中藥復配物對獼猴桃潰瘍病菌抑菌機理研究

賀富胤 ，李鳳華 ，石 浩 ，王仁才

（1.湖南應用技術學院農(nóng)林科技學院，湖南 常德 415100；2.湖南農(nóng)業(yè)大學園藝學院，長沙 410128；3.河南農(nóng)業(yè)大學園藝學院，鄭州 450002）

獼猴桃（Actinidia chinensis Planch），一種多年生大型落葉藤本漿果果樹[1]，其果肉鮮嫩多汁，口感適宜，且含有豐富的營養(yǎng)物質，包括豐富的維生素C和有多種不飽和脂肪酸、礦物質元素、蒽醌類、黃酮類、香豆素類和三萜類等有效用物質[2-4]，不僅具有保健功能，而且有多種藥用功能[5-6]，因此深受人們喜愛。但是近年來，由于獼猴桃潰瘍病的影響和發(fā)生，給獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成了巨大的影響。在生產(chǎn)中主要是通過園區(qū)管理、施用化學農(nóng)藥、選育出抗病品種和篩選抗性高的砧木進行嫁接等方法來進行防治獼猴桃潰瘍病[7]。但隨著人們對食品安全和環(huán)境保護的意識逐漸地提升，含多種營養(yǎng)物質、安全廉價、易降解且資源儲備豐富的中藥提取物抑菌劑受到人們關注[8-10]。

現(xiàn)階段研究表明，中藥提取物的抑菌機理主要是通過破壞或者影響微生物細胞壁、細胞膜的形態(tài)結構；影響微生物細胞內(nèi)正常的生理代謝和各種酶活性；阻礙微生物的DNA或者RNA的復制表達等來發(fā)揮其抑菌殺菌的作用[11-12]。董潔潔[13]研究表明鳳仙花提取液中的甲花醌和甲花甲醚是抑菌的主要成分，且通過室內(nèi)抑菌試驗和透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)甲花甲醚可作用于白色念珠菌的細胞壁和膜系統(tǒng)，使其菌體電解質和部分內(nèi)容物滲透流出，從而發(fā)揮抑菌作用。孫燕杰[14]通過對馬齒莧提取物處理過的大腸桿菌的菌液堿性磷酸酶含量測定、透射電鏡分析、胞內(nèi)蛋白SDS-PAGE電泳分析和胞外可溶性蛋白含量測定發(fā)現(xiàn)細菌的細胞壁和細胞膜的結構發(fā)生了改變，細胞的通透性增加，且菌體內(nèi)蛋白質的合成受阻。黃國霞等[15]研究發(fā)現(xiàn)山萘酚、桑色素、槲皮素和楊梅素可以影響大腸桿菌DNA的形態(tài)結構或者阻礙其DNA的復制和表達。尉研[16]在透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)0.5 mg/mL的郁金提取物作用于油菜菌核菌和山葵墨入菌中，會使油菜菌核菌的細胞壁損壞丟失，細胞質溶解，線粒體嵴多處斷裂，線粒體腫大。目前，國內(nèi)外對中藥復配物的抑菌機理的相關研究并不多，而本文前期通過對80種中藥材的抑菌篩選，發(fā)現(xiàn)到黃芩、石菖蒲、丁香、廣藿香、大蒜和牡丹提取物對獼猴桃潰瘍病菌有較好的抑制效果，同時通過響應面試驗得到這幾種提取物的較佳抑菌復配配比為：0.09∶0.16∶0.26∶0.23∶0.08∶0.18。從而開展研究該中藥復配物對菌體生長發(fā)育、細胞通透性和細胞超微結構等方面的影響，探討該中藥復配物對獼猴桃潰瘍病菌的作用機理，為今后合理設計出高效無毒的獼猴桃潰瘍病防治藥劑提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植物與菌種

黃芩、石菖蒲、丁香、廣藿香、大蒜和牡丹購置于中藥藥店，獼猴桃潰瘍病菌(P.syringae pv.actin?idiae)于湖南農(nóng)業(yè)大學實驗室通過柯赫氏法則與分子鑒定確定后，分離純化所得。

1.1.2 試劑與儀器設備

試驗試劑：蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、丙酮（分析醇）、瓊脂粉、氯化鈉和堿性磷酸酶（AKP）試劑盒，電鏡固定液，無水乙醇，以上均購于北京奧博星生物技術有限責任公司生產(chǎn)。

儀器設備：SCIENTZ-WSQ全自動微生物生長曲線分析儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；Talos F200X S/TEM透射電鏡，上海茁彩生物科技有限公司；UV7600雙光束紫外可見分光光度計，上海棱光技術有限公司；DHP-9012電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；TGL-21M高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺，三克儀器有限公司；LANYI-XH2L超聲循環(huán)提取機，上海蘭儀實業(yè)有限公司；LDZM-80LIII立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安科技有限公司；DHG-9146A干燥箱，上海申安科技有限公司；YMB-5C全自動酶標儀，廈門億恩達科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌液的制備

按照平板菌落計數(shù)法中的實驗過程制備獼猴桃潰瘍病病原菌懸浮液。在無菌條件下，用接種環(huán)將分離純化后的病原菌取至裝有0.9%氯化鈉溶的液待測管中，混合搖勻后直至濃度與5×109CFU/mL的細菌比濁管標準管濃度相似，再通過10倍遞減稀釋和一定比例稀釋成2×107CFU/mL菌懸液。從得到的菌液樣品中取1 mL菌液至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，在25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后取出計數(shù)，根據(jù)菌落的數(shù)目換算驗證菌液的濃度。

1.2.2 植物提取液的制備

將風干后的中草藥用50℃的烘箱烘干至恒重，再用粉碎機粉碎后過100目篩，得到各中草藥粉末樣品。取各中草藥粉末樣品10 g分別加入到100 mL三角瓶中，再加入50 mL丙酮溶液，用保鮮膜封口后放在28℃，150 r/min的恒溫振蕩器上混合振蕩12 h?；旌险袷幒髮⑵浞湃霔l件為40℃，超聲功率為700 w的超聲儀中作用30 min，對得到各中草藥提取液進行抽濾、濃縮，用丙酮定容配成質量濃度為1.0 g/mL的活性物質提取物。把配置好的活性提取物在無菌條件下倒入已滅菌的試管，得到各中草藥提取母液，再將它們按比例混合配置成1.0 g/mL中藥復配物，其各類中藥提取物比例為黃芩∶石菖蒲∶大蒜∶廣藿香∶牡丹∶丁香=0.09∶0.16∶0.26∶0.23∶0.08∶0.18。

1.2.3 中藥復配物最低抑菌濃度（MIC）值及最低殺菌濃度（MBC）值的測定

將配置好的中藥復配物倒入滅菌后的小試管中，用丙醇稀釋，用十倍稀釋法和二倍稀釋法將其稀釋成最終濃度為 1 000、400、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563和0.781 mg/mL的溶液，對稀釋后的提取物液進行編號，置于0～4℃冰箱中，保存?zhèn)溆?。取上述制備好?.5 mL的菌懸液于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，用滅菌后的小毛刷涂勻在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，將牛津杯插入培養(yǎng)基中心，往牛津杯中間滴加已經(jīng)稀釋了的中藥復配物，置于25℃的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)72 h，觀察病原菌的生長狀況。以滴加丙酮為對照，抑菌圈剛好大于丙酮對照組即為最低抑菌濃度（MIC），抑菌圈剛好大于最低抑菌濃度的為最低殺菌濃度（MBC）。

1.2.4 菌體生長曲線的測定

將MIC、MBC濃度的中藥復配物和丙酮分別滴加到1.5 mL的菌液中，置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中，每隔1 h取樣1次，用自動生長曲線測定儀測定600 nm處的吸光度，觀察24 h內(nèi)，OD600值的變化，并繪制獼猴桃潰瘍病菌的生長曲線，以滴加丙酮的菌液為對照。

1.2.5 中藥復配物對菌體細胞壁的影響

堿性磷酸酶（AKP）是一種含鋅的非特異性磷酸單酯酶，對于磷酸基團的代謝轉移有重要作用，在堿性環(huán)境中可催化水解脂鍵、蛋白質肽鍵等[17-18]。一般在細胞壁和細胞膜之間存有堿性磷酸酶(AKP)，只有在細胞壁被破壞導致細胞通透性增加時，堿性磷酸酶(AKP)才會溢漏到細胞外，從而檢測到其活性，因此可以通過檢測細胞外堿性磷酸酶(AKP)的活性變化來反應細胞壁通透性的改變[19-20]。往已培養(yǎng)72 h的3組菌懸液中分別滴加最低抑菌濃度的中藥復配物、最低殺菌濃度的中藥復配物與丙酮試劑后，置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 h將其置于，轉速為8 000 r/min的冷凍離心機中，離心10 min，取上層清液待測。按照堿性磷酸酶（AKP）測試盒方法處理[21]，用酶標儀測定520 nm處其吸光度，根據(jù)說明公式5-1計算并記錄堿性磷酸酶（AKP）的含量變化。

公式 5-1：AKP活性（nmol/min/mL）=（測定OD520-空白OD520）÷（標準OD520-空白OD520）×標準品濃度÷測定樣品濃度

1.2.6 中藥復配物對菌體細胞膜的影響

當細菌細胞膜被破壞時，會使得菌體的通透性增大，菌體內(nèi)的大分子物質，如蛋白質、DNA等，容易流出，而DNA和RNA在260 nm處有較大的吸收值，因此可以通過測定處理后的菌體離心液的OD260的變化，來判斷細胞膜是否損壞和菌體通透性改變程度[22]。將最低抑菌濃度與最低殺菌濃度的中藥復配物分別滴加到1.5 mL的菌液中，混勻后置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中，設立滴加丙酮的菌液為對照組。每隔1 h將其置于，轉速為3 600 r/min的冷凍離心機中，離心10 min，取上層清液用紫外分光光度計測定260 nm處的吸光度，測取8次，并統(tǒng)計記錄。

1.2.7 中藥復配物對菌體DNA含量的影響

DNA是生物正常生長繁殖不可或缺的物質，DNA缺損或者會導致菌體內(nèi)許多酶無法正常的表達或者合成，影響其生命活動，使致生物體無法保持活性逐漸死亡。瓊脂糖凝膠電泳中的DNA條帶亮暗程度顯示了DNA分子含量的多少，因此可通過對比DNA條帶亮度來闡釋處理組和對比組的DNA含量的不同[23]。將MBC濃度的中藥復配物和丙酮分別滴加到生長對數(shù)期的菌液中，每個處理做3組重復，根據(jù)細菌DNA提取試劑盒說明提取2組處理的DNA，進行1%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測、染色和凝膠成像后拍照觀察并分析。

1.2.8 菌體細胞超微結構觀察

制作丙酮處理、中藥復配物MIC和MBC濃度處理的3組菌體電鏡透射樣本。將長于固體培養(yǎng)基的，且處于生長對數(shù)期的細菌連帶著部分培養(yǎng)基一起挑置于電鏡固定液中，常溫條件下固定2 h后轉移至4℃的冰箱中保存；將處于生長對數(shù)期的細菌菌液置于冷凍離心機中，轉數(shù)為4 000 r/min，離心10 min后，棄掉培養(yǎng)基液，收集細菌沉淀至小綠豆大小即可，再用電鏡固定液在常溫下固定2 h，后轉移至4℃的冰箱中保存?zhèn)溆?。將制作的樣本用冰袋運輸送至上海茁彩生物科技有限公司進行透射觀察。

2 結果與分析

2.1 中藥復配物的最低抑菌濃度（MIC）值及最低殺菌濃度（MBC）值

中藥復配物提取液對獼猴桃潰瘍病菌的最低抑菌和殺菌濃度見表1。由表1可知，當中藥復配物濃度為3.125 mg/mL時，出現(xiàn)抑菌圈，且隨著濃度的升高，其抑菌效果也越來越好，中藥復配物最低抑菌濃度非常低，僅為3.125 mg/mL。中藥復配物最低殺菌濃度為12.5 mg/mL。

表1 中藥復配物對獼猴桃潰瘍病菌的抑菌效果Table 1 Chinese medicine compound with content of kiwi canker bacteria antibacterial effect

2.2 細菌生長曲線的測定

圖1為丙酮試劑和中藥復配物處理后的細菌生長曲線圖，從圖中可以明顯看出丙酮對照組的OD600值比中藥復配物處理后的2組要高，表明其細菌數(shù)量最多，在培養(yǎng)4 h時即達到生長對數(shù)期，而處理后的菌體生長繁殖受到了抑制，在5～6 h后才到對數(shù)期，且經(jīng)最低殺菌濃度處理后的獼猴桃潰瘍病菌生長抑菌最明顯，OD600值最低。

圖1 中藥復配物對獼猴桃潰瘍病菌生長曲線的影響Figure 1 Chinese traditional medicine compound with content of kiwi canker pathogen growth curve

2.3 中藥復配物對菌體細胞壁的影響

中藥復配物處理后，菌體細胞外堿性磷酸酶(AKP)的活性變化如圖2所示，從圖中可以看出，在滴入中藥復配物后，AKP活性相對丙酮對照組明顯都高，且作用4 h后，AKP活性值有向上增長的趨勢，表明菌液中AKP活性值開始變大，細胞通透性增加。其中經(jīng)最低殺菌濃度處理后的AKP活性值最高，在作用前4 h的時間內(nèi)，AKP活性逐漸降低，可能是由于復配物剛加入，殺死了大部分細菌，隨后細菌生長繁殖變多，使其單位體積里的AKP活性降低，4 h后，AKP活性逐漸升高可能是因為隨著細菌的增加，中藥復配物破壞的菌體細胞壁越多，死亡的細菌也變多，使得AKP活性值增加。

圖2 中藥復配物對獼猴桃潰瘍病菌細胞壁的影響Figure 2 Chinese traditional medicine compound with content of kiwi canker bacteria cell wall

2.4 中藥復配物對菌體細胞膜的影響

從圖3中可以明顯發(fā)現(xiàn)，隨著時間的增長，3組處理的OD260值也跟著增大，其中最低殺菌濃度處理后的菌液OD260最高，最低抑菌濃度處理后的次之，丙酮試劑處理后的最低，表明經(jīng)中藥復配物處理后的菌體，細胞膜受到影響，細胞通透性增大，導致菌體內(nèi)的DNA和RNA等物質大量流出，其OD260值越高，表明細胞膜破壞程度越高，流出的紫外物質越多。

圖3 中藥復配物對獼猴桃潰瘍病菌細胞膜的影響Figure 3 Effect of chinese medicine compound on cell membrane of kiwifruit ulcer pathogen

2.5 中藥復配物對菌體DNA含量的影響

從圖4中可以看出丙酮處理組的3個DNA條帶比MBC處理組的3個DNA條帶要清晰，因此可以得出經(jīng)中藥復配物處理后的獼猴桃潰瘍病菌的DNA含量比正常菌體的DNA含量要少，經(jīng)中藥復配物處理后，菌體的細胞通透性改變，使得細胞內(nèi)部的DNA分子外泄，胞內(nèi)的DNA分子含量降低。此測定結果同上述中藥復配物對菌體細胞膜影響的測定結果一致。

圖4 中藥復配物對獼猴桃潰瘍病菌DNA含量的影響Figure 4 Effect of chinese medicine compound on DNA content of kiwifruit ulcer pathogen

2.6 細菌透射電鏡觀察

從圖5中可以看出，丙酮處理的對照組（a）菌體呈現(xiàn)桿狀，形態(tài)正常，菌體飽滿，細胞壁、細胞膜完整無損害。而MIC處理組（b）的菌體形態(tài)明顯扭曲變形，甚至有個別部位出現(xiàn)缺損，使致菌體內(nèi)容物外泄。MBC處理組（c）的菌體不飽滿，細胞壁、細胞膜出現(xiàn)明顯破壞溶解，細胞內(nèi)物質大量流出。

圖5 丙酮處理和中藥復配物處理后的獼猴桃潰瘍病菌菌體透射電鏡圖Figure 5 Transmission electron microscope image of kiwifruit ulcer bacteria treated with acetone and chinese herbal compound

3 結論

本文通過測定黃芩、石菖蒲、丁香、廣藿香、大蒜和牡丹提取物按比例為0.09∶0.16∶0.26∶0.23∶0.08∶0.18組成的中藥復配物提取液對獼猴桃潰瘍病菌的最低抑菌（MIC）和殺菌濃度（MBC）、描繪細菌生長曲線以及結合中藥復配物對菌體細胞壁和細胞膜的影響分析、并以電鏡透射輔助觀察菌體形態(tài)結構的變化，綜合判斷分析中藥復配物對獼猴桃潰瘍病菌的作用效果。試驗結果表明，中藥復配物最低抑菌濃度非常低，僅為3.125 mg/mL；中藥復配物最低殺菌濃度為12.5 mg/mL。正常菌液初始OD600值為0.2左右時，需培養(yǎng)后4 h后到達其生長對數(shù)期，該試驗結果同黃其玲等[24]研究結果相似。經(jīng)中藥復配物處理后的菌體生長繁殖明顯受到了抑制，其生長到達對數(shù)期時間要比正常的晚1～2 h，且菌體的細胞壁、細胞膜及胞內(nèi)的NDA含量受到較大的影響。本研究通過胞外堿性磷酸酶（AKP）活性的測定，表明中藥復配物處理后的獼猴桃潰瘍病菌體的細胞壁被嚴重破壞，使其細胞膜裸露在外。Kong M.等[25]表明植物精油抑菌物質可作用于菌體細胞膜，改變其形態(tài)結構，從而使菌體死亡，而本實驗的中藥復配物液也含有植物精油抑菌物質，與本研究結果一致。綜上所述，該中藥復配物對獼猴桃潰瘍病菌的抑菌機理主要表現(xiàn)為：降低細菌的生命活性，使其生長繁殖緩慢；破壞菌體細胞壁和細胞膜，使胞內(nèi)的物質流出；影響菌體形態(tài)結構，使菌體扭曲變形；降低菌體內(nèi)DNA的含量，使菌體無法正常生長繁殖。