊宇，陳俁禎，蔣 星，田 慧，謝夢洲

(1湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙 410208；2湖南省藥食同源功能性食品工程技術(shù)研究中心，長沙 410208；3中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點實驗室，長沙 410208；4湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)心肺病證辨證與藥膳食療重點研究室，長沙 410208)

酵素是指選取一種或多種新鮮水果、蔬菜、食用菌、中草藥為基礎(chǔ)原料，經(jīng)乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等多種有益菌發(fā)酵而使原材料的生物活性增強或產(chǎn)生新的生物活性物質(zhì)[1-2]。在中國，至少有41.9%的成年人患有高脂血癥[3-4]。關(guān)于具有降血脂功能的藥食同源中藥酵素方面的研究鮮有報道。山楂荷葉復(fù)合酵素處方來自湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥膳學(xué)及藥食同源功能性食品研究專家謝夢洲教授創(chuàng)制的藥食同源中醫(yī)藥膳方[5]，由山楂、山藥、茯苓、荷葉、甘草5味具有降血脂功能的藥食同源中藥組成[6-8]，前期研究[9]發(fā)現(xiàn)，本方發(fā)酵前后都有降血糖作用，但發(fā)酵前后降血脂的活性成分是否發(fā)生改變尚未得知。為闡明發(fā)酵前后對降血脂活性成分的影響及發(fā)酵的意義，本試驗以山楂、荷葉等5味藥食同源中藥為主要原料，雙歧桿菌為發(fā)酵菌種，以降血脂活性成分荷葉堿、熊果酸、金絲桃苷為評價指標(biāo)，HPLC測定荷葉堿、熊果酸、金絲桃苷的含量，通過正交試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝，95%可信區(qū)間重疊法統(tǒng)計分析比較本品發(fā)酵前后荷葉堿、熊果酸、金絲桃苷含量的差異，為本品開發(fā)成輔助降血脂作用的功能性食品提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 材料與試劑

山楂(批號：191203831)、荷葉(批號：20200510)、甘草(批號：20200105)、山藥(批號：191204751)、茯苓(20191226)藥材飲片,購自康美藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)本校藥學(xué)院王智老師鑒定符合2015版《中國藥典》(一部)有關(guān)規(guī)定；雙歧桿菌SC13111121013377,北京川秀科技有限公司。甲醇(99.9%色譜純HPLC)、乙腈(99.9%色譜純HPLC)，Tedia Company；甲醇(99.9%質(zhì)譜純LC-MS)、乙腈(99.9%質(zhì)譜純LC-MS)，OCEANPAK；無水葡萄糖對照品，購于上海沃凱生物技術(shù)有限公司(批號：20080415)；試劑均為分析醇。苯酚，廣東光華科技股份有限公司(批號：20160701)；硫酸,株洲市星空化玻有限責(zé)任公司有限公司(批號：20171120)；乙醇,上海沃凱生物技術(shù)有限公司(批號：20180413)；實驗室用水為純化水。

1.2 儀器與設(shè)備

GI54DWS高溫高壓滅菌鍋,致微(廈門)儀器有限公司；JFHB-55YT發(fā)酵罐,榮華儀器制造有限公司；ZWL-PAI-10超純水機,湖南中沃水務(wù)環(huán)?？萍?；ATX124電子天平型124～0.000 1 g,東京島津儀器有限公司；KM5200DE超聲波清洗器,昆山美美超聲儀器；SHH.W21電熱三用水箱,北京中興偉業(yè)儀器；U3000液相色譜儀，德國賽默飛；BCD-610W冰箱，(西門子)博西華家用電器有限公司；電熱恒溫水浴鍋DIKW-S-6，北京市永光明醫(yī)療儀器；N-3010 10L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，日本東京理化；SCIENTZ-10N冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份；HNYC-203T智能恒溫培養(yǎng)振蕩器，天津歐諾儀器股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 山楂荷葉復(fù)合酵素發(fā)酵前樣品的制備

取山楂、荷葉、甘草混勻，加入70%乙醇浸泡后回流提取2次，過濾，合并濾液，50 ℃減壓濃縮至無醇味；山藥、茯苓混勻，加水浸泡提2次，過濾，濾液與醇提濃縮液合并，50 ℃減壓濃縮至每mL相當(dāng)于藥材2 g，-80 ℃冰箱保存。

2.2 高效液相色譜法測定山楂荷葉酵素中荷葉堿、金絲桃苷、熊果酸的含量

2.2.1 山楂荷葉酵素供試品溶液的制備 將各山楂荷葉復(fù)合酵素樣品用0.22 μm有機微孔濾膜過濾，即得各山楂荷葉復(fù)合酵素供試液。

2.2.2 荷葉堿、金絲桃苷空白對照溶液的制備 取甲醇溶液，用0.22 μm有機微孔濾膜濾過，即得空白對照液。

2.2.3 荷葉堿、金絲桃苷對照品溶液的制備 取荷葉堿、金絲桃苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含荷葉堿濃度為17.33 μg/mL、金絲桃苷濃度為21.64 μg/mL的對照品溶液，即得荷葉堿對照液、金絲桃苷對照液。

2.2.4 荷葉堿、金絲桃苷含量測定的色譜條件 采用高效液相色譜法(參考2020版《中國藥典》第四部通則0512)測定山楂荷葉酵素中荷葉堿、金絲桃苷含量。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(月旭科技上海股份有限公司，Ultimate XB-C18型色譜柱，5 μm，4.6×250 mm)；以乙腈為流動相A、以甲醇為流動相B、以0.001%磷酸水溶液為流動相C；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；荷葉堿、金絲桃苷檢測波長為270 nm。按表1中的設(shè)定進行梯度洗脫。

表1 荷葉堿、金絲桃苷色譜測定條件

2.2.5 荷葉堿、金絲桃苷測定方法 分別精密吸取空白對照液、荷葉堿對照液5 μL、金絲桃苷對照液5 μL注入高效液相色譜儀，測定，即得，結(jié)果見圖1～圖5。

圖1 空白對照液色譜圖

圖2 荷葉堿對照液色譜圖

圖3 金絲桃苷對照液色譜圖

圖4 復(fù)合酵素發(fā)酵前荷葉堿、金絲桃苷色譜圖

圖5 復(fù)合酵素發(fā)酵后荷葉堿、金絲桃苷色譜圖

2.2.6 熊果酸空白對照溶液的制備 同2.2.2。

2.2.7 熊果酸對照品溶液的制備 取熊果酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含熊果酸濃度為430.0 μg/mL的對照品溶液，即得熊果酸對照液。

2.2.8 熊果酸含量測定的色譜條件 采用高效液相色譜法(參考2020版《中國藥典》第四部通則0512)測定山楂荷葉復(fù)合酵素中熊果酸含量。色譜條件：同2.2.4，熊果酸檢測波長為215 nm；按表2中的設(shè)定進行梯度洗脫。

表2 熊果酸含量測定色譜條件

2.2.9 熊果酸測定方法 精密吸取上述空白對照液、熊果酸對照液山楂荷葉酵素供試液各20 μL、注入高效液相色譜儀，測定，即得，結(jié)果見圖6～圖8。

圖6 熊果酸對照液色譜圖

圖7 山楂荷葉復(fù)合酵素發(fā)酵前熊果酸色譜圖

圖8 山楂荷葉復(fù)合酵素發(fā)酵后熊果酸色譜圖

2.3 山楂荷葉復(fù)合酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.3.1 山楂荷葉復(fù)合酵素發(fā)酵基本工藝 將2.1中山楂、荷葉等5味中藥濃縮液解凍，置高壓滅菌鍋中，121 ℃，滅菌20 min，置無菌室內(nèi)，分成9份，每份200 mL，按表3設(shè)計加入一定量的雙歧桿菌菌粉，按一定溫度、時間、轉(zhuǎn)速為180 r/min條件下進行發(fā)酵，將發(fā)酵液于50 ℃、30 r/min、30 hPa條件下減壓濃縮至藥材：濃縮液=2∶1，再冷凍干燥成干浸膏粉，測定荷葉堿、熊果酸、金絲桃苷含量。

2.3.2 山楂、荷葉復(fù)合酵素的發(fā)酵工藝正交設(shè)計試驗 選取對發(fā)酵工藝影響較大的接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間等3個因素進行考察，每個因素取3個水平，HPLC測定山楂荷葉復(fù)合酵素中荷葉堿、金絲桃苷、熊果酸含量，發(fā)酵工藝因素水平見表3、正交設(shè)計安排見表4、因素間方差分析見表5、對因素間有統(tǒng)計意義則進行水平間方差分析見表6。以荷葉堿百分含量為評價指標(biāo)：C因素應(yīng)取3水平，即發(fā)酵時間72 h；A、B因素水平可任意取值。以熊果酸百分含量為評價指標(biāo)：C因素應(yīng)取3水平，即發(fā)酵時間72 h；A、B因素水平可取任意值,考慮經(jīng)濟效益，取A、B因素皆為1水平，即接種量5%、發(fā)酵溫度31 ℃。綜上所述，山楂、荷葉復(fù)合酵素的最優(yōu)發(fā)酵工藝是接種量為發(fā)酵液體積的5%、發(fā)酵溫度31 ℃、發(fā)酵時間72 h。

表3 山楂、荷葉復(fù)合酵素的發(fā)酵工藝因素水平

表4 發(fā)酵工藝正交設(shè)計試驗荷葉堿、金絲桃苷、熊果酸測定結(jié)果

表5 發(fā)酵工藝正交設(shè)計試驗荷葉堿、熊果酸、金絲桃苷因素間方差分析表

表6 發(fā)酵工藝正交設(shè)計試驗荷葉堿、熊果酸水平間方差分析

2.3.3 山楂荷葉復(fù)合酵素發(fā)酵工藝驗證試驗結(jié)果 取山楂、荷葉等5味藥食同源中藥三批(批號為：20210322、20210326、20210330)，每批1.0 kg，按2.1法制備濃縮液，加入菌粉量為濃縮液體積的5%，在31 ℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min的條件下發(fā)酵72 h，將發(fā)酵液于50 ℃、30 r/min，30 hPa條件下減壓濃縮至藥材：濃縮液=2∶1，再冷凍干燥成干浸膏粉，發(fā)酵工藝驗證結(jié)果接近正交設(shè)計試驗安排表中的最高值，表明此工藝科學(xué)、合理、穩(wěn)定、可行。

2.3.4 山楂荷葉復(fù)合酵素發(fā)酵前后荷葉堿、熊果酸、金絲桃苷含量對比分析 將山楂荷葉復(fù)合酵素發(fā)酵前的濃縮液(藥材∶濃縮液=2∶1)冷凍干燥成干浸膏粉，測得荷葉堿、熊果酸、金絲桃苷含量，與發(fā)酵后樣品(發(fā)酵工藝驗證樣品)含量進行對比分析。由表7可知，山楂荷葉復(fù)合酵素發(fā)酵前后各降血脂活性成分含量的95%可信區(qū)間未重疊，差別有統(tǒng)計意義，發(fā)酵后樣品中荷葉堿含量是發(fā)酵前樣品中荷葉堿含量的2.031倍。發(fā)酵后樣品中金絲桃苷的含量是發(fā)酵前樣品中金絲桃苷含量的2.014倍。發(fā)酵后樣品中熊果酸含量是發(fā)酵前樣品中熊果酸含量的3.137倍。

表7 山楂荷葉復(fù)合酵素發(fā)酵前后各降血脂活性成分測定結(jié)果及95%可信區(qū)間

3 結(jié)論與討論

雙歧桿菌作為有益的微生物[10-11]，被制成菌粉廣泛應(yīng)用于食品、保健品和藥品等領(lǐng)域，具有安全無毒、發(fā)酵工藝成熟、便于掌握的特點，且發(fā)酵后的含量明顯增加，說明功能成分含量和菌種有很大關(guān)系。本試驗選用雙歧桿菌作為發(fā)酵菌種，由于雙歧桿菌產(chǎn)品說明書中對發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、加菌量尚未明確說明，且說明書中給出的使用參數(shù)范圍太寬、不具體、不可控，為了得到最佳發(fā)酵參數(shù)，故需進行發(fā)酵工藝優(yōu)化，使發(fā)酵產(chǎn)品達到最優(yōu)功效。本試驗以荷葉堿、熊果酸、金絲桃苷為評價指標(biāo)，利用雙歧桿菌進行發(fā)酵。通過對復(fù)合酵素發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，得到了復(fù)合酵素發(fā)酵工藝條件：接種量為待發(fā)酵液體積的5%、發(fā)酵溫度為31 ℃、發(fā)酵時間為72 h。在此優(yōu)化的發(fā)酵工藝條件下，山楂荷葉復(fù)合酵素樣品中荷葉堿含量為0.045 1%、熊果酸含量高達3.630 9%、金絲桃苷含量高達0.042 3%。本研究發(fā)現(xiàn)，通過雙歧桿菌發(fā)酵制作的復(fù)合酵素中降血脂活性成分荷葉堿、熊果酸、金絲桃苷含量比發(fā)酵前顯著增加，意味著增強了本品降血脂的功能，為將本品開發(fā)成具有輔助降血脂功能的保健食品提供理論依據(jù)。

目前，“藥食同源”酵素改善機體降血脂功能的評價指標(biāo)較單一，缺乏相關(guān)調(diào)控信號通路和作用機制的研究，且“藥食同源”酵素多為復(fù)方配伍，其作用途徑和作用靶點并非單一而是多靶點結(jié)合。因此，在今后的研究中還應(yīng)尋求關(guān)鍵作用靶點以及不同靶點之間的協(xié)同作用，同時也可以利用液相色譜、氣相色譜和核磁共振等技術(shù)分析“藥食同源”酵素中活性物質(zhì)的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，進一步明確有效功能因子。