棉花雄性不育細胞質(zhì)對ATP 和H2O2 含量的影響分析

韓陽，臧榕，張夢，陳亮亮，張學(xué)賢，郭立平，戚廷香，唐會妮，王海林，喬秀琴，邢朝柱*，張艷*，吳建勇*

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)/ 棉花生物學(xué)國家重點實驗室河北基地，河北 保定 071001；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/ 棉花生物學(xué)國家重點實驗室，河南 安陽 455000）

雜種優(yōu)勢主要表現(xiàn)在生長勢、 生活力、 抗逆性、繁殖力、適應(yīng)性以及產(chǎn)量、品質(zhì)等層面。生產(chǎn)實踐表明， 雜種優(yōu)勢的利用能夠大幅度提高棉花產(chǎn)量、 改善其纖維品質(zhì)并增強其抵御病蟲等逆境脅迫的能力[1]。然而目前棉花雜交種生產(chǎn)中去雄主要由人工、化學(xué)處理來完成，其生產(chǎn)成本高、效率低，甚至?xí)Νh(huán)境造成不利影響[2]。利用細胞質(zhì)雄性不育（cytoplasmic male sterility,CMS）系作母本，恢復(fù)系作父本的“三系”法（不育系、保持系及其恢復(fù)系）制種，可以降低種子生產(chǎn)成本，提高種子純度[3]。

CMS 大多是由線粒體基因結(jié)構(gòu)異常引起的母性遺傳，一般表現(xiàn)為產(chǎn)生無功能的花粉[4-5]。 絨氈層細胞中線粒體數(shù)量和體積的增加證明花藥發(fā)育是一個需要大量能量的過程，尤其是在產(chǎn)生大量的花粉母細胞之后，其所需的大部分能量來自于發(fā)生在線粒體內(nèi)膜的氧化磷酸化過程[6]。 現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)CMS 相關(guān)基因與氧化磷酸化通路相關(guān)基因共表達[7-8]，這些CMS 基因可干擾氧化磷酸化各復(fù)合體的正常功能， 導(dǎo)致ATP 合成顯著減少，最終導(dǎo)致植物CMS[2]。 大多數(shù)CMS的機制在很大程度上可以用能量缺乏模型來解釋， 即使花粉發(fā)育過程中ATP 生成的輕微中斷也可能導(dǎo)致CMS[9]。 線粒體基因組攜帶許多重要的遺傳信息，包括能量代謝、發(fā)育、細胞程序性死亡（programmed cell death,PCD）和氧化應(yīng)激反應(yīng)等[10]。此外，在植物細胞中線粒體代謝通常受到高水平活性氧（reactive oxygen species, ROS）的干擾。 ROS 已經(jīng)成為植物發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子，許多證據(jù)表明，ROS 在細胞生長過程中發(fā)揮著重要作用[11-14]，其中H2O2含量是反應(yīng)ROS 水平的一項重要指標。 花粉敗育過程通常伴隨著各種生理指標的變化。 Teixeira 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，與其保持系相比， 油菜不育系不同組織中的ATP 含量都有降低的趨勢。 在玉米和水稻中的研究表明，相比于保持系， 不育系花藥中ATP 含量顯著降低、ROS 水平顯著升高[3,16]。

哈克尼西棉（Gossypium harknessii）胞質(zhì)不育系（CMS-D2）和三裂棉（Gossypium trilobum）胞質(zhì)不育系（CMS-D8）是棉花主要的胞質(zhì)不育材料[17]，其中CMS-D2 屬于孢子體不育，CMS-D8屬于配子體不育。前人通過細胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)CMS-D2 一般在花蕾長度為3 mm 左右時發(fā)生敗育[18]，CMS-D8 一般在花蕾長度為5～6 mm 時發(fā)生敗育[19]。 此外，本課題組前期通過對CMS-D2 不育系及其保持系的線粒體全基因組序列進行比對分析， 鑒定到一個不育系特有的嵌合基因orf610a，在擬南芥中超表達融合線粒體定位信號的orf610a基因，導(dǎo)致陽性植株育性降低[20]。 基于此，本研究通過比較分析CMS-D2 和CMS-D8 兩套 “三系” 材料不同發(fā)育時期的葉片和花蕾中ATP 和H2O2含量，以及orf610a轉(zhuǎn)基因擬南芥花蕾和角果中ATP 和H2O2含量，并測定不育系、保持系和轉(zhuǎn)基因擬南芥花蕾中ATP 合成相關(guān)基因的表達， 探究棉花雄性不育細胞質(zhì)對ATP 和H2O2含量的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及生長條件

供試棉花材料為兩套“三系”材料，分別為含哈克尼西棉不育胞質(zhì)（CMS-D2） 的不育系D2A［S（rf1rf1）］及其保持系D2B［N（rf1rf1）］與恢復(fù)系D2R［S（Rf1Rf1）］，含三裂棉不育胞質(zhì)（CMS-D8）的不育系D8A ［S （rf2rf2）］ 及其保持系D8B［N（rf2rf2）］與恢復(fù)系D8R［S（Rf2Rf2）］。 上述兩套材料均于2021 年4 月下旬種植于河南省安陽市中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所東場試驗基地，棉花行距為80 cm，株距23.8 cm，田間管理措施同當?shù)仄胀尢铩?/p>

轉(zhuǎn)基因受體材料為本課題組保存的哥倫比亞型擬南芥， 種植于裝有營養(yǎng)土 （營養(yǎng)土∶蛭石＝3∶1）的營養(yǎng)缽（長7 cm，寬7 cm，高cm）中，每穴對角種植2 株。 置于溫室中培養(yǎng)，溫度為（22±2）℃， 空氣相對濕度為80%左右，光照/ 黑暗時間為16 h/8 h。

1.2 試驗方法

1.2.1orf610a 基因的克隆、超表達載體構(gòu)建以及擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化。 以D2A 3 mm 花蕾的cDNA 為模 板， 用PhantaMax Super-Fidelity DNA Poly merase（南京諾唯贊生物科技有限公司）擴增orf610a的編碼區(qū)全長；之后將擬南芥線粒體靶向肽atp31-231（GenBank 登錄號：NM_128864.4）的編碼序列（MTS）與orf610a融合，連接T-zero 載體并轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞Trans 5α 中；以測序正確的質(zhì)粒作為模板，設(shè)計含有相應(yīng)酶切位點的特異引物進行聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）擴增，通過同源重組的方法與已酶切完成的經(jīng)過修飾的pCAMBIA2300 載體進行連接， 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞Trans 5α 中，最終獲得正確的超表達載體。

將構(gòu)建好的超表達載體pCAM2BIA2300-MTS-orf610a轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞GV3101中，之后利用農(nóng)桿菌蘸花法[21]進行擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化。 將滅菌的T0轉(zhuǎn)基因擬南芥種子置于含50 mg·L－1卡那霉素的MS 培養(yǎng)基平板上篩選，選取長勢較好的植株轉(zhuǎn)移至營養(yǎng)缽中； 待長出7～8 片真葉后，剪取植株葉片，利用CTAB 法提取葉片總DNA 用于PCR 檢測（正向引物：ACTGGGCACAACAGACAATCG；反向引物：GCATCAGCCATGATGGATACTTT）， 篩選T1陽性植株。 之后用同樣的方法，篩選T2陽性植株。

1.2.2取樣。棉花葉片：分別在苗期（5 月22 日）、蕾期（6 月17 日）、鈴期（7 月23 日）選取兩套“三系”材料的倒三葉，使用打孔器進行取樣，取樣后立即放入液氮，用于后續(xù)ATP 和H2O2含量測定。

棉花花蕾： 前期研究發(fā)現(xiàn)，CMS-D2 不育系在花蕾長度為3 mm 左右時發(fā)生敗育，而CMS-D8 不育系在花蕾長度為5 mm 左右時發(fā)生敗育[18-19]。因此本研究在蕾期取D2A、D2B、D2R 3個材料2 mm、3 mm、4 mm （花蕾長度， 下同）花蕾，D8A、D8B、D8R 3 個材料2 mm、3 mm、4 mm、5 mm、6 mm 花蕾，取樣后立即放入液氮，用于后續(xù)ATP 和H2O2含量測定以及RNA 提取。

擬南芥： 分別取野生型 （wild type,WT）和orf610a轉(zhuǎn)基因植株（T2）的花蕾和角果，取樣后立即放入液氮，用于后續(xù)ATP 和H2O2含量測定以及RNA 提取。

以上所有樣品取樣時均為3 株混樣， 并取3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.3ATP 含量測定。 使用ATP 檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）， 按照試劑盒說明書對樣品進行處理，設(shè)3 次技術(shù)重復(fù)；使用BioTek Synergy HT 多功能酶標儀測定熒光讀數(shù)，設(shè)定讀數(shù)時間為10 s。 ATP 濃度的標準曲線由已知量（1 nmol～1 μmol）測定后繪制而成，得出計算公式y(tǒng)＝8 855.2x＋98.677，其中y為酶標儀測定值相對光單位（relative light unit，RLU），x為ATP 含量（nmol），根據(jù)樣品質(zhì)量計算得出不同組織中ATP 相對含量（nmol·g－1）。

1.2.4H2O2 含量測定。 使用H2O2含量檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），按照試劑盒說明書進行樣品處理，并設(shè)3 次技術(shù)重復(fù)；取上清液使用BioTek Synergy HT 多功能酶標儀測定415 nm 處吸光值。 根據(jù)以下公式，計算得出H2O2含量（μmol·g－1）。

H2O2含量＝駐A測定÷（駐A標準÷C標液）×V樣本÷（V樣本÷V提取×m）＝2×駐A測定÷駐A標準÷m

其中 駐A測定＝A測定管－A空白管；駐A標準＝A標準管－A空白管；A：415 nm 處吸光值；C標液：H2O2標準溶液濃度，2 μmol·mL－1；V樣本： 加入的樣本體積，0.25 mL；V提?。禾崛∵^程中所用體積，1 mL；m：樣品質(zhì)量（g）。

1.2.5基因表達分析。 利用RNAprep Pure 植物總RNA 提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取CMS-D2 不育系及其保持系3 mm 花蕾的RNA，CMS-D8 不育系及其保持系5 mm 花蕾的RNA，野生型和orf610a轉(zhuǎn)基因擬南芥花蕾的RNA。 檢測后使用PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）試劑盒（TaKaRa，北京）反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA， 以此作為模板進行實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRTPCR）。 熒光定量試劑為TransStartTop Green qPCR SuperMix （北京全式金生物技術(shù)有限公司）。 在NCBI 中設(shè)計引物，由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成（引物信息見表1）。 以GhHIS3基因作為棉花內(nèi)參基因，AtACTIN2 作為擬南芥內(nèi)參基因，在Mastercycler ep realplex 實時熒光定量PCR 儀（Eppendorf,德國）中進行qRT-PCR。其反應(yīng)體系總體積為20 μL，設(shè)3 次重復(fù)，擴增程序：94 ℃預(yù)變性30 s；94℃變性5 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，40 個循環(huán)。 利用2－ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

表1 qRT-PCR 引物Table 1 Primers for qRT-PCR

1.2.6數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析。 利用Microsoft Excel 2016 對數(shù)據(jù)進行匯總分析， 用t檢驗法進行差異顯著性分析， 利用GraphPad Prism 8 軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CMS-D2 和CMS-D8 不同發(fā)育時期葉片中ATP 和H2O2 含量變化

隨著棉花生育進程的推進，在CMS-D2 中，從苗期到鈴期保持系和恢復(fù)系葉片中ATP 含量呈上升趨勢，而不育系葉片中ATP 含量表現(xiàn)出先降低后升高趨勢。 苗期保持系葉片中ATP 含量極顯著高于恢復(fù)系；蕾期和鈴期不育系葉片中ATP 含量極顯著低于保持系和恢復(fù)系， 保持系葉片中ATP 含量極顯著低于恢復(fù)系（圖1A）。保持系和恢復(fù)系葉片中H2O2含量表現(xiàn)為在蕾期最低、鈴期最高；不育系葉片中H2O2含量在鈴期明顯升高。 蕾期不育系葉片中H2O2含量極顯著高于保持系和恢復(fù)系；鈴期不育系葉片中H2O2含量極顯著高于保持系和恢復(fù)系， 保持系和恢復(fù)系間差異極顯著（圖1B）。 以上結(jié)果表明，與其配套的保持系和恢復(fù)系相比， 在蕾期和鈴期CMS-D2 不育系葉片中ATP 含量極顯著降低，H2O2含量極顯著升高。

在CMS-D8 中，從苗期到鈴期，不育系葉片中ATP 含量呈上升趨勢。 苗期不育系、保持系與恢復(fù)系葉片中的ATP 含量無顯著差異， 蕾期不育系葉片的ATP 含量極顯著低于保持系和恢復(fù)系， 鈴期不育系葉片中ATP 含量極顯著高于保持系和恢復(fù)系（圖1C）。 從苗期到鈴期，保持系和恢復(fù)系葉片中H2O2含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢， 而不育系葉片中H2O2含量持續(xù)升高。 在苗期， 不育系葉片中H2O2含量極顯著低于保持系和恢復(fù)系； 蕾期不育系葉片中H2O2含量極顯著高于保持系和恢復(fù)系， 保持系極顯著高于恢復(fù)系； 鈴期3 個材料葉片中H2O2含量無顯著差異（圖1D）。 以上結(jié)果表明，與其配套的保持系和恢復(fù)系相比， 蕾期CMS-D8 不育系葉片ATP 含量極顯著降低、H2O2含量極顯著升高， 鈴期CMS-D8 不育系葉片中ATP 含量極顯著升高。

圖1 CMS-D2 和CMS-D8 葉片中ATP 和H2O2 含量Fig. 1 ATP and H2O2 contents in the leaves of CMS-D2 and CMS-D8

對比兩套“三系”材料葉片中的ATP 和H2O2含量可以發(fā)現(xiàn)，兩種不育胞質(zhì)對棉花葉片中ATP含量和H2O2含量產(chǎn)生了不同的影響。 尤其在鈴期， 與其配套的保持系和恢復(fù)系相比，CMS-D2不育系葉片中ATP 含量極顯著降低，H2O2含量極顯著升高； 而CMS-D8 不育系葉片中ATP 含量極顯著升高，H2O2含量無顯著差異。

2.2 CMS-D2 和CMS-D8 花蕾中ATP 和H2O2含量變化

隨著花藥的發(fā)育，在CMS-D2 中，保持系和恢復(fù)系2 mm 和3 mm 花蕾中ATP 含量表現(xiàn)出明顯上升趨勢，在3 mm 到4 mm 花蕾中ATP 含量無明顯差異； 不育系2 mm 到4 mm 花蕾中ATP 含量基本不變，均保持在較低水平。 保持系2 mm 花蕾中ATP 含量極顯著高于恢復(fù)系；不育系3 mm 花蕾中ATP 含量極顯著低于保持系和恢復(fù)系，恢復(fù)系極顯著低于保持系；不育系4 mm花蕾中ATP 含量極顯著低于保持系和恢復(fù)系（圖2A）。 不育系和恢復(fù)系2 mm 花蕾中H2O2含量均極顯著低于保持系；3 個材料3 mm 花蕾中的H2O2含量無顯著差異；不育系4 mm 花蕾中H2O2含量極顯著高于保持系和恢復(fù)系，保持系和恢復(fù)系之間差異不顯著（圖2B）。

在CMS-D8 中， 保持系和恢復(fù)系2 mm～6 mm 花蕾中ATP 含量逐漸上升； 而不育系在2 mm 到4 mm 花蕾中ATP 含量逐漸上升，在5 mm 到6 mm 花蕾中ATP 含量穩(wěn)定。3 個材料在2 mm 和4 mm 花蕾中ATP 含量均無顯著差異；恢復(fù)系3 mm 花蕾中ATP 含量極顯著高于不育系和保持系； 不育系5 mm 和6 mm 花蕾中ATP 含量極顯著低于保持系和恢復(fù)系，恢復(fù)系顯著或極顯著高于保持系（圖2C）。3 個材料2 mm、3 mm、4 mm 花蕾中H2O2含量均無顯著差異；保持系5 mm 花蕾中H2O2含量顯著高于不育系、極顯著高于恢復(fù)系；保持系6 mm 花蕾中H2O2含量顯著高于不育系，不育系和恢復(fù)系之間差異不顯著（圖2D）。

圖2 CMS-D2 和CMS-D8 花蕾中ATP 和H2O2 含量Fig. 2 ATP and H2O2 contents in the flower buds of CMS-D2 and CMS-D8

對比兩套“三系”材料花蕾中的ATP 和H2O2含量可以發(fā)現(xiàn)， 與其配套的保持系和恢復(fù)系相比，CMS-D2 不育系3 mm、4 mm 花蕾中ATP 含量極顯著下降，4 mm 花蕾中H2O2含量極顯著升高；而CMS-D8 不育系5 mm、6 mm 花蕾中ATP含量極顯著降低，H2O2含量升高，但差異不顯著。

2.3 orf610a 超表達擬南芥中ATP 和H2O2 含量

為進一步探究ATP 和H2O2含量與育性的關(guān)系。 將棉花候選不育基因orf610a在擬南芥植株中進行超表達， 測定其對ATP 和H2O2含量的影響。由圖3A 可以看出，T2轉(zhuǎn)基因擬南芥植株角果及花蕾中ATP 含量均極顯著低于野生型， 約為野生型的57%。 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株角果和花蕾中H2O2含量極顯著或顯著高于野生型（圖3B）。結(jié)合之前的研究結(jié)果[20]，推測棉花orf610a基因影響擬南芥花蕾和角果中ATP 的含量以及H2O2水平，可能導(dǎo)致植株育性降低。

圖3 orf610a 轉(zhuǎn)基因擬南芥中ATP 和H2O2 含量Fig. 3 ATP and H2O2 contents in orf610a transgenic Arabidopsis

2.4 ATP 合成相關(guān)基因表達分析

在CMS-D2 不育系D2A 和保持系D2B 3 mm花蕾中：與氧化磷酸化代謝通路復(fù)合體Ⅰ組裝相關(guān)的基因nad1、nad4、nad5、nad7在不育系中的表達量均極顯著低于保持系（圖4A～D）；復(fù)合體Ⅲ組裝相關(guān)基因cob在不育系中的表達量極顯著高于保持系（圖4E）；復(fù)合體Ⅳ組裝相關(guān)基因cox2在不育系中的表達量極顯著高于保持系，cox3在不育系和保持系中的表達量無顯著差異（圖4F～G）；復(fù)合體Ⅴ組裝相關(guān)基因atp6在不育系中的表達量極顯著低于保持系（圖4H）。 說明CMS-D2 不育系中氧化磷酸化代謝通路部分復(fù)合體的組裝可能受到了影響， 導(dǎo)致ATP 合成受阻。

在CMS-D8 不育系D8A 和保持系D8B 5 mm花蕾中： 復(fù)合體Ⅰ組裝相關(guān)基因nad1、nad4、nad5、nad7，復(fù)合體Ⅲ組裝相關(guān)基因cob，復(fù)合體Ⅳ組裝相關(guān)基因cox2、cox3， 以及復(fù)合體Ⅴ組裝相關(guān)基因atp6在不育系中的表達量均極顯著低于保持系（圖4I～P）。在CMS-D8 不育系中，氧化磷酸化代謝通路多個復(fù)合體的組裝可能受到影響，最終導(dǎo)致ATP 合成受阻。

對比CMS-D2 和CMS-D8 不育系中ATP 合成相關(guān)基因的表達可以發(fā)現(xiàn)，兩種不育胞質(zhì)對氧化磷酸化代謝通路相關(guān)基因的影響不同，說明這兩種胞質(zhì)不育系花粉的敗育可能具有不同的分子調(diào)控機制。

在野生型和orf610a轉(zhuǎn)基因擬南芥T2花蕾中： 復(fù)合體I 組裝相關(guān)基因nad4、nad6（圖4Q～R），復(fù)合體Ⅲ組裝相關(guān)基因cob（圖4S），復(fù)合體Ⅳ組裝相關(guān)基因cox2、cox3（圖4T～U），以及復(fù)合體Ⅴ組裝相關(guān)基因atp3、atp6（圖4V～W）在轉(zhuǎn)基因擬南芥花蕾中的表達量均極顯著低于野生型，而atp9基因的表達量無顯著差異（圖4X）。

3 討論

線粒體能量供應(yīng)不足以及ROS 的產(chǎn)生與清除之間的不平衡是導(dǎo)致植物CMS 的關(guān)鍵因素[2,22-23]。ROS 主要來源于線粒體，高濃度的ROS會改變細胞的抗氧化狀態(tài)，導(dǎo)致PCD[24-25]?；ㄋ幇l(fā)育過程需要大量的能量，能量供應(yīng)不足可能直接導(dǎo)致花藥發(fā)育異常進而導(dǎo)致花粉敗育。 前人在水稻CMS-HL[22]、油菜CMS-Nsa[26]和玉米CMS-S[3]不育系中發(fā)現(xiàn)花粉敗育過程中花藥ATP 含量降低，ROS 過度積累。本研究結(jié)果顯示，與其保持系和恢復(fù)系相比，蕾期CMS-D2 和CMS-D8 不育系葉片中ATP 含量極顯著降低、H2O2含量極顯著升高（圖1）；并且在花藥發(fā)育過程中CMS-D2 不育系3 mm、4 mm 花蕾和CMS-D8 不育系5 mm、6 mm 花蕾中ATP 含量均極顯著降低（圖2），這與上述前人的研究結(jié)果較為一致。但CMS-D2 不育系中H2O2的異常積累發(fā)生在4 mm 花蕾中，這可能與CMS-D2 不育系中絨氈層的推遲降解有關(guān)[27]。 此 外，在CMS-D2 和CMS-D8 恢 復(fù) 系 中ATP 和H2O2含量均未出現(xiàn)這種變化 （圖1，圖2），這說明在恢復(fù)基因存在的情況下不育胞質(zhì)對棉花葉片和花蕾中ATP 和H2O2含量的影響可能會被抑制。 之前的研究發(fā)現(xiàn)棉花orf610a基因在酵母細胞中過表達會抑制酵母的生長， 表現(xiàn)為ATP 含量的降低和ROS 的爆發(fā)。 在擬南芥中過表達融合線粒體定位信號的orf610a基因， 發(fā)現(xiàn)T2轉(zhuǎn)基因陽性株系花絲變短、花粉量減少、育性降低[20]。 本研究發(fā)現(xiàn)orf610a在擬南芥中過表達會導(dǎo)致花蕾和角果中ATP 含量極顯著降低、H2O2含量顯著升高（圖3），且與野生型相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥花蕾中大多數(shù)ATP 合成相關(guān)基因均極顯著下調(diào)表達（圖4Q-X）。 因此，導(dǎo)致CMS-D2 和CMS-D8不育系花粉敗育的原因可能是花藥發(fā)育所需的能量得不到滿足，以及ROS 導(dǎo)致的異常PCD。

圖4 ATP 合成相關(guān)基因的表達分析Fig. 4 Expression analysis of ATP synthesis related genes

發(fā)生在植物線粒體內(nèi)膜上的氧化磷酸化對于細胞能量產(chǎn)生至關(guān)重要， 涉及ATP 合成和電子傳遞，是植物生長發(fā)育所必須的[28]。線粒體內(nèi)膜氧化磷酸化代謝通路系統(tǒng)由5 個復(fù)合體（復(fù)合體Ⅰ～Ⅴ）組成，在呼吸過程中復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ可以把電子轉(zhuǎn)移到分子氧中結(jié)合生成水，同時將質(zhì)子（H＋）泵入線粒體膜間隙中，為ADP 結(jié)合無機磷酸鹽合成ATP 提供動力， 該過程中復(fù)合體Ⅰ和復(fù)合體Ⅲ功能異常會導(dǎo)致電子泄露， 加速ROS的生成[29-31]。 本研究結(jié)果顯示，與保持系相比，CMS-D2 不育系3 mm 花蕾中復(fù)合體Ⅰ組裝相關(guān)基因均極顯著下調(diào)表達，可能是復(fù)合體Ⅰ組裝受損，導(dǎo)致電子傳遞異常；而復(fù)合體Ⅲ組裝相關(guān)基因極顯著上調(diào)表達，可能與CMS-D2 不育系花蕾中ROS 的爆發(fā)有關(guān)。CMS-D8 不育系5 mm 花蕾中復(fù)合體Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組裝相關(guān)基因的表達均極顯著低于保持系，可能在CMS-D8 不育系中這4個復(fù)合體的組裝均出現(xiàn)異常， 導(dǎo)致ATP 合成受阻，致使花蕾中ATP 含量降低，能量供應(yīng)不足，最終導(dǎo)致花粉敗育。

本研究發(fā)現(xiàn)， 相較于其保持系和恢復(fù)系，CMS-D2 不育系3 mm、4 mm 花蕾中ATP 含量極顯著降低，4 mm 花蕾中H2O2極顯著升高；CMS-D8 不育系5 mm、6 mm 花蕾中ATP 含量極顯著降低，但未見H2O2含量升高（圖2）。 說明CMS-D2 不育系的敗育時期 （花蕾長度為3 mm時）可能早于CMS-D8 不育系（花蕾長度為5 mm時）， 這與前人通過細胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)的敗育時期較為一致[18-19]。CMS-D8 不育系鈴期葉片中ATP 含量異常升高、H2O2含量無顯著變化；但鈴期孢子體不育的CMS-D2 不育系葉片中ATP 含量極顯著降低、H2O2含量極顯著升高，這與CMS-D8 不育系不同，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的內(nèi)在機制有待進一步研究。

4 結(jié)論

CMS-D2 和CMS-D8 不育胞質(zhì)對不同發(fā)育時期的葉片和花蕾中ATP 和H2O2含量均有一定的影響， 兩種胞質(zhì)不育系花粉敗育主要與ATP合成與H2O2產(chǎn)生之間的不平衡有關(guān)。orf610a轉(zhuǎn)基因擬南芥角果和花蕾中ATP 含量極顯著降低、H2O2顯著升高，且花蕾中大多數(shù)ATP 合成相關(guān)基因的表達量極顯著下降。 本研究通過系統(tǒng)比較兩套棉花“三系”材料及orf610a超表達擬南芥中ATP 和H2O2含量及ATP 合成相關(guān)基因的表達， 從生理指標和分子水平上明確了棉花CMS-D2 和CMS-D8 胞質(zhì)不育系的敗育時期，為深入揭示兩種胞質(zhì)不育系花粉敗育的調(diào)控機制提供了思路。