兩種劑量下恩諾沙星及其代謝物環(huán)丙沙星在虹鱒體內(nèi)的代謝殘留

于潤林，崔舒云，程波，張欣，康銅，穆迎春，韓剛，宋懌

(1.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實驗室，北京 100141；3.北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所，北京 100068)

恩諾沙星(enrofloxacin, ENR)是第三代喹諾酮類抗菌藥物，也是第一個動物專用的抗生素[1]。因其對大多數(shù)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌等均有抑制作用，且具有毒副作用小、抗菌力強(qiáng)、體內(nèi)分布廣等特點(diǎn)，《漁藥使用規(guī)范》(SC/T 1132—2016)將其列為水產(chǎn)養(yǎng)殖用處方藥之一[2]，并廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防控中[3]。ENR在動物體內(nèi)會發(fā)生脫乙基反應(yīng)，生成具有活性的代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星(ciprofloxacin, CIP)。CIP藥理作用類似ENR，因CIP存在明顯種屬差異，容易產(chǎn)生耐藥性且毒副作用強(qiáng)，《無公害食品漁用藥物使用準(zhǔn)則》(NY 5071—2002)已將其列為禁用漁藥?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》(GB31650—2019)將水產(chǎn)動物中ENR及其代謝產(chǎn)物CIP的總殘留限量定為100 μg/kg[4]。

虹鱒Oncorhynchusmykiss是全世界養(yǎng)殖最多的魚類之一[5]，也是中國重要水產(chǎn)養(yǎng)殖品種[6]。嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophila、魯氏耶爾森氏菌Yersiniaruckeri、惡臭假單胞菌Pseudomonasputida和熒光假單胞菌P.fluorescens等革蘭氏陰性菌感染虹鱒會導(dǎo)致敗血癥、腸口紅等疾病[7]，對虹鱒養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[5,8]。ENR被普遍用于虹鱒等魚類養(yǎng)殖生產(chǎn)中的病害防控和治療，但因缺乏代謝和殘留規(guī)律研究，加之隨意用藥現(xiàn)象普遍存在，導(dǎo)致養(yǎng)殖產(chǎn)品藥物殘留超標(biāo)事件時有發(fā)生[9-10]。藥物不合理使用,不僅影響水產(chǎn)品質(zhì)量安全，還會產(chǎn)生耐藥性,并對生態(tài)環(huán)境可持續(xù)發(fā)展造成影響[11-12]。目前，對羅非魚Oreochromisniloticus[13]、鯉Cyprinuscarpio[14-15]、克氏原螯蝦Procambarusclarkii[16]、大黃魚Larimichthyscrocea[17]、雜交鱘Acipenserschrenckii♂×Husodauricus♀[18]、中華絨螯蟹Eriocheirsinensis[19]、日本鰻鱺Anguillajaponica[20]和鯽Carassiusauratugibelio[21-22]等水產(chǎn)動物體內(nèi)ENR的代謝特征已開展了部分研究，國外針對大西洋鮭和虹鱒苗種也開展了低劑量藥浴和注射研究[23-26]，但虹鱒養(yǎng)殖生產(chǎn)中不同給藥劑量的代謝特征比較研究尚未見報道。本研究中，探究了不同給藥劑量下ENR及其主要代謝產(chǎn)物CIP在虹鱒6個組織中的代謝過程和殘留消除規(guī)律，并對其藥物代謝動力學(xué)特征進(jìn)行比較，旨在為水產(chǎn)養(yǎng)殖中ENR的合理使用及休藥期制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用虹鱒購自河北省淶源縣某養(yǎng)殖場，平均體質(zhì)量為(70.48±5.41) g，經(jīng)確認(rèn)，該養(yǎng)殖場未使用過喹諾酮類藥物。試驗在北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所小湯山冷水魚養(yǎng)殖基地進(jìn)行。試驗前將虹鱒暫養(yǎng)10 d，水溫為(15±2) ℃，水體連續(xù)曝氣且循環(huán)過濾，溶解氧質(zhì)量濃度為6.5 mg/L以上，3 d換水一次，每次換1/2養(yǎng)殖水體。按照魚體質(zhì)量2%每日早、中、晚各投喂飼料一次，及時排出殘餌和污物，試驗前3 d停止投喂。

儀器：Thermo TSQ高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀、HCB 1002型電子天平、AB265-S型分析天平、H-2050R型離心機(jī)、H/T16MM型離心機(jī)、N-EVAP1/2型氮吹儀和MS3bsic型渦旋振蕩器。

藥品與試劑：恩諾沙星原藥購自北京鑫洋水產(chǎn)高新技術(shù)有限公司，經(jīng)檢測，純度為94.6%；恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.5%)和環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品(純度95.0%)購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；氘代恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.8%)和氘代環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.8%)購自德國Witega公司。甲醇、乙腈、甲酸為色譜純(德國Merck公司)，醋酸銨為色譜純(美國Fluka公司)，無水硫酸鈉和正己烷為分析純(北京化工廠)。

1.2 方法

1.2.1 給藥方式 《新編漁藥手冊》[27]對于ENR在魚類細(xì)菌性疾病中的指導(dǎo)用量為20～50 mg/kg魚體質(zhì)量，參照上述推薦劑量，本研究中分別選擇20 mg/kg作為低劑量和50 mg/kg作為高劑量，進(jìn)行虹鱒單次混飼口灌后的代謝殘留比較研究。

試驗共挑選上述暫養(yǎng)健康虹鱒257尾，分為兩組，其中，低劑量組126尾，隨機(jī)分為21個亞組，每組6尾；高劑量組132尾虹鱒，隨機(jī)分為22個亞組，每組6尾。采用混飼口灌給藥法給藥，無回吐者放回養(yǎng)殖缸中進(jìn)行試驗研究，試驗期間虹鱒養(yǎng)殖管理同暫養(yǎng)時期。

1.2.2 樣品采集 口灌藥物后，低劑量組分別于給藥后0.25、0.5、1、2、4、8、12、24、48、72、96、144、192、240、312、384、456、528、576、768、888 h共21個點(diǎn)采樣，每個采樣點(diǎn)采集6尾魚，分別采集其血液、肝臟、腎臟、肌肉、皮膚、剩余其他組織(除上述5種組織外全部其他組織混合物)6種樣品。高劑量組除增加1 008 h采樣點(diǎn)外，其他采樣點(diǎn)與低劑量組一致。使用經(jīng)3‰肝素鈉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)潤洗的注射器從魚尾部采集1 mL血樣，置于離心管(經(jīng)3‰肝素鈉潤洗)，混合均勻后以8 000 r/min離心10 min，取上層即為血漿樣品。肌肉、肝臟、皮膚、剩余其他組織各采集約10 g，肝臟和腎臟采集全部組織。全部樣品放入-80 ℃超低溫冰箱中冷凍待測。另選擇6尾未給藥虹鱒，采集對應(yīng)6類組織樣品作為空白對照。

1.2.3 樣品前處理 樣品處理及藥物濃度測定參照《水產(chǎn)品中17種磺胺類及15種喹諾酮類藥物殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部1077號公告-1—2008)優(yōu)化后進(jìn)行。

1.2.4 色譜、質(zhì)譜條件 色譜柱為Hypersil GOLD C18(2.1 mm×150 mm,5 μm)，以A(0.1%甲酸溶液，含5 mmol/L醋酸銨)和B(乙腈)為流動相，二者體積比為88∶12進(jìn)行梯度洗脫，流速為300 μL/min，進(jìn)樣量為10 μL，室溫。

離子源為電噴霧(ESI)離子源，離子化模式為正離子，監(jiān)測方式為選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)，電噴霧電壓為3 200 V，鞘氣為45 units，輔氣為15 units，離子源溫度為350 ℃，源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)解離電壓為10 V。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 配制質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 μg/mL的ENR和CIP混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，采用內(nèi)標(biāo)法定量。以3倍基線噪音藥物的濃度為最低檢測限。

1.2.6 回收率、精密度測定 采用加標(biāo)回收法測定。分別取虹鱒空白對照組血漿1.0 mL及肌肉、皮膚、肝臟、腎臟和剩余組織1.0 g，分別加入質(zhì)量濃度為50、100、200 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照“1.2.3節(jié)”方法處理樣品，每個濃度設(shè)3個平行。將上述3個濃度的同一樣品于1 d內(nèi)分別重復(fù)進(jìn)樣5次并分5 d測定，計算3個濃度水平響應(yīng)值峰面積的變異系數(shù)(CV)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 8.0軟件計算時間濃度曲線，采用DAS 2.0軟件計算ENR和CIP藥代動力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析方法驗證

2.1.1 恩諾沙星和環(huán)丙沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲線 ENR的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為

Y=-0.321 1+0.069 6X，R2=0.999 9；

CIP的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為

Y=0.091 9+0.024 1X，R2=0.999 9。

對5種空白對照組織的基線噪音值取平均值，求得該方法中ENR和CIP的檢測限均為1 μg/L。

2.1.2 回收率 50、100、200 μg/L(低、中、高)3個質(zhì)量濃度添加水平在虹鱒6種組織中的回收率結(jié)果見表1，ENR的回收率為78.14%～108.80%，CIP的回收率為76.06%～106.04%。

表1 虹鱒6種組織中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的提取回收率Tab.1 Recovery rate of ENR and CIP in six tissues of rainbow trout

2.1.3 精密度 50、100、200 μg/L(低、中，高)3個質(zhì)量濃度添加水平的精密度測定結(jié)果見表2，其中，兩種藥物的日內(nèi)變異系數(shù)均小于6%，日間變異系數(shù)均小于7%。

表2 恩諾沙星和環(huán)丙沙星的日內(nèi)和日間變異系數(shù)Tab.2 Coefficient of variation(CV) of ENR and CIP in intra-day and inter-day

2.2 兩種劑量下ENR和CIP在虹鱒各組織中的藥代動力學(xué)特征

采用DAS 2.0非房室模型進(jìn)行分析，獲得各個組織和器官的藥代動力學(xué)參數(shù)，兩種劑量下ENR和CIP的藥代動力學(xué)曲線見圖1。從圖1可見：ENR主要分布于腎臟中，其含量遠(yuǎn)高于其他5種組織，其次為剩余組織和皮膚；低劑量組ENR在肝臟、肌肉、皮膚、腎臟、剩余組織和血漿中的含量分別在停藥后8、24、48、72、4、8 h時達(dá)到峰值，分別為13.349、11.164、23.378、114.196、33.762 mg/kg和3.361 mg/L；高劑量組ENR在肝臟、肌肉、皮膚、腎臟、剩余組織和血漿中的含量分別在停藥后8、8、48、48、1、8 h時達(dá)到峰值，分別為43.302、35.909、53.315、305.098、121.254 mg/kg和8.456 mg/L。

兩種劑量下，CIP藥物均主要分布于肝臟中，并分別在8、48 h時出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象；低劑量下，CIP在肝臟、肌肉、皮膚、腎臟、剩余組織和血漿中的含量分別在停藥后48、72、72、72、48、48 h時達(dá)到峰值，分別為6.372、0.932、0.564、1.440、1.658 mg/kg和0.196 mg/L；高劑量下，CIP在肝臟、肌肉、皮膚、腎臟、剩余組織和血漿中的含量分別在停藥后48、48、48、48、48、8 h時達(dá)到峰值，分別為8.634、1.840、0.907、3.004、2.442 mg/kg和0.663 mg/L(圖1)。

圖1 兩種劑量下ENR和CIP在虹鱒6種組織中的藥時曲線Fig.1 Concentration-time curves of ENR and CIP in six tissues under two concentrations

兩種劑量下，ENR和CIP在各組織中的藥代動力學(xué)參數(shù)如表3～表6所示。低劑量下，ENR在6種組織中Vd為0.121～47.234 L/kg，高劑量下Vd為0.162～49.000 L/kg，可見，隨著劑量的增加，ENR分布更加廣泛(表3、表4)。低劑量下，CIP在6種組織中Vd為5.341～52.328 L/kg，高劑量下Vd為9.329～87.958 L/kg，可見，隨著劑量增加,CIP在各組織中的Vd值逐漸變大(表5、表6)。兩種劑量下，ENR和CIP在血漿中的Vd值大于其他5種組織(50 mg/kg CIP血漿除外)，可見藥物分布最為廣泛，滲透量最大(表3～表6)。

表3 20 mg/kg劑量下虹鱒體內(nèi)ENR的藥代動力學(xué)參數(shù)Tab.3 Pharmacokinetic parameters of ENR in rainbow trout Oncorhynchus mykiss exposed to ENR at a dose of 20 mg/kg

表4 50 mg/kg劑量下虹鱒體內(nèi)ENR的藥代動力學(xué)參數(shù)Tab.4 Pharmacokinetic parameters of ENR in rainbow trout Oncorhynchus mykiss exposed to ENR at a dose of 50 mg/kg

表5 20 mg/kg劑量下虹鱒體內(nèi)CIP的藥代動力學(xué)參數(shù)Tab.5 Pharmacokinetic parameters of CIP in rainbow trout Oncorhynchus mykiss exposed to ENR at a dose of 20 mg/kg

表6 50 mg/kg劑量下虹鱒體內(nèi)CIP的藥代動力學(xué)參數(shù)Tab.6 Pharmacokinetic parameters of CIP in rainbow trout Oncorhynchus mykiss exposed to ENR at a dose of 50 mg/kg

2.3 ENR和CIP在虹鱒體內(nèi)的殘留特征

2.3.1 ENR 從圖1可見，兩種劑量下不同組織中ENR殘留呈現(xiàn)如下特征：低劑量組肝臟中ENR在給藥后24～144 h下降明顯，含量由13.081 mg/kg降至1.70 mg/kg，后緩慢消除；高劑量組在48～192 h下降明顯，含量由33.772 mg/kg下降至1.495 mg/kg。低劑量組肌肉中ENR在24～144 h下降明顯，含量由11.164 mg/kg 降至0.572 mg/kg，高劑量下ENR在該時間段同樣下降快速，含量由35.844 mg/kg降至2.311 mg/kg。低劑量組皮膚中ENR在48 h開始下降，消除速度較為平緩，888 h時檢出含量為0.291 mg/kg；高劑量組ENR在48 h時達(dá)到峰值53.315 mg/kg后開始下降，在1 008 h時含量為0.631 mg/kg。低劑量組腎臟中ENR在72 h達(dá)到峰值后開始下降，在給藥后888 h含量為1.841 mg/kg；高劑量組ENR含量在48 h達(dá)到峰值305.098 mg/kg，隨后消除速度較快，下降明顯。低劑量組剩余組織ENR在4～144 h下降較為明顯，后持續(xù)消除，速度較為平緩；高劑量組在1 h時達(dá)到峰值，至12 h時快速下降。低劑量組血漿ENR含量在24～144 h時下降明顯，后消除速度趨于平緩，含量由2.865 mg/L降至0.223 mg/L；高劑量組在24 h時出現(xiàn)第二個峰值后開始下降，至144 h區(qū)間下降速度較快，后期趨于平緩。低劑量下ENR在6種組織中的t1/2z為56.523～320.705 h，高劑量下為102.405～325.593 h。整體而言，在高劑量試驗條件下各組織中ENR的t1/2z高于低劑量組。

2.3.2 CIP 口灌ENR后，虹鱒肝臟、肌肉、皮膚、腎臟、剩余組織和血漿中均可檢測到代謝物CIP。兩種劑量下不同組織中CIP的殘留呈現(xiàn)如下特征：高低劑量組肝臟組織CIP含量均在停藥后48 h時達(dá)到峰值后進(jìn)入消除階段，48～144 h消除較為快速，隨后藥時曲線斜率趨緩，CIP進(jìn)入緩慢降解過程，且高低劑量組分別在456、528 h時CIP含量低于檢測限。低劑量組肌肉組織CIP含量于72 h時達(dá)到峰值后緩慢下降，高劑量組在48 h時達(dá)到峰值后進(jìn)入降解階段，高低劑量組均于192 h時下降至檢測線以下。低劑量組皮膚組織CIP于72 h時開始降解，高劑量組于48 h時開始消除，均至240 h時低于檢測限以下。低劑量組腎臟組織中CIP于72 h時開始消除，96 h低于檢測限；高劑量組CIP于48 h時開始消除，192 h時低于檢測限。剩余組織高低劑量組CIP均于48 h時開始消除，高劑量組消除速度快于低劑量組，高低劑量組分別于240、192 h時低于檢測限。血漿中CIP高劑量組于24 h、低劑量組于48 h時開始消除，分別于144、96 h時低于檢測限。低劑量下CIP在6種組織中的t1/2z為32.036～162.735 h，高劑量下相應(yīng)組織t1/2z為30.086～260.018 h；低劑量組肝臟、肌肉、皮膚、腎臟和剩余組織消除速度快于高劑量組，但血漿中高劑量組快于低劑量組(表5、表6)。

2.3.3 ENR+CIP 高劑量組藥物代謝消除速度較低劑量組慢。低劑量組用藥后888 h(37 d)魚體肝臟、肌肉、皮膚、腎臟、剩余組織和血漿中ENR與CIP含量之和分別為47.079、ND(未檢出)、294.731、1 892.800、21.769 μg/kg和ND；高劑量組用藥1 008 h(42 d)后魚體肝臟、肌肉、皮膚、腎臟、剩余組織和血漿中ENR與CIP含量之和分別為59.421、ND、639.093、2 628.919、57.691 μg/kg和2.231 μg/L；肌肉中ENR與CIP之和的含量，低劑量組在給藥后768 h(32 d)、高劑量組在給藥后1 008 h(42 d)低于檢測限。

3 討論

3.1 給藥方式與采樣方案

魚類藥物代謝殘留研究，給藥方式主要有注射、拌飼投喂、口灌和藥浴等4種。注射是使抗生素進(jìn)入血流最直接、最有效的給藥方式，因需要更多時間和勞動力，適用于處理高價值動物，如家畜和觀賞魚[28]，不適用于養(yǎng)殖魚類。拌飼投喂和藥浴相對操作簡便，但拌飼投喂主要是將藥物混入飼料后投喂，不同試驗動物個體間因攝食能力、社會等級地位等行為學(xué)特征，導(dǎo)致不同個體間攝入藥物量差異較大，對研究結(jié)果準(zhǔn)確性影響較大[29]。藥浴是通過水體給藥，難以獲得魚體實際攝入藥物量數(shù)據(jù)，且存在需要較高藥物用量才能達(dá)到預(yù)期效果，以及水體細(xì)菌會產(chǎn)生耐藥性等缺點(diǎn)[30]。本研究中采用混飼口灌方式給藥，不僅可以做到每條試驗魚體給藥量精確可控，且操作相對簡便，減少了試驗誤差，有效保障了試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，值得后續(xù)研究推廣使用。

在魚體代謝組織選擇上，本試驗中采樣組織與以往研究相比，除傳統(tǒng)血液及肌肉、肝臟、腎臟、皮膚等組織外，額外增加除上述組織外的所有剩余其他組織，即該研究獲得了藥物在整個魚體中的代謝殘留特征，據(jù)筆者所知上述研究思路目前尚不多見。如此設(shè)計主要因中國養(yǎng)殖水產(chǎn)動物種類眾多，使用藥物種類繁雜，加之養(yǎng)殖環(huán)境和模式多樣，解決水產(chǎn)動物藥物代謝殘留問題，恐不能窮盡所有魚藥組合，解決產(chǎn)業(yè)需求有賴于基于生理藥代動力學(xué)模型(physiologically based pharmacokinetic model，PBPK model)的魚類藥物代謝殘留技術(shù)研究[31]。生理藥代動力學(xué)模型是基于物質(zhì)平衡原理，將整個魚體作為一個有機(jī)整體，不同組織代表一個單獨(dú)的房室，房室間借助于血液循環(huán)連接形成閉環(huán)，以此模擬機(jī)體藥物代謝過程，實現(xiàn)藥物代謝殘留的預(yù)測和外推[32]。本研究中正是基于此原理，將虹鱒作為有機(jī)整體進(jìn)行了全部組織中藥物代謝殘留規(guī)律研究，在獲得代謝特征和殘留規(guī)律的同時，也為魚類藥物代謝殘留PBPK模型的構(gòu)建提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

3.2 藥代動力學(xué)特征

藥物達(dá)峰濃度(Cmax)和達(dá)峰時間(tmax)是反映藥物在魚體中吸收程度和速度的2個重要參數(shù)。本研究中，高劑量組ENR在虹鱒肌肉、腎臟和剩余組織中的tmax均比低劑量組短，且高劑量組肝臟、肌肉、皮膚、腎臟、剩余組織和血漿中的Cmax分別為43.302、35.909、53.315、305.098、121.254 mg/kg和8.456 mg/L，均大于低劑量組相應(yīng)組織的Cmax值(分別為13.349、11.164、23.378、114.196、33.762 mg/kg和3.361 mg/L)。其代謝物CIP在高劑量組肌肉、腎臟和皮膚等組織的tmax也同樣均短于低劑量組，且CIP在高劑量組肝臟、肌肉、皮膚、腎臟、剩余組織和血漿中的Cmax均大于低劑量組相應(yīng)組織的Cmax。上述結(jié)果表明，高劑量給藥情況下，ENR及其代謝物CIP在虹鱒體內(nèi)的吸收程度及速度均大于低劑量組。Stoffregen等[33]對大西洋鮭幼魚分別進(jìn)行5、10 mg/kg兩種劑量ENR口灌比較研究，同樣呈現(xiàn)高劑量組組織中ENR的tmax短于低劑量組的特征。在中國對蝦中對氟苯尼考等氯霉素類藥物進(jìn)行高劑量(16 mg/kg)和低劑量(8 mg/kg)比較，同樣發(fā)現(xiàn)高劑量組肌肉和肝胰臟組織藥物Cmax濃度遠(yuǎn)高于低劑量組[34]?？梢姡凰幬镌诓煌B(yǎng)殖品種或不同藥物間增加給藥劑量，均能促進(jìn)藥物吸收速度和程度。

AUC是反映組織器官對藥物吸收和藥物在機(jī)體內(nèi)分布量大小的參數(shù)。本研究中高低兩種劑量下，ENR在腎臟中的AUC值均大于其他組織，表明虹鱒腎臟中的藥物吸收分布量、吸收速度和程度均高于其他5種組織。另一方面，本研究中兩種ENR濃度下，魚體腎臟中藥物含量均遠(yuǎn)大于其他5種組織，且肝臟中檢測出CIP含量均最高，這與ENR在歐洲鰻鱺Anguillaanguilla[35]、金鱒Oncorhynchusmykiss[36]和三疣梭子蟹Portunustrituberculatus[37]中的檢出結(jié)果一致，由此說明，對部分水產(chǎn)動物而言，藥物經(jīng)肝臟代謝腎臟排泄的理論[38]同樣適用。

消除半衰期(t1/2z)反映了藥物在機(jī)體組織器官中的消除速度。本研究中，高劑量給藥下ENR在虹鱒肝臟、肌肉、皮膚、腎臟、剩余組織和血漿中t1/2z分別為204.193、115.639、102.405、121.852、201.834、325.593 h，均高于低劑量下對應(yīng)組織的t1/2z值100.928、60.780、67.283、111.586、56.523、320.705 h，由此說明，高劑量給藥下ENR在虹鱒體內(nèi)所需消除時間更長，且兩種給藥劑量下虹鱒肌肉、肝臟和血液的t1/2z均顯著高于50 mg/kg ENR在羅非魚對應(yīng)3個組織的t1/2z值(15.61、16.83、17.19 h)[13]。導(dǎo)致差異產(chǎn)生的原因，除物種間因素外，考慮到本研究中虹鱒為冷水性魚類，試驗水溫為(15±2)℃，羅非魚為熱帶品種，試驗水溫為(27±2)℃，筆者認(rèn)為更多可能是不同養(yǎng)殖溫度所致，由此提醒后續(xù)研究中應(yīng)更多關(guān)注溫度等環(huán)境因素的影響。本研究中ENR給藥后，虹鱒肝臟和腎臟中ENR及CIP均出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，這與ENR在短蓋巨脂鯉Colossomabrachypomum[39]和異育銀鯽Carassiusauratusgibelio[40]體內(nèi)變化規(guī)律一致，原因可能是ENR在虹鱒體內(nèi)同樣存在肝腸循環(huán)，但此論點(diǎn)還有待進(jìn)一步驗證。

3.3 給藥方案與休藥期

藥物劑量決定藥物對宿主和病原體作用的強(qiáng)度[41]，劑量偏小不僅達(dá)不到治療疾病的目的，還極有可能產(chǎn)生耐藥性，劑量過大則對養(yǎng)殖動物和生態(tài)環(huán)境均存在毒性風(fēng)險，且容易導(dǎo)致藥殘超標(biāo)，引發(fā)食品安全問題。研究表明，ENR對大多數(shù)病原菌的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)為0.16 mg/L，對最不敏感的鏈球菌MIC為0.25～0.45 mg/L[42-43]。當(dāng)抗菌藥物Cmax/MIC=10時即可發(fā)揮最大治療效果，并減少耐藥性的產(chǎn)生[44]。以最不敏感鏈球菌MIC為依據(jù)，本研究中，低劑量給藥下虹鱒肝臟、肌肉、皮膚、腎臟、剩余組織和血漿中Cmax/MIC值分別為29.664～53.396、24.809～44.656、51.951～93.512、253.769～456.784、75.027～135.048、7.468～13.444，高劑量下相應(yīng)組織中Cmax/MIC值分別為96.226～173.208、79.798～143.636、118.478～213.260、677.996～1220.392、269.453～485.016、18.791～33.824，即兩種劑量下虹鱒各組織中藥物Cmax/MIC的平均值均大于10，由此表明，在20 mg/kg單次給藥下，ENR對最不敏感鏈球菌也能達(dá)到最大抑制作用。國外學(xué)者在ENR藥代動力學(xué)研究中，多采用5 mg/kg或10 mg/kg給藥劑量，研究結(jié)果所得血藥濃度均能達(dá)到理想的抑菌效果[23-26]。考慮到養(yǎng)殖生產(chǎn)多為連續(xù)給藥，筆者建議在實際養(yǎng)殖生產(chǎn)中，推薦按照20 mg/kg魚體質(zhì)量甚至更低的ENR給藥劑量，這樣既能滿足對疾病的有效治療和控制，也可大幅降低用藥及生產(chǎn)成本，減少藥物殘留超標(biāo)風(fēng)險，同時對養(yǎng)殖水域生態(tài)環(huán)境和藥物耐藥性預(yù)防等均具有積極意義。

在20、50 mg/kg兩種劑量下虹鱒肌肉中ENR與CIP之和分別在用藥后768 h(32 d)和1 008 h(42 d)低于中國食品安全國家限量標(biāo)準(zhǔn)100 μg/kg[4]，即ENR休藥期分別為480、630 ℃·d，接近或高于現(xiàn)行中國水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙(2020年2號)中對ENR休藥期標(biāo)準(zhǔn)500 ℃·d的要求。而現(xiàn)實生產(chǎn)中，ENR通常按20～50 mg/kg劑量連續(xù)給藥5～7 d，實際所需休藥期應(yīng)大于本研究結(jié)果。另一方面，有關(guān)虹鱒休藥期，Lucchetti等[26]研究認(rèn)為，ENR休藥期應(yīng)為816 ℃·d；對于其他養(yǎng)殖品種，梁俊平等[45]通過20 mg/kg劑量給大菱鲆口服和李佳蔚等[46]通過20 mg/kg劑量給黑裙口服研究，分別給出720 ℃·d和630 ℃·d時休藥期建議。綜上，中國現(xiàn)有ENR 500 ℃·d的規(guī)定不能保障養(yǎng)殖產(chǎn)品質(zhì)量安全，建議適當(dāng)延長休藥期。

4 結(jié)論

1)以20、50 mg/kg ENR生產(chǎn)實際使用劑量對虹鱒進(jìn)行單次混飼口灌，不同組織均可檢測出代謝物CIP，且兩種劑量下均為腎臟中ENR含量最高，肝臟中CIP含量最高。

2)增大ENR給藥劑量能顯著增加魚體組織中藥物濃度，高劑量下ENR消除速率較快，但殘留時間更長。

3)ENR 20 mg/kg劑量單次給藥下，虹鱒各組織中藥物Cmax均能達(dá)到理想的抑菌效果，建議中國實際養(yǎng)殖生產(chǎn)中ENR使用劑量降為20 mg/kg魚體質(zhì)量甚至更低。

4)在(15±2)℃下，建議ENR 20 mg/kg劑量對虹鱒單次口服給藥休藥期不低于32 d(即480 ℃·d)，50 mg/kg劑量下休藥期不低于42 d(即630 ℃·d)?，F(xiàn)有500 ℃·d的休藥期標(biāo)準(zhǔn)存在引發(fā)水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險，應(yīng)適當(dāng)延長。