麻杏止嗽散對(duì)咳嗽變異型哮喘模型小鼠IFN-γ、IL-8水平的影響*

王雪梅，梁志慶，王蓓蓓，蔡碧波

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.云南省中醫(yī)中藥研究院，云南 昆明 650021）3.云南省第一人民醫(yī)院/昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院，云南 昆明 650032）

咳嗽變異性哮喘（cough variant asthma，簡(jiǎn)稱CVA）是以慢性咳嗽為唯一或主要臨床表現(xiàn)，具有與哮喘類似的咳嗽為主要特點(diǎn)的一種特殊類型的呼吸系統(tǒng)疾病?？人詣×摇⒁归g加重、持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)為其臨床特征；喘促、氣短等表現(xiàn)不明顯，但高氣道反應(yīng)性特征明顯；病理上表現(xiàn)為氣道高反應(yīng)性、氣道嗜酸粒細(xì)胞炎癥、氣道重塑等癥狀特點(diǎn)為刺激性干咳，區(qū)別于普通咳嗽，尤其對(duì)于冷空氣、灰塵、油煙等較為敏感，暴露在這些刺激因素下容易誘發(fā)或加重咳嗽。因此，CVA是無明顯的喘鳴、呼吸困難等癥狀或體征的一種氣道高反應(yīng)狀態(tài)[1]。全國(guó)中醫(yī)藥行業(yè)高等教育“十四五”規(guī)劃教材《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》將咳嗽分為急性咳嗽、亞急性咳嗽和慢性咳嗽3類。短于3周為急性咳嗽，3～8周為亞急性咳嗽，超過8周為慢性咳嗽。慢性咳嗽是臨床上最常見的癥狀之一，在肺病?？崎T診當(dāng)中大約有1/3～1/2患者為慢性咳嗽，由于臨床上失治誤治的比例比較高，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，同時(shí)也帶來了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)?？人宰儺愋韵?，因其病程較長(zhǎng)，往往反復(fù)發(fā)作，屬于中醫(yī)亞急性及慢性咳嗽范疇，風(fēng)邪是咳嗽的重要致病因素，而風(fēng)寒犯肺、肺失宣降、風(fēng)痰蘊(yùn)肺、脾虛痰阻于肺等是咳嗽的基本病機(jī)。故中醫(yī)治療CVA應(yīng)以祛風(fēng)止咳、化痰平喘、潤(rùn)肺健脾、溫煦肺經(jīng)為主。由于該病反復(fù)難愈，在中醫(yī)及臨床醫(yī)學(xué)的診療中均是研究的熱點(diǎn)。目前，很多學(xué)者認(rèn)為CVA是氣道炎癥比較輕微狀態(tài)下的一種過渡性表現(xiàn)，可認(rèn)為屬于典型哮喘的前體疾病，30%的CVA可能會(huì)演變?yōu)榈湫拖璠2]。慢性咳嗽在基礎(chǔ)研究方面，如：高敏感性分子神經(jīng)機(jī)制、空氣污染與慢性咳嗽的關(guān)系，以及胃食管反流性的神經(jīng)反射機(jī)制等方面均有一定的進(jìn)展。

筆者系全國(guó)第六批名老中醫(yī)師帶徒鄭進(jìn)教授學(xué)術(shù)繼承人，曾跟隨導(dǎo)師參與肺病疑難雜癥的診治。鄭進(jìn)教授從醫(yī)38載，擅長(zhǎng)運(yùn)用中醫(yī)藥診治肺系疾病，在CVA診治方面經(jīng)驗(yàn)豐富，見識(shí)獨(dú)到，麻杏止嗽散就是其常用的治療CVA的處方。具有辛涼解表，清肺平喘的作用的麻杏石甘湯出自《傷寒論》，有宣利肺風(fēng)、疏風(fēng)止咳之效的止嗽散出自《醫(yī)學(xué)心悟》，鄭進(jìn)教授將二方合方加減發(fā)揮祛風(fēng)止咳、化痰平喘的功效。在治療新冠患者早期出現(xiàn)的咳嗽癥狀有明顯的臨床效果，并有一定的防止其進(jìn)一步出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)的炎性風(fēng)暴感染的可能性。因此，筆者為了探究麻杏止嗽散對(duì)CVA炎癥因子及免疫的調(diào)節(jié)作用開展實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部雄性SPF級(jí)ICR小鼠60只，體質(zhì)量18～22 g，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滇）k2015-0002。

1.2 藥物與試劑

1.2.1 藥物 麻杏止嗽散由麻黃10 g，杏仁10 g，桔梗 12 g，前胡 12 g，紫菀 12 g，百部 15 g，浙貝 15 g，射干10 g，炒黃芩15 g，法夏12 g，五味子10 g，荊芥12 g，枇杷葉15 g，甘草6 g組成。選取小兒肺熱咳喘顆粒（海南新中正制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20140102）為陽性對(duì)照組，該復(fù)方由麻黃、生石膏、杏仁、連翹、魚腥草、黃芩等核心藥物組成。臨床用于治療喘息性支氣管炎，支氣管炎痰熱壅肺證。其清熱解毒的藥物如連翹、石膏、黃芩、魚腥草具有很好的抗炎作用。

1.2.2 試劑與儀器 鼠IFN-γ ELISA試劑盒（科艾博生物，CB14274-Mu），鼠 IL-8 ELISA 試劑盒（科艾博 生 物 ，CB149644-Mu）， 卵 清 蛋 白（MacklinE6337），Al（OH）3。飼料[蘇州雙獅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料科技有限公司蘇飼,（2009）05032]，超聲霧化器（粵華超聲波霧化器WH-2000醫(yī)用級(jí)），純凈水。

1.3 動(dòng)物分組及給藥

1.3.1 動(dòng)物分組 將清潔級(jí)ICR小鼠60只隨機(jī)分為 A、B、C、D、E 共 5組，每組 12只。A 組：空白組；B組：造模后空白組；C組：造模后對(duì)照組；D組：造模后麻杏止嗽散低劑量組；E組：造模后麻杏止嗽散高劑量組。

1.3.2 模型建立 根據(jù)文獻(xiàn)[3]的報(bào)道，用卵蛋白和Al（OH）3致敏的方法復(fù)制CVA模型小鼠（以A組、B組、C組、D組、E組表示）。進(jìn)行環(huán)境、飼料等適應(yīng)性投喂4 d，開始模型復(fù)制實(shí)驗(yàn)，除正常組外，其余各組均在第1個(gè)喂養(yǎng)天和8個(gè)喂養(yǎng)天期間，各小鼠均采取腹腔注射的方式，注射10%卵蛋白和Al（OH）3混合溶液[每毫升含卵蛋白 10 mg、Al（OH）3200 mg]200 μL致敏，從第5天起，B組、C組、D 組、E組小鼠置于密閉空間內(nèi)，給予含1%的卵蛋白溶液（每毫升含卵蛋白1 mg）的生理鹽水在超聲霧化器上激發(fā)，時(shí)間為連貫20 min，1次/d，共8 d，激發(fā)前預(yù)防性給藥，30 min前，C組、D組、E組分別灌胃給藥治療。在確定有效激發(fā)時(shí)，觀察各組模型小鼠反應(yīng)。重點(diǎn)觀察造模小鼠是否出現(xiàn)陣發(fā)性、刺激性干咳、呼吸困難甚至憋悶、呼吸頻率增快、躁擾不安等癥狀，若出現(xiàn)兩種或兩種以上癥狀，則提示CVA小鼠模型復(fù)制成功。

1.3.3 給藥劑量 取10倍處方量的藥材粉碎，過40目篩加入10倍量的水，回流提取2 h再加入8倍量的水回流提取1.5 h，合并兩次提取液減壓回收溶劑，濃縮至每毫升1 g，以生藥量計(jì)，于4℃保存。小鼠低劑量組：17/2=8.5 g/kg=0.85 g/100 g（0.425 g/mL）；小鼠高劑量組：17×2=34 k/kg=3.4 g/100 g（1.7 g/mL），配置相對(duì)應(yīng)劑量組溶液，并將配置好的溶液置于4℃冰箱。實(shí)驗(yàn)陽性藥（小兒肺熱咳喘顆粒）加入適當(dāng)純凈水配制成濃度為0.8 g/mL的溶液，放置于冰箱保存。造模開始后，各給藥組小鼠按20 mL/kg劑量每天灌胃給藥。正常組、模型組灌胃等體積純水，每日1次，連續(xù)灌胃12 d。動(dòng)物進(jìn)行每周稱體質(zhì)量1次，根據(jù)體質(zhì)量不斷變化，調(diào)整給藥劑量。

1.4 日常觀察 在實(shí)驗(yàn)過程中，每天觀察小鼠的一般情況，包括飲食、皮毛顏色和2次糞便。小鼠每周稱體質(zhì)量1次。

1.5 指標(biāo)檢測(cè) 末次給藥后，各組小鼠禁食8 h，第11天記錄咳嗽次數(shù)，進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血分離血清，36℃水浴恒溫靜置1 h，3 000 r/min離心5 min，分離血清，取上清液，用酶聯(lián)免疫分析法對(duì)IFN-γ、IL-8進(jìn)行測(cè)定。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示計(jì)量資料，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較組間計(jì)量資料，配對(duì)t檢驗(yàn)比較組內(nèi)數(shù)據(jù)，χ2檢驗(yàn)比較計(jì)數(shù)資料；秩和檢驗(yàn)比較等級(jí)資料，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體征觀察 造模前空白組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)穩(wěn)定，毛色鮮艷，反應(yīng)靈活，運(yùn)動(dòng)靈敏，呼吸頻率、節(jié)律正常。激發(fā)實(shí)驗(yàn)前空白組及造模組小鼠無異?；蛱厥獍Y狀。激發(fā)實(shí)驗(yàn)后造模組小鼠組出現(xiàn)咳嗽變異型哮喘模型特征，如陣發(fā)性咳嗽（嗆咳）、毛發(fā)毛躁聳立、呼吸急促困難、打噴嚏、躁擾多動(dòng)等癥狀。

2.2 咳嗽次數(shù)測(cè)定結(jié)果 與造模前空白組比較，造模組咳嗽次數(shù)均大幅度增加；與造模后空白組相比，造模后對(duì)照組、造模后麻杏止嗽散高劑量及造模后麻杏止嗽散低劑量組咳嗽次數(shù)減少明顯；與造模后對(duì)照組比較，麻杏止嗽散高劑量組咳嗽次數(shù)相對(duì)減少（P<0.05）（表 1）。

表1 小鼠咳嗽次數(shù)比較（±s，次）

表1 小鼠咳嗽次數(shù)比較（±s，次）

注：與造模前空白組比較，▲P＜0.05；與造模后空白組比較，#P＜0.05；與造模后對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別 只數(shù) 咳嗽次數(shù)造模前空白組 1 2 1.4 0±0.4 4造模后空白組 1 2 6.5 4±1.2 4▲造模后對(duì)照組 1 2 3.3 8±0.6 5#造模后麻杏止嗽散低劑量組 1 2 3.1 0±0.6 6#造模后麻杏止嗽散高劑量組 1 2 1.3 2±0.4 3#*

2.3 小鼠血清IFN-γ檢測(cè)結(jié)果 與造?？瞻捉M比較，造模組血清IFN-γ值降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與造模組比較，造模后對(duì)照組、造模后麻杏止嗽散低劑量組及造模后麻杏止嗽散高劑量組血清IFN-γ 均明顯升高，具有顯著差異（P＜0.05），其組間量效關(guān)系對(duì)比無差異（表2）。

表2 小鼠血清 IFN-γ 含量（±s，pg·mL-1）

表2 小鼠血清 IFN-γ 含量（±s，pg·mL-1）

注：與造模前空白組比較，▲P＜0.05；與造模后空白組比較，#P＜0.05。

組別 只數(shù) I F N-γ造模前空白組 1 2 1 2 4.3 0±1 8.4 4造模后空白組 1 2 8 0.5 4±1 1.2 4▲造模后對(duì)照組 1 2 9 6.3 8±1 6.4 5#造模后麻杏止嗽散低劑量組 1 2 9 8.5 2±1 3.6 6#造模后麻杏止嗽散高劑量組 1 2 1 1 6.3 2±1 5.4 3#

2.4 小鼠血清IL-8檢測(cè)結(jié)果 與造模前空白組比較，造模組血清IL-8值升高，具有顯著差異（P＜0.05）；與造模后空白組相比，造模后對(duì)照組、造模后麻杏止嗽散低劑量組及造模后麻杏止嗽散高劑量組血清IL-8均有一定程度降低，具有顯著差異（P＜0.05）；就量效關(guān)系而言，麻杏止嗽散高劑量組與麻杏止嗽散低劑量組IL-8水平差異比較具有顯著差異（P＜0.05）（表 3）。

表3 小鼠血清 IL-8含量（±s，pg·mL-1）

表3 小鼠血清 IL-8含量（±s，pg·mL-1）

注：與造模前空白組比較，▲P＜0.05；與造模后空白組比較，#P＜0.05；與造模后高劑量組比較，※P＜0.05。

組別 只數(shù) I L-8造模前空白組 1 2 1 1.5 8±2.4 5造模后空白組 1 2 2 2.1 2±1.5 6▲造模后對(duì)照組 1 2 1 6.8 1±2.1 2#造模后麻杏止嗽散低劑量組 1 2 1 8.3 2±2.6 6#※造模后麻杏止嗽散高劑量組 1 2 1 5.8 9±1.4 3#

3 討論

慢性氣道炎癥反應(yīng)是一種多因子共同參與和相互作用的特殊反應(yīng)，涉及多種炎癥細(xì)胞、炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子[4]。在呼吸系統(tǒng)疾病中，患者感染后出現(xiàn)高熱、神昏、呼吸困難等癥狀，很大程度上考慮機(jī)體發(fā)生細(xì)胞因子風(fēng)暴。這是由于人體感染細(xì)菌或病毒后引起體內(nèi)較多種細(xì)胞因子大量迅速的產(chǎn)生，最終引起全身性炎癥反應(yīng)、多器官衰竭、急性呼吸窘迫綜合征等疾病。現(xiàn)代研究表明炎癥反應(yīng)的發(fā)生往往會(huì)導(dǎo)致促炎介質(zhì)的釋放，前列腺素E2（PGE2）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等就是在這個(gè)過程中釋放的促炎介質(zhì)。炎癥因子升高常出現(xiàn)在呼吸系統(tǒng)疾病中重型、危重型患者的某些階段，認(rèn)為是患者致死的主要原因之一。炎癥因子在疾病過程中具有雙重作用：其一，保護(hù)機(jī)體，其二，損傷機(jī)體。在炎癥風(fēng)暴后期，機(jī)體也隨之出現(xiàn)免疫亢進(jìn)的反應(yīng)，同時(shí)又伴隨著免疫功能低下的癥狀，考慮為細(xì)胞因子的抗炎和促炎發(fā)揮雙向作用的機(jī)制的一種表現(xiàn)。機(jī)體在一般情況下所引發(fā)的炎癥反應(yīng)是與感染程度相匹配的，而一旦機(jī)體內(nèi)部穩(wěn)態(tài)遭到破壞，免疫功能就表現(xiàn)出一方面加重炎癥反應(yīng)，一方面減弱對(duì)病原的識(shí)別和吞噬功能也就是會(huì)出現(xiàn)免疫下降的表現(xiàn)。病理上的矛盾存在，也為臨床治療帶來了困境。中醫(yī)在治療疾病的過程中強(qiáng)調(diào)四診合參、整體辨證、驅(qū)邪扶正相結(jié)合，分清標(biāo)本主次，需要將熱邪、痰邪、風(fēng)邪等標(biāo)邪與氣虛、陰虛等本虛等證素綜合考慮，辨證施治選方用藥，在臨床治療中不僅能夠最大限度地發(fā)揮抗炎抗病毒作用，同時(shí)保證機(jī)體內(nèi)環(huán)境不受破壞。

上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等分泌的CXC亞族趨化性細(xì)胞因子IL-8是主要炎性介質(zhì)[2]，通過中性粒細(xì)胞實(shí)現(xiàn)細(xì)胞趨化作用而達(dá)到調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。該研究麻杏止嗽散治療組中IL-8明顯降低，說明麻杏止嗽散可以抑制炎性因子表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)研究中高劑量組和低劑量組血清IFN-γ增加，IL-8明顯降低，且與模型組比較治療組數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示麻杏止嗽散能有效減輕炎癥反應(yīng)且與治療效果呈現(xiàn)正相關(guān)，存在一定的量效關(guān)系。通過增加劑量可以增加抗炎效果，減輕炎癥反應(yīng)，進(jìn)而達(dá)到改善患者臨床癥狀的目的。

鄭進(jìn)教授對(duì)于呼吸系統(tǒng)疾病，尤其是重癥選用麻杏止嗽散加減進(jìn)行治療，臨床根據(jù)情況加減均可使CVA患者在從癥狀及體征上有明顯的改善，因此，推測(cè)該方具有有效控制細(xì)胞因子風(fēng)暴進(jìn)一步發(fā)展的作用。麻杏止嗽散由麻杏石甘湯去石膏合止嗽散加減組成。該方具有辛涼宣肺、清熱平喘的功效，對(duì)呼吸道疾病具有較好的臨床療效，從藥理作用上表現(xiàn)為抗流感病毒、抗炎、止咳、調(diào)節(jié)免疫功能，也能夠能調(diào)動(dòng)機(jī)體抗病能力發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)的作用。黃曉潔等[5]研究表明麻杏石甘湯（麻杏止嗽散的主要藥物）能夠明顯抑制IL-8和IL-5的蛋白表達(dá)和GATA-3和STAT-6的基因表達(dá)。陳麗君等研究指出止嗽散治療CVA的關(guān)鍵活性成分有白前苷元C、桔梗皂苷D、新對(duì)葉百部堿等[6]。其中，桔梗皂苷D具有祛痰和抗炎活性[7]。止嗽散藥物白前中β-谷甾醇可以抑制Th2細(xì)胞因子升高，減輕氣道炎癥反應(yīng)，達(dá)到治療過敏性哮喘的作用[8]。甘草中7，4'-二羥基黃酮可以顯著降低嗜酸性粒細(xì)胞性肺炎患者血清IgE、IL-13、IL-4水平[9]。麻杏石甘湯（麻杏止嗽散核心藥物），是通過干擾病毒吸附、抑制病毒增殖、保護(hù)宿主細(xì)胞等機(jī)制發(fā)揮抗病毒的作用，緩解患者癥狀[5]，同時(shí)通過調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)水平，對(duì)機(jī)體抗感染免疫發(fā)揮一定調(diào)節(jié)作用。在CVA治療中止嗽散所含藥物活性成分可以有效減輕氣道炎癥反應(yīng)，并降低氣道高反應(yīng)以及抑制氣道重塑達(dá)到緩解嗆咳、痙攣性咳嗽的目的[6]。

鄭進(jìn)教授結(jié)合經(jīng)方的現(xiàn)代藥理研究，根據(jù)自己的臨證經(jīng)驗(yàn)將止嗽散和麻杏石甘湯兩方有效地結(jié)合，麻黃、杏仁、桔梗、前胡、紫苑、百部、荊芥宣降肺氣，浙貝母、射干、法夏、桔梗化痰利咽，黃芩清熱解毒，五味子、枇杷葉潤(rùn)燥斂肺平喘止咳，在CVA臨床治療中取得較好的療效?？紤]到本病大多虛實(shí)夾雜，扶正祛邪是基本的治療原則，歷代醫(yī)家在病位上均強(qiáng)調(diào)五臟均可致咳，不離肺也不止于肺，本病在發(fā)展過程中涉及多個(gè)病位相互兼夾。性質(zhì)上，邪實(shí)的問題多考慮寒、熱、痰、氣滯、瘀血；正虛考慮氣虛、陽虛、陰虛。因此，臨證中在協(xié)定基礎(chǔ)方上應(yīng)當(dāng)隨證加減，保證臨床療效。

綜上所述，本次實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)麻杏止嗽散可明顯提高CVA模型小鼠血清IFN-γ的水平，降低血清IL-8的水平，從而扭轉(zhuǎn)機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡，并在一定劑量范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量與效果的依賴關(guān)系。其作為治療CVA的一種治療方案，值得推廣應(yīng)用。目前，對(duì)CVA的發(fā)生機(jī)制解釋研究尚有不足，推測(cè)炎性因子及中性粒細(xì)胞水平增加與重癥哮喘及難治性哮喘有密切的關(guān)系。從實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)高劑量組相比于低劑量組的麻杏止嗽散，更有利于癥狀的改善以及氣道炎癥的控制，更有效緩解感染后的嗆咳發(fā)作。麻杏止嗽散能有效抑制或阻斷CVA的早期發(fā)病過程，具有減輕氣道高反應(yīng)、氣道細(xì)胞炎癥及免疫調(diào)節(jié)等作用，可能是中藥復(fù)方治療CVA的機(jī)制之一，同時(shí)，也對(duì)中醫(yī)宣肺理氣、清熱解毒治療CVA提供了新的科研思路和方法。