重組蛋白PFKFB3 的表達(dá)、純化及酶活測定

麥瑋倩 鄭慜成 周亞琪 劉志平 洪梅 許潔安

腫瘤細(xì)胞代謝的研究是近年腫瘤領(lǐng)域的研究熱點之一［1,2］。研究發(fā)現(xiàn)大部分的腫瘤促進(jìn)因子或抑制因子直接影響腫瘤細(xì)胞代謝分子。其中糖酵解分子的表達(dá)、活性及調(diào)控對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、消退起著至關(guān)重要的作用［3,4］。在腫瘤細(xì)胞增殖過程中,糖酵解所涉及的分子,包括轉(zhuǎn)運分子、關(guān)鍵酶及限速酶,都成為新的抗腫瘤藥物靶點。相應(yīng)的,以腫瘤細(xì)胞代謝為靶向的新藥研發(fā)也成為當(dāng)今新型抗腫瘤藥物研發(fā)的主要方向之一。

6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-雙磷酸酶(PFKFB)分子是目前受明顯關(guān)注的影響腫瘤代謝的一組分子［5］。PFKFB 是控制果糖-2,6-二磷酸(F-2,6-BP)水平的家族性雙功能酶［6］。這類酶的N 端能在F-6-P與ATP 存在的條件下合成F-2,6-BP。相反的,PFKFB也能在果糖-2,6-二磷酸酶C 端作用下催化上述反應(yīng)的逆反應(yīng),即F-2,6-BP 水解為F-6-P 和無機正磷酸鹽。在葡萄糖的代謝過程中,6-磷酸果糖-1-激酶(PFK-1)催化F-6-P 轉(zhuǎn)變成果糖-1,6-二磷酸(F-1,6-BP)是關(guān)鍵的限速步驟。而PFKFB 的產(chǎn)物F-2,6-BP是PFK-1 最強的激活劑。因此,抑制PFKFB 的表達(dá)或活性進(jìn)而降低F-2,6-BP 水平,可顯著抑制PFK1 的活性,進(jìn)而抑制細(xì)胞糖代謝,最終抑制細(xì)胞的增殖［7］。相應(yīng)地,調(diào)節(jié)PFKFB 及F-2,6-BP 的水平可以抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

哺乳動物的PFKFB 有4 種異構(gòu)體,其中PFKFB3是目前與腫瘤最相關(guān)的PFKFB 靶標(biāo)［8,9］。PFKFB3 編碼的6-磷酸果糖-2-激酶(PFK2)激酶活性較其磷酸酶活性高700 余倍,而由PFKFB1、2、4 編碼的PFK2其激酶活性比其磷酸酶活性稍高或兩者活性相當(dāng)［6］。無論是實驗性的離體及在體腫瘤生長,都需要PFKFB3存在［10,11］。很多來自人的腫瘤標(biāo)本中,與其相鄰近的正常細(xì)胞相比,腫瘤細(xì)胞中PFKFB3 的表達(dá)明顯增高,這些腫瘤包括膠質(zhì)瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌及卵巢癌等［12］。

本研究在大腸桿菌中表達(dá)了PFKFB3 并通過Ni 柱親和層析和分子篩純化得到高質(zhì)量的重組蛋白,并測定其酶活性質(zhì),為人PFKFB3 功能研究和抑制劑開發(fā)奠定基礎(chǔ)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和試劑 原核表達(dá)載體pET-30b(+)、大腸桿菌(E.coli)DH5、E.coli BL21(DE3)菌株由本實驗室保存,限制性內(nèi)切酶購于Takara 公司,質(zhì)粒提取試劑盒購于天根生化科技有限公司。氯化鈉(NaCl,S7653),氫氧化鉀(KOH,P5958),3-(N-嗎啉)丙磺酸(MOPS,M1254),六水氯化鎂(MgCl2·6H2O,M2670),焦磷酸鈉(Na4P2O7,P8010),聚乙二醇6000(PEG6000,81255),聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100,T9284),二硫蘇糖醇(DTT,D9163),苯甲基磺酰氟(PMSF,P7626),甘油(V900122),F-6-P(F3627),ATP(A26209),磷酸丙糖的異構(gòu)化酶(TIM,T6258),甘油-3-磷酸脫氫酶(GDH,G6880),醛縮酶(Aldolase,A8811),還原型輔酶Ⅰ(NADH,N8129),IPTG、溶菌酶、考馬斯亮藍(lán)R250、卡那霉素(Kan)購于Sigma 公司。乙二胺四乙酸(EDTA,15575-038)購于invitrogen 公司,β-巰基乙醇(0482)、三羥甲基氨基甲烷(Tris,0497)購于AMRESCO 公司,牛血清白蛋白(BSA,126579)購于CALBIOCHEM 公司,胰蛋白胨(LP0042)、酵母浸出粉(LP0021)購于英國OXOID 公司,蛋白酶抑制劑(DI101-02)購于全式金公司,Bradford 蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒購于Bio-Rad 公司,其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基的配置：胰蛋白胨10 g/L,酵母浸出粉5 g/L,氯化鈉10 g/L,加入1 L 雙純水溶解,高壓滅菌20 min。固體培養(yǎng)基是在上述培養(yǎng)基中加入2 g/L 的瓊脂。

1.1.3 PPi-PFK 參照Van 等［13］的報道,將土豆洗凈去皮,稱取100 g,加入300 ml 提取液(100 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA,5%甘油,7 mmol/Lβ-巰基乙醇,1 mmol/L PMSF,1×蛋白酶抑制劑,pH 值8.4),研磨,8層紗布過濾,4℃,30000 r/min離心30 min,留上清得粗提液,依次加入5%、10%、5% PEG6000,每次加入后攪拌溶解,冰浴30 min,4℃,30000 r/min,離心30 min,取上清液。分裝于2 ml 離心管,4℃,14000 r/min,離心30 min,棄去上清,保留沉淀,此沉淀即為PPi-PFK。真空泵吸干離心管內(nèi)的液體,-20℃保存。使用前用1 ml的提取液重懸溶解沉淀后,4℃,14000 r/min,離心20 min,取上清液,然后用考馬斯亮藍(lán)法法測量蛋白濃度。

1.2 方法

1.2.1 PFKFB3 表達(dá)載體的構(gòu)建 以人PFKFB3 編碼序列為模板,使用生物信息學(xué)方法優(yōu)化設(shè)計PFKFB3的原核編碼序列,增強其在原核生物中的表達(dá)效能。用合成方法獲得優(yōu)化后的全長編碼序列,在其5'端及3'端分別插入NdeI 和XhoI 酶切位點,同時在5'端酶切位點加入6-His 表達(dá)標(biāo)簽序列,用于后續(xù)的蛋白純化工作。在基因3'端添加終止密碼子TAA。隨后將該脫氧核糖核酸(DNA)片段經(jīng)NdeI/XhoI 雙酶切后,插入pET-30b(+)載體,經(jīng)E.coli DH5 轉(zhuǎn)化、篩選、擴增后獲得重組質(zhì)粒,經(jīng)測序分析后獲得陽性克隆pET-30b(+)-PFKFB3。

1.2.2 PFKFB3 的誘導(dǎo)表達(dá) 接種pET-30b(+)-PFKFB3 轉(zhuǎn)化的E.coli BL21(DE3)單克隆于含有50 ml LB 液體培養(yǎng)基的250 ml 三角瓶中于37℃,180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。次日將過夜培養(yǎng)物以1%的量接種于新的含有600 ml LB 液體培養(yǎng)基的2 L 三角瓶中,于37℃,180 r/min 培養(yǎng)至OD600 達(dá)到0.6～0.8,加入IPTG至終濃度25 μg/ml,于16℃,140 r/min 繼續(xù)培養(yǎng)16 h。8500 r/min,4℃離心15 min 收集菌體沉淀。沉淀用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌2 次,每次洗后均以5000 r/min,4℃,離心30 min。1 g 菌體加入20 ml 裂解液(含200 μl PMSF,20 μl 蛋白酶抑制劑,8 μl β-巰基乙醇)。冰浴超聲破碎菌體,設(shè)置超聲波細(xì)胞破碎機為轉(zhuǎn)5 s,停5 s,功率60%,運行1 h,35 000 r/min 離心后分別收集上清和沉淀。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白電泳,考馬斯亮藍(lán)R250 染色后觀察結(jié)果。

1.2.3 PFKFB3 重組蛋白的純化 先用含有10 mmol/L咪唑的PBS 10 ml 平衡Ni 柱,使之帶有電荷,再封住Ni 柱底端。加入5 ml 含10 mmol/L 咪唑的PBS 使Ni柱重懸,將此重懸液加入到蛋白溶液中,4℃緩慢旋轉(zhuǎn)30～60 min,使Ni 柱吸附His-PFKFB3 蛋白。然后倒入Ni 柱,使廢液流出。然后依次用含20、50 mmol/L 咪唑的PBS 100 ml 洗清Ni 柱,收集濾液置于冰上。再依次用含200、500 mmol/L 咪唑的PBS 5 ml 洗脫Ni 柱,此時洗脫下來的蛋白為PFKFB3 蛋白,將經(jīng)過Ni 親和層析純化后的蛋白,進(jìn)一步經(jīng)過分子篩再次進(jìn)行純化,純化后保存于含1 mmol/L DTT 的PBS 中,考馬斯亮藍(lán)法測量其蛋白濃度。

1.2.4 PFKFB3 酶活測定 PPi-PFK 酶活分析方法通過測定NADH 在340 nm 處的損耗量和反應(yīng)速率,來反映PFKFB3 的酶活性。此分析方法分為兩步：第一步,F-6-P 和ATP 在PFKFB3 的作用下生成F-2,6-BP,反應(yīng)液 組分如 下：50 μmol/L F-6-P,50 μmol/L ATP,2 mmol/L MgCl2,1 mmol/L DTT,2 nmol/L PFKFB3,MOPS-NaCl 緩沖液(40 mmol/L MOPS,150 mmol/L NaCl,100 μmol/L EDTA,0.01% Triton X-100,0.5 mg/ml BSA,pH 值7.5)補足到100 μl,在37℃下孵育60 min,10 μl 1 mol/L KOH 終止反應(yīng)。第二步,測定NADH 的消耗量,其與第一步反應(yīng)生成的F-2,6-BP 的量呈正相關(guān),反應(yīng)液組分如下：1 mmol/L F-6-P,0.7 U/ml Aldolase,0.45 U/ml GDH,0.6 U/ml TIM,2 mmol/L MgCl2,5 mmol/L DTT,0.2 mmol/L NADH,5 μg PPi-PFK,Tris-HCl 緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl,pH 值7.5)補足到150 μl,再加入2 μl 第一步反應(yīng)液,最后加入3 μl 25 mmol/L Na4P2O7啟動反應(yīng),并立即在酶標(biāo)儀檢測NADH 消耗速率。反應(yīng)溫度為37℃,測定間隔為30 s,檢測波長為340 nm,運行時間為30 min,測得平均反應(yīng)速度(Mean V)數(shù)值,用GraphPad Prism 軟件計算PFKFB3 的Km 值。

2 結(jié)果

2.1 人PFKFB3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 通過基因全合成的方法,得到了優(yōu)化后的編碼人PFKFB3 基因的全長DNA。隨后,將該DNA 產(chǎn)物經(jīng)NdeI 和XhoI 雙酶切處理,連接至同樣經(jīng)過雙酶切處理的載體質(zhì)粒,經(jīng)E.coli DH5 轉(zhuǎn)化、篩選、擴增后,最終獲得了用于原核表達(dá)的pET30b(+)-PFKFB3 質(zhì)粒,經(jīng)測序顯示該質(zhì)粒正確。

2.2 人PFKFB3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 誘導(dǎo)原核表達(dá)載體pET30b(+)-PFKFB3轉(zhuǎn)化的E.coli BL21(DE3) 菌株。收集大量表達(dá)pET30b(+)-PFKFB3 的菌體,使用超聲的方法破碎菌體。細(xì)菌裂解液沉淀經(jīng)SDS-PAGE 電泳分析,裂解菌液沉淀在55～70 ku 處無明顯的重組蛋白條帶。見圖1 泳道1。上清液經(jīng)過Ni 親和柱后,用含有20、50 mmol/L 咪唑的PBS 清洗液分別清洗柱子,SDS-PAGE 電泳檢測表明20、50 mmol/L 咪唑的PBS清洗液可以去除大部分雜蛋白。見圖1 泳道2～6。最后,用含有200、500 mmol/L 咪唑的PBS 洗脫液分別洗脫,SDS-PAGE 電泳檢測表明200、500 mmol/L 咪唑的PBS洗脫液可以得到粗純化后的重組蛋白PFKFB3。見圖1泳道7～9。同時重組蛋白PFKFB3 的分子量理論值為58 ku,表明重組蛋白PFKFB3 可以以較高的純度誘導(dǎo)表達(dá)。

2.3 人PFKFB3 重組蛋白的分離純化 考慮到在35 ku 和80 ku 處仍有比較明顯的蛋白雜帶(圖1 泳道7～9),因此,進(jìn)一步通過分子篩對蛋白PFKFB3 進(jìn)行純化。蛋白豐度圖譜結(jié)果表明,經(jīng)分子篩純化后,雜蛋白在PFKFB3 蛋白液中所占比例明顯減少,提高了重組蛋白PFKFB3 的純度。見圖2。經(jīng)過蛋白濃度測定,每升培養(yǎng)基可獲得10～20 mg PFKFB3 重組蛋白。

圖1 PFKFB3 經(jīng)Ni 柱親和層析純化后的SDS-PAGE 電泳圖

圖2 PFKFB3 蛋白純化后的蛋白豐度圖譜

2.4 人PFKFB3 重組蛋白的酶活測定 PFKFB3 的酶活分析采用PPi-PFK 分析方法,其中PPi-PFK 即糖酵解的第二個限速酶PFK1,該酶提取于剛發(fā)芽的土豆,可在-20℃保存1 周,提取物為淡黃色(見圖3 中2 號管),如果變成棕色,則PPi-PFK 酶活降低,需要重新制備(見圖3 中1 號管)。

圖3 PPi-PFK 的性狀

PPi-PFK 分析方法通過測定NADH 在340 nm 處的損耗量和反應(yīng)速率來反映經(jīng)PFKFB3 產(chǎn)生的F-2,6-BP的多少,經(jīng)PFKFB3 產(chǎn)生的F-2,6-BP 越多,NADH 的損耗量和反應(yīng)速率越大。1～6 nmol/L PFKFB3 的第一步反應(yīng)液梯度稀釋與NADH 的平均反應(yīng)速率顯示出良好的線性關(guān)系。該結(jié)果提示,在此條件下,可以進(jìn)行PFKFB3 酶活研究和PFKFB3 抑制劑篩選。見圖4。

圖4 PFKFB3 重組蛋白的酶活測定

Km 值是酶活研究中一個極為重要的數(shù)據(jù),是酶促反應(yīng)速度為最大速度1/2 時的底物濃度。PFKFB3 的底物有兩個,即F-6-P 和ATP。為了測定其Km 值,以7 種濃度梯度的F-6-P 或ATP 作為底物,加入相同的PFKFB3 重組酶進(jìn)行酶促反應(yīng)。以底物濃度的倒數(shù)1/S為橫坐標(biāo),以NADH 消耗速率的倒數(shù)1/V 為縱坐標(biāo),得到雙倒數(shù)曲線如圖5 所示,經(jīng)米氏方程計算得出,PFKFB3 底物F-6-P 的Km 值為142.5 μmol/L。見圖5a。PFKFB3 底物ATP 的Km 值為34.21 μmol/L。見圖5b。

圖5 PFKFB3 重組蛋白的F-6-P 和ATP 的Km 值測定

3 討論

本研究構(gòu)建了PFKFB3 的原核表達(dá)載體,通過大腸桿菌表達(dá)后,提取純化PFKFB3 蛋白并對其酶性質(zhì)進(jìn)行了測定。首先,在感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中轉(zhuǎn)入PFKFB3 原核質(zhì)粒,經(jīng)終濃度為25 μg/ml 的IPTG 誘導(dǎo),在16℃培養(yǎng)細(xì)菌過夜,表達(dá)PFKFB3 重組蛋白。冰上超聲破菌,離心收集蛋白,SDS-PAGE 電泳結(jié)果顯示,重組蛋白PFKFB3 主要存在于上清中。通過Ni 柱親和層析和分子篩純化蛋白,蛋白豐度圖譜結(jié)果顯示,PFKFB3 蛋白經(jīng)過Ni 柱親和層析和分子篩純化后,基本只有一個PFKFB3 的強吸收峰,純化效果良好。應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法測定PFKFB3 蛋白濃度為2～3 μg/μl,成功獲得了較高純度和濃度的PFKFB3 重組蛋白。進(jìn)一步的PFKFB3 酶活研究表明,在50 μmol/L F-6-P 的條件下,測出PFKFB3 對ATP 的Km 值為34.21 μmol/L。在50 μmol/L ATP 的條件下,測出PFKFB3 對F-6-P 的Km 值為142.5 μmol/L。

PFKFB3 已在腫瘤細(xì)胞中進(jìn)行了廣泛的研究,最近幾年,PFKFB3 的功能研究已經(jīng)延伸到血管細(xì)胞和免疫細(xì)胞,與血管生成、肺動脈高壓和膿毒血癥等疾病密切相關(guān)［14-17］。另外,在抑制劑方面,小分子PFKFB3抑制劑3PO 被廣泛應(yīng)用,但研究表明,3PO 與PFKFB3無法形成共結(jié)晶,提示3PO 不通過PFKFB3 來降低細(xì)胞糖酵解［18］。而最新的PFKFB3 抑制劑AZ 系列,如AZ26,其細(xì)胞半抑制濃度(IC50)低至0.281 μmol/L,但AZ26 在整體動物中的安全性評估還未見報道［18］。因此,重組蛋白PFKFB3 的成功獲得,可以為PFKFB3 結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)一步研究及抑制劑的篩選提供材料并奠定基礎(chǔ)。