豆粕替代魚粉并添加有機(jī)酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、免疫和腸道菌群的影響

趙錫蝶，鄭海玲，劉明明，湯雨，喬秀亭，劉群，黃宗海，程鎮(zhèn)燕*

(1.天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2.天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，天津 300402；3.天津農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津300384)

凡納濱對(duì)蝦Litopenaeusvannamei殼薄體肥、肉質(zhì)鮮美、含肉率高、營(yíng)養(yǎng)豐富，與斑節(jié)對(duì)蝦Penaeusmonodon和日本對(duì)蝦P.japonicus并稱為世界三大對(duì)蝦養(yǎng)殖品種[1]。近年來(lái)，隨著中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展，凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量持續(xù)增加，對(duì)飼料的需求也不斷上漲，作為飼料主要原料的魚粉和魚油，由于資源短缺、價(jià)格高，限制了其在飼料中的使用[2]，然而，當(dāng)用廉價(jià)而資源豐富的植物蛋白源替代魚粉時(shí)，養(yǎng)殖動(dòng)物的健康就會(huì)受到一定影響，尤其會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物腸道產(chǎn)生一些病理變化[3-4]。

近年來(lái)，有機(jī)酸作為一種高效、無(wú)污染、無(wú)殘留的保健型飼料添加劑，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中越來(lái)越受到歡迎。大量研究表明，有機(jī)酸能降低胃腸道的pH值，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化，從而提高飼料的利用率，并促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)[5]。此外，有機(jī)酸還能抗菌、抑菌，并能提高機(jī)體的抗氧化能力，提高魚蝦的免疫力、抗病能力[6-8]。林雪等[9]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)以檸檬酸和延胡索酸為主要成分的酸化劑，可顯著提高羅非魚血清T-AOC、ACP及AKP活性，提高了魚體的抗氧化性能和免疫功能, 增強(qiáng)了抗應(yīng)激能力，同時(shí)還能在檸檬酸和延胡索酸的協(xié)同作用下調(diào)節(jié)代謝過(guò)程，減少有害微生物對(duì)宿主的傷害。栗雄高[1]研究發(fā)現(xiàn)，在凡納濱對(duì)蝦飼料中添加0.2%～0.3%檸檬酸能促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)，提高消化酶活性和免疫功能，并通過(guò)促進(jìn)蝦腸道內(nèi)有益菌的繁殖抑制有害菌繁殖，使腸道菌群結(jié)構(gòu)向有益方面改變，促進(jìn)維生素、鈣等元素的吸收，從而提高了水產(chǎn)動(dòng)物的抗病能力和抵抗力。尚衛(wèi)敏等[10]發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加檸檬酸和乳酸可以提高草魚Ctenopharyngodonidellus血清超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和溶菌酶活性，提高草魚的抗氧化能力和免疫功能。羅玲等[7]和魏朝青等[8]均研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉可以提高團(tuán)頭魴Megalobramaamblycephala和大菱鲆Scophthalmusmaximus的抗氧化能力。Ring?[11]發(fā)現(xiàn)，在北極鮭Salvelinusalpinus日糧飼料中補(bǔ)充丙酸鈉可降低棕櫚酸含量，促進(jìn)生長(zhǎng)和消化。

本試驗(yàn)中，選取檸檬酸鈉、丁酸鈉、丙酸鈉和延胡索酸4種有機(jī)酸，研究了其對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、免疫和腸道健康的影響，以期為促進(jìn)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料

養(yǎng)殖試驗(yàn)在天津市西青區(qū)畜牧基地水產(chǎn)局養(yǎng)殖試驗(yàn)示范基地進(jìn)行，試驗(yàn)用凡納濱對(duì)蝦由試驗(yàn)基地提供。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)飼料制備 試驗(yàn)設(shè)正對(duì)照組(記為D0，含24%進(jìn)口魚粉和18%豆粕的基礎(chǔ)飼料，為高魚粉組)和負(fù)對(duì)照組(記為D1，含12%進(jìn)口魚粉和36%豆粕，為低魚粉組)，在負(fù)對(duì)照組飼料基礎(chǔ)上分別添加0.3%檸檬酸鈉、0.3%丁酸鈉、0.3%丙酸鈉和0.3%延胡索酸(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)，記為D2、D3、D4、D5，并以正對(duì)照組為參考補(bǔ)充賴氨酸和蛋氨酸，制成等氮等能的6種試驗(yàn)飼料。試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)成分水平見表1、表2(能量為計(jì)算值，其余為實(shí)測(cè)值)。飼料制作過(guò)程中，將所有飼料原料粉碎后過(guò)198 μm孔徑篩，然后加入魚油、磷脂、魷魚膏和蒸餾水，混合均勻后制成直徑為2 mm的硬性顆粒飼料，最后自然冷卻風(fēng)干后收放在密封袋中，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗(yàn)飼料原料組成Tab.1 Ingredients of the experimental diets w/%

表2 試驗(yàn)飼料營(yíng)養(yǎng)成分(干質(zhì)量)Tab.2 Nutrient content of experimental diets(dry mass)

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與養(yǎng)殖管理 選取大小均勻、體格健康的對(duì)蝦720尾隨機(jī)分成6組，每組設(shè)3個(gè)平行，共用18個(gè)網(wǎng)箱(100 cm×100 cm×150 cm)，每個(gè)網(wǎng)箱投放40尾試驗(yàn)蝦(體質(zhì)量為7.54 g±0.40 g)，養(yǎng)殖周期為42 d。養(yǎng)殖期間，水溫為24～30 ℃，pH為8.42～8.88，溶解氧為7.11～8.97 mg/L，亞硝酸鹽≤0.01 mg/L，氨氮≤0.2 mg/L。

1.2.3 樣品采集 養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)試驗(yàn)蝦禁食24 h，稱重計(jì)數(shù)。使用經(jīng)抗凝劑潤(rùn)洗過(guò)的1 mL無(wú)菌注射器從蝦頭胸甲腹竇采集血液樣本，置于2 mL含有EDTA-2Na的離心管中，以3 000 r/min離心10 min，取血清于-80 ℃超低溫冰箱中保存。于無(wú)菌環(huán)境中取出腸道內(nèi)容物置于凍存管中，液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2.4 生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定與計(jì)算 增重率(WGR，%)、特定生長(zhǎng)率(SGR，%/d)、飼料系數(shù)(FCR)計(jì)算公式分別為

WGR=(mt-m0)/W0×100%，

(1)

SGR=(lnmt-lnm0)/t×100%，

(2)

FCR=F/(mt-m0)。

(3)

其中：m0、mt分別為試驗(yàn)初始和終末凡納濱對(duì)蝦的總質(zhì)量(g)；F為養(yǎng)殖過(guò)程投餌干質(zhì)量(g)；t為養(yǎng)殖時(shí)間(d)。

1.2.5 血清抗氧化及免疫指標(biāo)測(cè)定 根據(jù)南京建成生物工程研究所相應(yīng)試劑盒操作說(shuō)明書檢測(cè)凡納濱對(duì)蝦血清酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LSZ)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。

1.2.6 腸道及內(nèi)容物多樣性測(cè)定 將凡納濱對(duì)蝦腸道內(nèi)容物在北京科學(xué)院微生物研究所基因組研究中心進(jìn)行測(cè)序分析。將檢測(cè)合格的微生物DNA樣本對(duì)其指定區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增、文庫(kù)制備、文庫(kù)質(zhì)檢、定量，使用設(shè)定的TAG序列進(jìn)行樣本區(qū)分。采用Illumina Hiseq 2500高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)檢測(cè)合格的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。基于優(yōu)化序列進(jìn)行OTU聚類分析和物種分類注釋，基于OTU聚類結(jié)果進(jìn)行多樣性指數(shù)分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 測(cè)序基本數(shù)據(jù)處理 采用Flash軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，拼接得到的序列采用Trimmomatic進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾，用UCHIME去除嵌合體，最終得到高質(zhì)量的Tags序列。在一致性97%的水平上對(duì)序列進(jìn)行聚類，以測(cè)序所有序列數(shù)的0.005%作為閾值過(guò)濾OTU。

1.3.2 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ± S.D.)表示。采用SPSS 19.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，再用Duncan 法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的變化

從表3可見：與正對(duì)照組(高魚粉組)相比，負(fù)對(duì)照組(低魚粉組)凡納濱對(duì)蝦的終末體質(zhì)量、增重率、特定生長(zhǎng)率均顯著降低(P<0.05)，飼料系數(shù)顯著升高(P<0.05)；而在負(fù)對(duì)照組基礎(chǔ)上，添加0.3%丁酸鈉與0.3%檸檬酸鈉，凡納濱對(duì)蝦的增重率和特定生長(zhǎng)率均顯著高于負(fù)對(duì)照組(P<0.05)，飼料系數(shù)顯著低于負(fù)對(duì)照組(P<0.05)，添加0.3%丙酸鈉和0.3%延胡索酸，凡納濱對(duì)蝦終末體質(zhì)量、增重率和特定生長(zhǎng)率與負(fù)對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)；添加有機(jī)酸后，丁酸鈉組終末體質(zhì)量、增重率和飼料系數(shù)與正對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但特定生長(zhǎng)率較正對(duì)照組顯著提高(P<0.05)，檸檬酸鈉組對(duì)蝦終末體質(zhì)量、特定生長(zhǎng)率與正對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。由此可見，添加檸檬酸鈉和丁酸鈉緩解了高豆粕替代魚粉造成的凡納濱對(duì)蝦增重率和特定生長(zhǎng)率的下降。

2.2 凡納濱對(duì)蝦血清抗氧化及免疫指標(biāo)的變化

從表4可見：與正對(duì)照組(高魚粉組)相比，負(fù)對(duì)照組(低魚粉組)凡納濱對(duì)蝦血清ACP、AKP、SOD、LSZ活性均顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)；與負(fù)對(duì)照組相比，添加0.3%檸檬酸鈉后，凡納濱對(duì)蝦血清ACP、AKP和LSZ活性均顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD活性呈現(xiàn)上升趨勢(shì)但無(wú)顯著性差異(P>0.05)；與負(fù)對(duì)照組相比，添加0.3%丁酸鈉后，血清ACP、SOD和LSZ活性顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)；與負(fù)對(duì)照組相比，添加0.3%丙酸鈉和0.3%延胡索酸后，AKP和SOD活性均顯著降低(P<0.05)，LSZ活性顯著升高(P<0.05)，丙酸鈉組MDA含量顯著降低(P<0.05)；添加有機(jī)酸后，除檸檬酸鈉和丁酸鈉組ACP外，各組ACP、AKP、SOD、LSZ酶活性均顯著低于正對(duì)照組(P<0.05)。

2.3 凡納濱對(duì)蝦腸道內(nèi)容物菌群微生物Alpha多樣性的變化

從表5可見：測(cè)序樣本中覆蓋率均大于99%，因而測(cè)序結(jié)果可代表凡納濱對(duì)蝦腸道內(nèi)容物中微生物的真實(shí)情況；各組凡納濱對(duì)蝦腸道內(nèi)容物的OTU數(shù)目、Chao1指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)(Shannon)和辛普森指數(shù)(Simpson)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；添加0.3%檸檬酸鈉和0.3%丁酸鈉后，OTU數(shù)目、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)值與正對(duì)照組內(nèi)容物菌群數(shù)值最相近，添加0.3%丙酸鈉和0.3%延胡索酸后，物種豐富度及物種多樣性均較正對(duì)照組升高，與負(fù)對(duì)照組接近。

2.4 凡納濱對(duì)蝦腸道內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 基于門水平的菌群結(jié)構(gòu)分析 各組腸道內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)在門水平上的組成如圖1所示，6個(gè)組的菌群在門水平上，主要由變形菌門Proteobacteria、藍(lán)藻門Cyanobacteria、放線菌門Actinobacteria、疣微菌門Verrucomicrobia、浮酶菌門Planctomycetes和厚壁菌門Firmicutes組成，相對(duì)豐度均達(dá)到94%以上，但是在各組所占比例有所不同。變形菌門、藍(lán)藻門、放線菌門、疣微菌門、浮酶菌門和厚壁菌門6個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門在正對(duì)照組的占比分別為46.72%、11.48%、12.24%、12.49%、10.40%、1.42%，在負(fù)對(duì)照組的占比分別為35.13%、18.28%、8.31%、18.01%、12.91%、2.19%，在檸檬酸鈉組的占比分別為38.09%、7.27%、33.53%、5.70%、7.61%、3.13%，在丁酸鈉組的占比分別為24.37%、21.88%、7.51%、26.37%、14.40%、1.19%，在丙酸鈉組的占比分別為28.73%、23.57%、9.62%、17.68%、14.44%、1.38%，在延胡索酸組的占比分別為33.09%、17.93%、19.88%、10.45%、10.94%、2.09%。與正對(duì)照組相比，負(fù)對(duì)照組放線菌門的相對(duì)豐度有所下降，而浮酶菌門和藍(lán)藻門的相對(duì)豐度有所上升。在負(fù)對(duì)照組中添加0.3%檸檬酸鈉后，浮酶菌門和藍(lán)藻門的相對(duì)豐度低于負(fù)對(duì)照組，放線菌門的相對(duì)豐度高于負(fù)對(duì)照組；添加0.3%丁酸鈉和0.3%丙酸鈉后，浮酶菌門和藍(lán)藻門的相對(duì)豐度高于負(fù)對(duì)照組和正對(duì)照組，放線菌門的相對(duì)豐度低于負(fù)對(duì)照組和正對(duì)照組；添加0.3%延胡索酸后，浮酶菌門的相對(duì)豐度低于負(fù)對(duì)照組，放線菌門和藍(lán)藻門的相對(duì)豐度高于負(fù)對(duì)照組和對(duì)照組。綜上，添加0.3%檸檬酸鈉和0.3%延胡索酸后，凡納濱對(duì)蝦的腸道內(nèi)容物物種豐度與正對(duì)照組相似。

2.4.2 基于科水平的菌群結(jié)構(gòu)分析 各組腸道內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)在科水平上的組成如圖2所示，豐度超過(guò)0.25%的菌科有15個(gè)，其中，主要優(yōu)勢(shì)種有軟骨桿菌科Chthoniobacterales、扁平菌科Planctomycetaceae、紅桿菌科Rhodobacteraceae、腸桿菌科Enterobacteriaceae、長(zhǎng)頸菜科Golenkinia longispicula和希氏藻科Shewanellaceae等。

圖2 凡納濱對(duì)蝦腸道內(nèi)容物基于科水平的菌群組成Fig.2 Composition of the microflora in intestinal contents of Pacific white leg shrimp micro florain Litopenaeus vannamei on family level

2.5 凡納濱對(duì)蝦腸道內(nèi)容物菌群差異性分析

2.5.1 腸道內(nèi)容物菌群相對(duì)豐度分布 用相對(duì)豐度的常用對(duì)數(shù)(logarithm of relative abundance，LDA)值統(tǒng)計(jì)不同組別中有顯著作用的微生物類群，柱狀圖長(zhǎng)度代表顯著差異物種的影響大小。如圖3所示，腸桿菌科在正對(duì)照組中顯著上調(diào)，漆草科Lachnospiraceae和未培養(yǎng)細(xì)菌unculturedbacterium在負(fù)對(duì)照組中顯著上調(diào)，雙歧桿菌科Bifidobacteriaceae在檸檬酸鈉組中顯著上調(diào)，梭桿菌科Fusobacteriaceae在丁酸鈉組中顯著上調(diào)，0319_6G20菌科在丙酸鈉組中顯著上調(diào)，類桿菌目Bacteroidales在延胡索酸組中顯著上調(diào)。這表明，添加不同的有機(jī)酸影響腸道菌群不同種類的豐度。

圖3 不同處理組對(duì)蝦腸道內(nèi)容物顯著差異菌群相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance of the significantly different microflora in the intestinal contents of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei in different treatment groups

2.5.2 在科水平上不同組的顯著差異菌群相對(duì)豐度比較 從表6可見：丁酸鈉組的梭桿菌科相對(duì)豐度高于其他組，但各組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；檸檬酸鈉組的雙歧桿菌科和類桿菌科相對(duì)豐度最高，且顯著高于其他組(P<0.05)；正對(duì)照組的腸桿菌科相對(duì)豐度最高，檸檬酸鈉組次之；負(fù)對(duì)照組的漆草科相對(duì)豐度分布最高，其次是檸檬酸鈉組。由此可見，添加0.3%檸檬酸鈉提高了腸桿菌、雙歧桿菌、類桿菌的組內(nèi)相對(duì)豐度，添加0.3%丁酸鈉提高了梭桿菌的相對(duì)豐度。

表6 豆粕替代魚粉并添加有機(jī)酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道內(nèi)容物顯著差異菌群科水平相對(duì)豐度的影響Tab.6 Effects of fish meal replaced by soybean meal and supplemented with different organic acids on the bacterial relative abundance in the significantly different microflora in the intestinal contents in Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei on family level

2.5.3 Dadogram進(jìn)化分支圖 Lefse進(jìn)化分支圖如圖4所示，其中，由內(nèi)至外輻射的圓圈代表了由門至屬的分類級(jí)別。在不同分類級(jí)別上的每一個(gè)小圓圈代表該水平下的一個(gè)分類，小圓圈直徑大小與相對(duì)豐度大小成正比。無(wú)顯著性差異的物種統(tǒng)一著色為黃色，差異物種跟隨組進(jìn)行著色，紅色節(jié)點(diǎn)表示在紅色組別中起到重要作用的微生物類群，綠色節(jié)點(diǎn)表示在綠色組別中起到重要作用的微生物類群，其他圈顏色意義類同。結(jié)果顯示，腸桿菌在正對(duì)照組發(fā)生富集，JG35_K1_AG5和漆草科菌在負(fù)對(duì)照組發(fā)生富集，雙歧桿菌在檸檬酸鈉組發(fā)生富集，梭桿菌在丁酸鈉組發(fā)生富集，0319_6G20菌科在丙酸鈉組發(fā)生富集，類桿菌在延胡索酸組發(fā)生富集，這與圖3顯示結(jié)果一致。

圖4 從門到屬的Lefse進(jìn)化分支圖Fig. 4 Lefse evolutionary branch diagram from phylum to genus

3 討論

3.1 飼料中添加有機(jī)酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響

有機(jī)酸在水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖飼料中起著誘食劑的作用，在魚蝦類飼料中添加有機(jī)酸能夠促進(jìn)魚蝦攝食，促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)[1]。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與正對(duì)照組(高魚粉組)相比，負(fù)對(duì)照組(低魚粉組)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)受到了抑制，而在負(fù)對(duì)照組基礎(chǔ)上添加0.3%檸檬酸和0.3%丁酸鈉后，凡納濱對(duì)蝦的特定生長(zhǎng)率和增重率均較負(fù)對(duì)照組顯著升高，飼料系數(shù)顯著降低，且與高魚粉的正對(duì)照組相比，0.3%丁酸鈉組凡納濱對(duì)蝦也體現(xiàn)出了生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。這表明，檸檬酸和丁酸鈉能夠緩解高豆粕對(duì)凡納濱對(duì)蝦帶來(lái)的生長(zhǎng)抑制，并有效促進(jìn)其生長(zhǎng)。與此相似，Liu等[12]研究表明，丁酸鈉不僅能改善魚類生長(zhǎng)性能，增加腸道吸收面積，而且能減輕固有層混合白細(xì)胞的浸潤(rùn)，證明有機(jī)酸對(duì)魚類腸道免受豆粕的損傷有積極作用，從而促進(jìn)魚類生長(zhǎng)。齊鑫等[13]、孫浪等[14]、張曉曉等[15]分別在鱘、湘云鯽、凡納濱對(duì)蝦飼料中添加丁酸鈉也出現(xiàn)相似結(jié)果。栗雄高[1]、潘慶等[16]、Sarker 等[17]和 Khajepour等[18]則在凡納濱對(duì)蝦、羅非魚、鯛和達(dá)氏鰉飼料中添加檸檬酸同樣出現(xiàn)相似結(jié)果。相關(guān)研究表明，延胡索酸(又稱富馬酸)也可作為飼料添加劑，張玲等[19]發(fā)現(xiàn)，添加0.6%以檸檬酸、磷酸、富馬酸為主要成分的酸化劑可顯著提高草魚特定生長(zhǎng)率，降低飼料系數(shù)。本試驗(yàn)中，低魚粉飼料中添加0.3%丙酸鈉和延胡索酸，凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能與負(fù)對(duì)照組無(wú)顯著性差異，這與石澤[20]在無(wú)魚粉飼料中添加富馬酸后對(duì)建鯉的生長(zhǎng)性能、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與粗蛋白質(zhì)消化率無(wú)顯著性影響的結(jié)果一致，潘慶等[21]對(duì)羅非魚的研究中也得出相似結(jié)果。而Bjerkeng 等[22]則報(bào)道飼料中添加乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉的混合物對(duì)大西洋鮭生長(zhǎng)性能無(wú)顯著影響。研究結(jié)果出現(xiàn)差異的原因，可能是由于添加有機(jī)酸鹽水平或者動(dòng)物種類不同，飼糧蛋白質(zhì)含量不同，酸的結(jié)合力就不同，消耗有機(jī)酸鹽的量也不同。

3.2 飼料中添加有機(jī)酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清抗氧化及免疫指標(biāo)的影響

凡納濱對(duì)蝦主要依靠非特異免疫系統(tǒng)防御病害因子，其中，最重要的免疫應(yīng)答因子有ACP、AKP、LSZ[6]。LSZ有殺菌、抗炎、抗病毒等作用，MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化與氧化損傷最重要的產(chǎn)物[23-24]，其含量反映了生物體的脂質(zhì)過(guò)氧化水平，其含量降低代表機(jī)體抗氧能力的提高[24]。SOD對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用。SOD和MDA都是表現(xiàn)機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)。Zhu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在植物蛋白源飼料中補(bǔ)充有機(jī)酸，能顯著降低黃鲇血清SOD和CAT活性以及肝臟中CAT活性，這表明，有機(jī)酸能保護(hù)魚體免受植物蛋白源引起的氧化損傷。本試驗(yàn)中，負(fù)對(duì)照組對(duì)蝦血清ACP、AKP、SOD、LSZ活性較正對(duì)照組均顯著降低，MDA含量顯著升高，說(shuō)明在飼料中添加過(guò)高含量的豆粕會(huì)降低凡納濱對(duì)蝦的非特異性免疫應(yīng)答，同時(shí)降低對(duì)蝦機(jī)體的抗氧化能力，造成對(duì)蝦免疫系統(tǒng)的失衡，從而影響對(duì)蝦的生長(zhǎng)與免疫能力，這與段晶等[26]的研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)中，在負(fù)對(duì)照組飼料基礎(chǔ)上添加0.3%檸檬酸鈉和0.3%丁酸鈉后，ACP、AKP、SOD、LSZ活性較負(fù)對(duì)照組均有升高，MDA含量降低，基本達(dá)到正對(duì)照組的水平，添加0.3%丙酸鈉后，MDA含量較負(fù)對(duì)照組顯著降低，甚至達(dá)到正對(duì)照組水平。這表明，在飼料中添加有機(jī)酸能夠延緩飼料的氧化，減少水產(chǎn)飼料的浪費(fèi)，且能緩解豆粕對(duì)凡納濱對(duì)蝦造成的機(jī)體損傷，降低因豆粕替代引起的MDA含量的增加，從而提高其抗氧化的能力和免疫功能，這與尚衛(wèi)敏等[10]、石澤[20]、張曉曉等[15]研究結(jié)果一致。

3.3 飼料中添加有機(jī)酸對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸道內(nèi)容物微生物菌群的影響

腸道內(nèi)容物菌群與對(duì)蝦腸道健康有著密切的關(guān)系。本試驗(yàn)中，在負(fù)對(duì)照組中添加0.3%檸檬酸鈉和0.3%丁酸鈉，腸道內(nèi)容物菌群的物種豐富度和多樣性與正對(duì)照組最相似，但添加0.3%丙酸鈉和0.3%延胡索酸物種豐富度及物種多樣性與負(fù)對(duì)照組接近。同時(shí)，檸檬酸鈉組和丁酸鈉組的飼料pH與正對(duì)照組最接近，丙酸鈉組的飼料pH較正對(duì)照組偏高，而延胡索酸組的飼料pH相比于正對(duì)照組偏低。這說(shuō)明腸道內(nèi)容物的菌群豐富度與多樣性可能與飼料pH有關(guān)。石澤[20]研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加有機(jī)酸鹽可造成飼料中pH在一定程度上有所降低，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，只有檸檬酸組的建鯉在攝食0.5 h后前腸食糜pH有降低的趨勢(shì)。而Su等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在凡納濱對(duì)蝦飼料中添加0.25%～0.30%的檸檬酸能提高腸道消化酶活性，從而改善其生長(zhǎng)性能。這表明，飼料pH可以影響腸道內(nèi)容物的pH，通過(guò)激活蛋白酶影響腸道內(nèi)容物的菌群變化，影響對(duì)蝦腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而影響對(duì)蝦的生長(zhǎng)，Gao等[28]的研究結(jié)果中也證實(shí)了有機(jī)酸對(duì)腸道菌群平衡具有積極作用。

有機(jī)酸還可以促進(jìn)腸道有益菌群的增殖，抑制有害菌的繁殖，進(jìn)而提高免疫能力。研究表明，有機(jī)酸和揮發(fā)油混合物對(duì)腸道菌群有較好的影響，可提高太平洋對(duì)蝦的免疫應(yīng)答和抗病性[29]。本試驗(yàn)中，各組在門水平上的菌群主要由變形菌門、藍(lán)藻門、放線菌門、疣微菌門、浮酶菌門、厚壁菌門組成，這與吳金鳳等[30]、李可等[31]的研究結(jié)果一致，證明凡納濱對(duì)蝦腸道內(nèi)容物菌群組成具有一定的保守性，藍(lán)藻門的豐度偏高可能是由于飼養(yǎng)環(huán)境為室外水體，對(duì)蝦的攝食并不完全來(lái)自養(yǎng)殖飼料，對(duì)蝦攝食水體中的藻類，使得對(duì)蝦腸道內(nèi)容物的多樣性增高。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，飼料中添加過(guò)高水平的豆粕降低了放線菌的豐度，在低魚粉水平下添加0.3%檸檬酸鈉后提高了放線菌的豐度，科水平上雙歧桿菌和類桿菌在檸檬酸鈉組發(fā)生富集且顯著高于正對(duì)照組，表明檸檬酸鈉促進(jìn)雙歧桿菌和類桿菌的增長(zhǎng)，這與王麗娜等[24]的研究結(jié)果一致，說(shuō)明檸檬酸鈉有利于雙歧桿菌和乳酸菌等有益菌的繁殖增長(zhǎng)，對(duì)大腸桿菌和沙門菌屬等有害菌具有抑制作用；梭桿菌在丁酸鈉組發(fā)生富集，其次是丙酸鈉組和延胡索酸組，表明丁酸鈉促進(jìn)梭桿菌的增殖，同時(shí)也表明添加不同的有機(jī)酸會(huì)影響腸道不同種類菌群的豐度，這與曾晨爔等[23]的研究結(jié)果相符；根瘤菌依附于植物生長(zhǎng)，在負(fù)對(duì)照組漆草科和根瘤菌顯著高于其他組，可能與負(fù)對(duì)照組中的藍(lán)藻門數(shù)量高有關(guān)。本試驗(yàn)中，腸道菌群的結(jié)果與生長(zhǎng)、免疫方面的結(jié)果體現(xiàn)了一致性，低魚粉飼料中添加檸檬酸鈉和丁酸鈉后不僅可以促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、提高抗病力，還可以調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡。

4 結(jié)論

1)本試驗(yàn)條件下，高比例豆粕替代魚粉后，凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)受到抑制，免疫力降低，優(yōu)勢(shì)菌群豐度下降，尤其以放線菌門最為突出。

2)高比例豆粕替代魚粉并添加有機(jī)酸后，凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、免疫力得到了不同程度的提高，并能改善腸道菌群的平衡。綜合分析，4種有機(jī)酸中以丁酸鈉和檸檬酸鈉添加效果最佳。