一氧化氮和茶多酚對(duì)肥城桃抗氧化系統(tǒng)的調(diào)控作用

肖興榮，丁芮，宮淑琪，朱樹(shù)華

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山東泰安 271018)

抗氧化系統(tǒng)具有保護(hù)細(xì)胞膜以及各種細(xì)胞器免受活性氧損傷的功能[1]，在水果采后貯藏品質(zhì)保持中發(fā)揮著重要作用。

具有活性的一氧化氮(NO)在延長(zhǎng)果實(shí)的貯藏壽命和保持果實(shí)品質(zhì)方面有積極的作用[2]，可提高果實(shí)采后的質(zhì)量，延長(zhǎng)新鮮果品如桃、香蕉等[3,4]的保質(zhì)期。能抑制呼吸躍變型果實(shí)乙烯的產(chǎn)生，降低活性氧的積累，參與果實(shí)成熟并顯著降低果實(shí)在貯藏期間水分的流失[5]。可通過(guò)減少活性氧的積累來(lái)保護(hù)植物細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的影響[6]。

茶多酚為多酚類物質(zhì)，在茶葉中含量約15%～30%，具有良好的抗氧化能力，既能抑制自由基的產(chǎn)生，還能有效清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的自由基[7,8]，且無(wú)毒，對(duì)人體安全，是天然的食品抗氧化劑[9,10]，可用于各種食品的貯藏保鮮[11,12]。茶多酚有較強(qiáng)和較廣的抗菌、抑菌性能[13]，除能清除自由基外，還可以激活自由基清除體系，抑制脂膜的過(guò)氧化反應(yīng)，絡(luò)合誘導(dǎo)氧化的金屬離子來(lái)抑制自由基的產(chǎn)生，或激活細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)[14]。能抑制多酚氧化酶的活性，延緩水果的褐變[15]。

目前，NO可以提高采后果實(shí)抗氧化酶活性降低活性氧的累積，抑制乙烯的產(chǎn)生，減少水分流失，保持采后果實(shí)品質(zhì)。茶多酚可以提高抗氧化系統(tǒng)的活性來(lái)抑制自由基的產(chǎn)生并消除自由基。因此一氧化氮和茶多酚都可以通過(guò)促進(jìn)果實(shí)抗氧化系統(tǒng)延長(zhǎng)果實(shí)的貯藏時(shí)間并保持果實(shí)品質(zhì)。筆者研究并比較了NO和茶多酚處理對(duì)桃果實(shí)貯藏期間抗氧化系統(tǒng)的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

萊山蜜(Purnuspersicacv. Laishanmi)于2020年9月采自山東省肥城市，果實(shí)生長(zhǎng)良好，無(wú)病蟲(chóng)害，無(wú)機(jī)械損傷。試驗(yàn)儀器：紫外可見(jiàn)掃描分光光度計(jì)UV-2450型(日本島津公司)；電子分析天平BS210S型(德國(guó)Sartorius公司)；pH計(jì)S-3D型(上海精科電器公司)；水浴鍋HH-2型(國(guó)華電器有限公司)；組織粉碎機(jī)All basic S25型(IKA公司)；高速離心機(jī)GL-20G-Ⅱ型(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

試驗(yàn)設(shè)3個(gè)NO濃度(5、15、30 μmol/L)處理[16]，2個(gè)茶多酚濃度(14.2、42.6 mmol/L)處理[17]，對(duì)照為蒸餾水處理。

每個(gè)處理選取36個(gè)桃果實(shí)，分別用上述濃度溶液浸泡0.5 h，置于25 ℃下貯藏待測(cè)相關(guān)指標(biāo)，每2 d取樣測(cè)定1次，至10 d。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 丙二醛(MDA)含量 稱取測(cè)待桃果肉10 g，研磨勻漿后，加入25 mL磷酸緩沖液(pH 7.8)浸提10 min，取1 mL樣品浸提液，加入7.5 mL Tris-HCl(pH 7.5)、1 mL 0.6 %硫代巴比妥酸(TBA)溶液，混勻，沸水浴15 min后冷卻至室溫，經(jīng)15 000 g離心15 min，取上清液于比色皿中，分別測(cè)定450 nm、532 nm和600 nm的吸光度，計(jì)算：

MDA含量=6.45(A532-A600)-0.56A450，單位表示為μmol/g FW(鮮重)。

1.3.2 超氧化物歧化酶(SOD)活性 稱取待測(cè)桃果肉10 g，加25 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.8)勻漿，在4 ℃以15 000 g離心15 min，取上清液備用。取3 mL 50 mmol/L磷酸反應(yīng)液(pH 7.8，含13 mmol/L甲硫氨酸、63 μmol/L氮藍(lán)四唑(NBT)、1.3 μmol/L核黃素和10 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，在暗處加入30 μL酶液，25 ℃下用4 000 lx熒光燈管照光，出現(xiàn)顏色變化后，測(cè)定560 nm的吸光度。以未加酶液的反應(yīng)體系為空白對(duì)照，以單位時(shí)間內(nèi)抑制NBT光還原率達(dá)50 %的酶量為1個(gè)酶活性單位(U)。

1.3.3 過(guò)氧化氫酶(CAT)活性 取10 g果肉，研磨勻漿后，加入25 mL磷酸緩沖液(pH 7.8)浸提，15 000 g離心15 min。取0.2 mL上清液，加入3 mL磷酸緩沖液、0.1 mL的1 %過(guò)氧化氫溶液，立即搖勻，并轉(zhuǎn)入比色皿中，測(cè)定240 nm的吸光度變化。從加入H2O2起計(jì)時(shí)，每15 s讀數(shù)1次。以未加酶液的反應(yīng)體系為空白對(duì)照，以單位時(shí)間內(nèi)抑制NBT光還原率達(dá)50 %的酶量為1個(gè)酶活性單位(U)。

1.3.4 過(guò)氧化物酶(POD)活性 采用聯(lián)苯胺法測(cè)定POD活性[18]。取10 g果肉，研磨勻漿后，加入25 mL磷酸緩沖液(pH 7.8)浸提10 min，15 000 g離心15 min。取上清液(粗酶液)1 mL，加入2 mL聯(lián)苯胺乙酸-乙酸鈉溶液30 ℃水浴5 min。加入1 mL 0.3 % H2O2，立即搖勻，并轉(zhuǎn)入比色皿中，測(cè)定580 nm的吸光度變化。從加入H2O2起計(jì)時(shí)，每15 s讀數(shù)1次。以單位時(shí)間單位質(zhì)量?jī)?nèi)吸變化度變化0.01為一個(gè)酶活單位(U)，單位表示為U/mg FW。

1.3.5 賴氨酰氧化酶(LOX)活性 參照吳敏[19]等的方法測(cè)定。取10 g果肉，加入25 mL 50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.8)，在4 ℃勻漿，15 000 g離心15 min，取上清液作為酶粗提液。取0.2 mL粗酶液，加入25 μL 50 mmol/L亞油酸鈉，2.775 mL 100 mmol/L乙酸緩沖液(pH 5.5)，30 ℃反應(yīng)，測(cè)定234 nm吸光度變化。加酶液15 s后開(kāi)始計(jì)時(shí)，記錄1 min內(nèi)在234 nm下吸光度的變化，以1 min內(nèi)吸光度升高的數(shù)值定義為1個(gè)酶活單位(U)，LOX活性以U/g FW表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

各指標(biāo)測(cè)定重復(fù)三次，采用SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，單因素方差分析和Tukey檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 NO和茶多酚處理對(duì)肥城桃MDA含量的影響

如表1，3個(gè)濃度NO處理的肥城桃在貯藏10 d期間，MDA含量整體呈上升趨勢(shì)。對(duì)照也是上升趨勢(shì)。貯藏至6 d時(shí)，處理的小于對(duì)照，說(shuō)明NO處理抑制了果實(shí)MDA的產(chǎn)生。貯藏8～10 d時(shí)，反而處理的大于對(duì)照的。

表1 NO和茶多酚處理對(duì)肥城桃MDA含量的影響 μmol/g FW

茶多酚2個(gè)濃度(14.2、42.6 mmol/L)處理的桃果實(shí)貯藏10 d期間，除貯藏2 d時(shí)處理的大于對(duì)照的，貯藏4～10 d時(shí)，處理的小于對(duì)照的，說(shuō)明茶多酚抑制了果實(shí)MDA的產(chǎn)生。

但NO 3個(gè)濃度處理之間、茶多酚2個(gè)濃度處理之間、NO與茶多酚處理之間分別對(duì)果實(shí)中MDA的抑制作用，互有顯著性差異，但未體現(xiàn)出規(guī)律。從貯藏10 d時(shí)的效果看，NO處理的MDA值大，效果差，茶多酚處理的MDA值小，效果好。

2.2 NO和茶多酚處理對(duì)肥城桃SOD活性的影響

如表2，NO處理的肥城桃貯藏的10 d中，SOD活性呈先升后降趨勢(shì)，但都顯著高于對(duì)照。說(shuō)明NO處理有提高桃果中SOD活性的作用。

表2 NO和茶多酚處理對(duì)肥城桃SOD活性的影響 U/g FW

茶多酚處理的桃果實(shí)在貯藏的10 d中，SOD活性的變化規(guī)律同NO，也說(shuō)明茶多酚處理有提高桃果中SOD活性的作用。

但3個(gè)NO濃度處理之間、2個(gè)茶多酚濃度處理之間，分別對(duì)果實(shí)中SOD的活性增強(qiáng)作用，互有顯著性差異，未體現(xiàn)出規(guī)律。

2.3 NO和茶多酚處理對(duì)肥城桃CAT活性的影響

如表3，NO處理的肥城桃在貯藏的10 d期間，CAT活性是先上升最后降低趨勢(shì)，對(duì)照的變化規(guī)律亦然，且處理的都顯著高于對(duì)照的。貯藏8 d時(shí)，以5 μmol/L處理果實(shí)的CAT活性(212.84 U/g FW)最高，是對(duì)照(64.76 U/g FW)的330%。表明NO處理比對(duì)照增加了CAT活性。

表3 NO和茶多酚處理對(duì)肥城桃CAT活性的影響 U/g FW

茶多酚處理的肥城桃CAT活性變化：14.2 mmol/L處理的一直升高，貯藏10 d時(shí)達(dá)到峰值(196.78 U/g FW)，是對(duì)照的388%。42.6 mmol/L處理的CAT活性是先上升最后降低趨勢(shì)，且處理的都顯著高于對(duì)照的，表明茶多酚處理比對(duì)照增加了CAT活性。

2.4 NO和茶多酚處理對(duì)肥城桃POD活性的影響

如表4，NO處理的肥城桃貯藏的10 d期間，5 μmol/L NO處理桃果的POD活性一直呈上升趨勢(shì)，貯藏10 d時(shí)至峰值(5.68 U/mg FW)，是對(duì)照(4.38 U/mg FW)的130 %。而15、30 μmol /L NO 2個(gè)濃度處理果實(shí)的POD活性呈先上升后下降趨勢(shì)。NO 3個(gè)濃度處理果實(shí)的POD活性在貯藏至10 d時(shí)均顯著低于對(duì)照。

表4 NO和茶多酚處理對(duì)肥城桃POD活性的影響 U/mg FW

茶多酚2個(gè)濃度處理桃果貯藏10 d期間，POD活性均呈先升后降趨勢(shì)，對(duì)照亦然。貯藏至6 d時(shí)，14.2 mmol/L處理的桃果的POD活性達(dá)到峰值(5.89 U/mg FW)，是對(duì)照(5.60 U/mg FW)的105 %。

2.5 NO和茶多酚對(duì)桃果實(shí)LOX活性的影響

如表5，NO處理的肥城桃貯藏10 d期間，LOX活性呈先升后降趨勢(shì)。貯藏6 d時(shí)，5 μmol/L NO處理的桃果實(shí)LOX活性達(dá)峰值(4.89 U/mg FW)，是對(duì)照(3.65 U/mg FW)的134 %。

表5 NO和茶多酚處理對(duì)肥城桃LOX活性的影響 U/g FW

茶多酚處理的肥城桃貯藏10 d期間，LOX活性也呈先升后降趨勢(shì)。貯藏至6 d時(shí)，14.2 mmol/L茶多酚處理桃果的LOX活性達(dá)峰值(3.87 U/mg FW)，是對(duì)照(3.70 U/mg FW)的105 %，是42.6 mmol/L茶多酚處理(3.55 U/mg FW)的109 %。

3 小結(jié)與討論

目前桃果實(shí)貯藏保鮮中常用低溫貯藏保鮮技術(shù)和氣調(diào)貯藏保鮮技術(shù)。低溫冷藏使桃果實(shí)的失水率增高,易發(fā)生皺縮現(xiàn)象,貯藏效果差,貯藏期短[20]。氣調(diào)貯藏可以減少乙烯對(duì)果蔬的刺激，減少果蔬體內(nèi)物質(zhì)消耗，降低腐爛率等，成為研究的熱潮[21]。NO廣泛存在于生物體中，不僅影響著生物的生長(zhǎng)發(fā)育等一系列生理過(guò)程，而且在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[22]，NO處理具有效果明顯、省時(shí)省力、節(jié)約成本等優(yōu)點(diǎn)[23]，但目前NO作用的分子機(jī)制存在著太多的未知數(shù)[24]。茶多酚作為一種自然提取物，副作用小，原料豐富，并且具有良好的活性，然而茶多酚本身不具備較好的穩(wěn)定性，容易氧化，在保鮮過(guò)程中產(chǎn)生的自由基和氧化物不斷蓄積，達(dá)到一定數(shù)量后會(huì)抵消其本身的活性[25]。

本研究證明，NO處理比對(duì)照不處理能降低貯藏期肥城桃的MDA含量，貯藏前6 d抑制桃果POD活性，貯藏0～4 d期間抑制LOX活性，明顯提高貯藏后期SOD活性，延長(zhǎng)了貯藏時(shí)間。茶多酚的高效抗氧化活性，能明顯減緩細(xì)胞膜脂質(zhì)的過(guò)氧化程度，抑制桃果貯藏期MDA的產(chǎn)生，提高SOD的活性和后期CAT的活性，抑制POD和LOX的活性。維持桃果實(shí)細(xì)胞膜的完整性，延緩果實(shí)的衰老，有利于果實(shí)的貯藏[26-28]。整體看，30 μmol/L NO處理和14.2 mmol/L茶多酚處理效果為好。綜合NO和茶多酚對(duì)桃果實(shí)抗氧化系統(tǒng)的影響情況，以及考慮試驗(yàn)造價(jià)和操作過(guò)程，NO處理比茶多酚處理的應(yīng)用更具優(yōu)勢(shì)。