外源褪黑素對獼猴桃實生苗耐澇性的影響

袁雪偵，彭玉婷，涂美艷，梁 東，徐子鴻，，王玲利，夏 惠*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學園藝學院，成都 611130；2.四川省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所，成都 610011）

獼猴桃為獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia）雌雄異株的藤本果樹，其根為肉質根，對缺氧極其敏感。降雨量大或短時強降雨都會導致果園發(fā)生澇害[1]，使植株根系處于缺氧環(huán)境，進而影響自身生理代謝，嚴重抑制了果樹的生長發(fā)育[2]。在獼猴桃生產(chǎn)過程中，淹水脅迫成為其生長發(fā)育的限制因子。我國是世界獼猴桃栽培第一大國，提高獼猴桃的抗?jié)承詫S持獼猴桃正常生長發(fā)育，穩(wěn)定產(chǎn)量，擴大產(chǎn)區(qū)規(guī)模具有重要的意義[3]。

褪黑素（MT）是一種廣泛存在于生物體內的吲哚類激素，在植物中具有多種功能，不僅參與植物生物鐘節(jié)律性調控[4]，作為一種內源激素還調控植物的生長發(fā)育，同時也參與到植物生物和非生物脅迫的應答與防御反應[5]。在不同的植物中，MT已被證明具有提高植物對高溫[6]、低溫[7]、干旱[8]和鹽脅迫[9]的抵抗能力。陳東等[10]研究發(fā)現(xiàn)MT浸種處理降低了淹水脅迫下水稻幼苗的丙二醛（MDA）含量，提高了超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性，其中以100μmol/L MT效果最好；高帆等[11]研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫導致美味獼猴桃實生苗的脯氨酸、MDA、SOD、POD和CAT活性先上升再下降，抗壞血酸和可溶性蛋白含量先減少再增加，過氧化氫（H2O2）和可溶性糖含量顯著上升，而根灌0.1μmol/L MT預處理顯著緩解了幼苗所受的損害；夏惠等[12]研究發(fā)現(xiàn)100～200μmol/L MT預處理顯著降低了葉片相對電導率和MDA含量，提高了脯氨酸、SOD、POD和CAT活性，有效緩解了高溫脅迫對獼猴桃幼苗的損害；Wang P.等[13]通過對干旱脅迫下的蘋果樹噴施100μmol/L MT溶液，發(fā)現(xiàn)MT有效降低了葉片H2O2含量，并顯著提高了抗氧化酶活性等。但截至目前關于應用褪黑素增強獼猴桃耐澇性的研究鮮有報道[14]。

本試驗以‘布魯諾’和‘紅實2號’當年生實生苗為材料，通過不同濃度外源MT預處理后進行淹水脅迫，測定相關生理指標，結合隸屬函數(shù)法綜合評價出最適外源MT預處理濃度，以期為MT在提高果樹抗?jié)承灾械膽锰峁﹨⒖肌?/p>

1 材料和方法

1.1 試驗材料與處理

供試材料為當年生美味獼猴桃品種‘布魯諾’（A.deliciosa cv.Bruno）和中華獼猴桃品種‘紅實2號’（A.chinensis cv.Hongshi.2）的實生苗。收集的種子低溫沙藏1個月后，在裝滿基質（草炭∶珍珠巖=2∶1）的育苗盤（42 cm×42 cm×5 cm）播種，在四川省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所溫室大棚進行育苗。當幼苗長至三葉一心時，選取長勢一致的壯苗移栽于營養(yǎng)缽（10×10 cm）中，每缽一株。利用噴灌設備進行正常水分管理，并在幼苗完全展開子葉后，每兩周澆一次0.2%的尿素和0.2%磷酸二氫鉀。

當幼苗長至8葉期時，進行試驗處理。選擇整齊一致的壯苗300缽，平均分成5組處理：CK，正常澆水管理；MT0，淹水處理；MT50，50 μmol/L MT預處理后進行淹水處理；MT100，100μmol/L MT預處理后進行淹水處理；MT200，200μmol/L MT預處理后進行淹水處理。MT50、MT100和MT200這3組于19:30左右進行根灌MT處理，每2 d澆灌1次，每次100 mL/缽，CK和MT0組澆灌等量清水，澆灌4次后，除CK組，其余4組進行人工模擬淹水處理，水面高出盆土2～3 cm，每天下午補水。在淹水處理后0、2、4、6和8 d測定葉片氣體交換參數(shù)后，采取不同處理下的葉片和根系，每個處理每次取4株為一個重復，重復3次。取部分材料用于鮮樣指標的測定，如生長參數(shù)、葉綠素、氣體交換參數(shù)、類胡蘿卜素、可溶性糖、可溶性蛋白、相對電導率、丙二醛和根系活力的測定，剩余材料置于-80℃超低溫冰箱中保存，用于其它指標的測定。

1.2 生長指標的測定

每處理隨機取10株，洗凈晾干，用米尺測定株高、根長，游標卡尺測定從下往上3～4位葉之間的莖粗，再利用CI-202便攜式葉面積儀測定葉面積，最后將植株根、莖、葉剪成適當大小分裝，放入烘箱中，在105℃殺青15 min后，調至80℃烘至恒重，分別用電子天平稱取干重，計算平均值。

1.3 生理指標的測定

葉綠素、類胡蘿卜素、可溶性糖、可溶性蛋白、MDA含量、SOD和POD活性的測定參照李合生的方法[15]；相對電導率的測定參照徐新娟[16]的方法；過氧化氫（H2O2）含量和CAT活性的測定采用紫外分光光度法[17]；根系活力的測定參照高俊鳳的方法[18]；根系蘋果酸脫氫酶（MDH）活性和乙醇脫氫酶（ADH）活性的測定參考郭欣欣的方法[19]。

1.4 隸屬函數(shù)法

首先計算出各處理組抗?jié)诚嚓P指標的具體隸屬值，當指標與耐澇性呈正相關時，利用公式（1）進行計算，呈負相關時，利用公式（2）進行計算：

式中：U（Xi）為每個指標的耐澇隸屬函數(shù)，Xi為第i個指標的測定值，Xmin、Xmax為第i個指標的最小測量值和最大測量值。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Microsoft Excel 2020進行數(shù)據(jù)分析及圖表制作，用SPSS 22.0進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 褪黑素對淹水脅迫下獼猴桃幼苗外觀形態(tài)的影響

與正常澆水對照（CK）相比，淹水處理第8天，兩個品種的幼苗葉片均出現(xiàn)不同程度的卷曲、萎蔫，根系損傷明顯。但褪黑素預處理組幼苗葉片和根系狀態(tài)好于MT0組，其中MT50組狀態(tài)與CK最接近，緩解效果最明顯（圖1）。

圖1 褪黑素對淹水脅迫下獼猴桃幼苗表型的影響Figure 1 Effects of melatonin on and morphology in kiwifruit seedlings under waterlogging stress

2.2 褪黑素對淹水脅迫下獼猴桃幼苗生長指標的影響

淹水處理第8天，兩個品種的株高、根長、莖粗、葉面積和干重整體表現(xiàn)為：CK>MT50>MT100>MT200>MT0。與CK相比，兩個品種MT0的株高、根長、葉面積和葉干重均顯著性降低，‘布魯諾’的根干重和‘紅實2號’的莖干重也顯著性減少,而MT預處理不同程度地提高了株高和葉面積（表1）。

表1 褪黑素對淹水脅迫下獼猴桃幼苗生長指標的影響Table 1 Effects of melatonin on growth indexes in kiwifruit seedlings under waterlogging stress

2.3 褪黑素對淹水脅迫下獼猴桃幼苗光合色素的影響

淹水處理第8天，兩個品種的葉綠素、類胡蘿卜素含量提高，表現(xiàn)為：MT100>MT50、MT200>MT0>CK，而葉綠素a/b減小，但MT50～MT200整體大于MT0（表2）。

表2 褪黑素對淹水脅迫下光合色素的影響Table 2 Effects of melatonin on photosynthetic pigments under waterlogging stress

2.4 褪黑素對淹水脅迫下獼猴桃幼苗氣體交換參數(shù)的影響

淹水第0天，兩個品種不同處理組的凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、氣孔導度（Gs）和胞間CO2濃度（Ci）均無明顯差異。淹水處理后，氣體交換參數(shù)Pn、Gs和Tr均較對照顯著下降，MT處理有一定的緩解作用，其中MT100處理的Pn下降程度最低。對于Ci，淹水處理前期（2～4 d）變化不明顯，但在后期（6～8 d）顯著高于對照，其中MT100處理增幅最大（圖2）。結果表明，淹水脅迫導致獼猴桃幼苗氣體交換參數(shù)的下降，但外源MT能減緩淹水脅迫對光合參數(shù)的影響，以100μmol/L MT對兩個品種的效果最明顯。

2.5 褪黑素對淹水脅迫下獼猴桃幼苗滲透調節(jié)物質的影響

淹水第0天，兩個品種不同處理組的可溶性糖和可溶性蛋白含量均無顯著性差異（圖3）。

圖3 褪黑素對淹水脅迫下獼猴桃幼苗可溶性糖、可溶性蛋白含量的影響Figure 3 Effects of melatonin on soluble sugar and soluble protein in kiwifruit seedlings under waterlogging stress

淹水第2～8天，‘布魯諾’CK對照組的可溶性糖含量均小于MT處理組，差異顯著。MT處理組中，淹水第4天，MT100的可溶性糖含量最高，MT0最低，MT100的可溶性蛋白含量最高，MT0、MT50和MT200差異不顯著。淹水第8天，MT100的可溶性蛋白含量最高，差異顯著。

淹水第2～8天，‘紅實2號’CK對照組的可溶性糖含量均小于MT處理組。MT處理組中，淹水第2天，MT50的可溶性糖含量最高，淹水第6、8天，均表現(xiàn)為MT100>MT50>MT200>MT0。淹水第8天，MT100的可溶性蛋白含量最高，差異顯著。

綜上可知，淹水脅迫導致獼猴桃幼苗滲透調節(jié)物質的上升，總體表現(xiàn)為：MT50、MT100>MT200>MT0。結果表明，外源MT能促進滲透調節(jié)物質的合成，進而增加細胞滲透勢，提高抗?jié)承?，其中‘布魯諾’在100μmol/L MT處理下效果最好，‘紅實2號’以50、100μmol/L MT較好。

2.6 褪黑素對淹水脅迫下獼猴桃幼苗細胞膜透性的影響

淹水第0天，兩個品種不同處理組的相對電導率、過氧化氫（H2O2）和丙二醛（MDA）含量差異不明顯，淹水第2～8天，CK對照組整體上小于MT處理組（圖4）。

圖4 褪黑素對淹水脅迫下獼猴桃幼苗相對電導率、H2O2、MDA含量的影響Figure 4 Effects of melatonin on relative conductivity,H2O2,MDA in kiwifruit seedlings under waterlogging stress

MT處理組中，淹水第8天，‘布魯諾’MT50的相對電導率最低，其余MT處理差異不顯著；淹水第4天，MT50的MDA含量最低，MT0最高，差異顯著，淹水第8天，MT100最低；淹水第6天的MT100和淹水第8天的MT50處理組的H2O2含量最低，差異顯著，MT0最高。

MT處理組中，淹水第4天，‘紅實2號’MT100的相對電導率最低，淹水第8天，MT50最低，MT0最高；淹水第2～8天，MT50～MT200的MDA含量較MT0下降，其中MT50的下降幅度最大；淹水第8天，MT0的H2O2含量最高。

綜上可知，淹水脅迫導致獼猴桃幼苗細胞膜透性增大，但MT50～MT200的相對電導率、H2O2和MDA含量總體上小于MT0，總體表現(xiàn)為MT50、MT100

2.7 褪黑素對淹水脅迫下獼猴桃幼苗抗氧化酶活性的影響

淹水第0天，兩個品種不同處理組的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性差異均不顯著，淹水第2～6天時，CK對照組小于MT處理組，淹水第8天，整體上高于MT0（圖5）。

圖5 褪黑素對淹水脅迫下獼猴桃幼苗SOD、POD、CAT活性的影響Figure 5 Effects of melatonin on activities of SOD,POD and CAT in kiwifruit seedlings under waterlogging stress

MT處理組中，淹水第8天，‘布魯諾’MT100的SOD活性最高；淹水第4～8天，POD活性均表現(xiàn)為：MT100>MT200>MT50>MT0；淹水第4～8天，CAT活性均表現(xiàn)為：MT50>MT100>MT200>MT0。

MT處理組中，淹水第2天，‘紅實2號’MT50的SOD活性最高，淹水第8天，MT100最高，MT0最低，差異顯著；淹水第2～6天，POD活性均表現(xiàn)為：MT100>MT50>MT200>MT0，差異顯著；淹水第8天，MT100的CAT活性最高，MT0最低，差異顯著。

綜上可知，淹水脅迫下，兩個品種MT50～MT200的抗氧化酶活性總體上大于MT0，總體表現(xiàn)為MT50、MT100>MT200>MT0，結果表明，外源MT增強了植物清除活性氧、穩(wěn)定質膜透性的能力，以50、100μmol/L MT對兩個品種的效果更明顯。

2.8 褪黑素對淹水脅迫下獼猴桃幼苗根系活力及呼吸酶活性的影響

淹水第0天，兩個品種不同處理組的根系活力、蘋果酸脫氫酶（MDH）和乙醇脫氫酶（ADH）活性差異均不明顯，淹水第2～8天，根系活力和MDH的CK對照組大于MT處理組（圖6）。

圖6 褪黑素對淹水脅迫下獼猴桃幼苗根系活力、MDH、ADH活性的影響Figure 6 Effects of melatonin on root activity,MDH,ADH in kiwifruit seedlings under waterlogging stress

MT處理組中，淹水第6天，‘布魯諾’MT100的根系活力最高，MT0最低，而MT50的ADH活性最高，MT0最低，差異顯著。淹水第4天，MT50～MT20 0的MDH活性大于MT0。

MT處理組中，淹水第4天，‘紅實2號’MT100的根系活力最高，MT0最低，差異顯著，淹水第8天，MT50最高。淹水第2～8天，MT50～200的MDH活性大于MT0。淹水第4天，MT100的ADH活性最高，MT0最低，淹水第8天，MT100最高，其余MT處理差異不顯著。

綜上可知，淹水脅迫導致根系活力和MDH活性下降，兩個品種MT50～MT200的根系活力和MDH、ADH活性總體上大于MT0，總體表現(xiàn)為MT50、MT100>MT200>MT0。結果表明，外源MT能減緩淹水脅迫對植物根系結構和功能的影響，以50、100μmol/L效果更明顯。

2.9 隸屬函數(shù)綜合分析

本試驗中，通過對各項指標測定值進行定量轉換，計算株高、根長、莖粗等27項指標的隸屬函數(shù)值，再計算出平均值作為淹水脅迫下兩個品種生長狀況的綜合評定結果，函數(shù)值越大代表獼猴桃幼苗所處的環(huán)境越適宜。由表3可知，兩個品種的隸屬函數(shù)均值排序為CK>MT100>MT50>MT200>MT0，MT50～MT200的函數(shù)值均介于CK與MT0之間，說明不同濃度外源MT預處理對淹水脅迫下兩個品種幼苗的生長具有緩解作用，且以100μmol/L MT的抗?jié)承Ч詈谩?/p>

表3 隸屬函數(shù)綜合評價Table 3 Membership function comprehensive evaluation

3 討論

3.1 褪黑素根灌預處理緩解了淹水脅迫對獼猴桃幼苗表型的損傷

當遭受淹水脅迫時，植物會通過主動或被動的形態(tài)調節(jié)來提高適應性[20]。根系是生理活性物質同化和轉化的重要場所，其生長狀況和新陳代謝直接影響地上部的發(fā)育、干物質的累積和最終產(chǎn)量的形成[21]。本試驗中，淹水脅迫導致獼猴桃幼苗卷曲萎蔫，抑制了株高、根長、莖粗、葉面積和干重等形態(tài)指標。外源MT根灌預處理促進了淹水脅迫下獼猴桃幼苗生長參數(shù)的增加，減小了幼苗受害程度，這與刁倩楠[22]和高青海[23]的研究結果一致，其中，50μmol/L MT處理組的幼苗狀態(tài)和各生長參數(shù)與CK對照組最接近，比100、200μmol/L MT效果更好，表明MT處理能有效緩解淹水脅迫對獼猴桃生長發(fā)育的抑制，促進獼猴桃生長及內部營養(yǎng)物質的積累[24]。

3.2 褪黑素根灌預處理促進了淹水脅迫下獼猴桃幼苗的光合作用和抗氧化酶活性

光合色素是植物進行光能的吸收、傳遞和轉化的重要物質基礎[25]。MT有助于保護葉綠素分子的完整性從而維持較高的光合效率[26]。本試驗中，淹水脅迫第8天，葉綠素和類胡蘿卜素含量的升高是一種適應行為，尹冬梅[25]和羅芳麗[27]等也有相同的報道。何斌源等[28]認為葉綠素含量增加是紅樹對淹水脅迫的適應機制之一，隨著水淹時間的延長，相當于處于較蔭蔽的環(huán)境，光合色素含量的增加有助于集中在較短的光照時間內采光。本研究結果表明獼猴桃可能也存在類似的機制。淹水脅迫會導致植物葉片氣孔關閉，以減少水分的蒸發(fā)，但同時會影響氣體擴散，降低光合作用，還會造成活性氧增加，對光合反應中心和葉綠體結構產(chǎn)生一定破壞[29]。本試驗中，兩個品種 MT0～MT200的Pn、Gs和Tr均低于CK，Ci在第2、4天低于CK，在第6、8天時高于CK，說明淹水前期光合效率下降主要是由氣孔限制導致的，淹水后期主要由非氣孔限制引起的，是光合器官受到損傷[30]。MT根灌預處理改善了淹水脅迫下獼猴桃幼苗的光合作用，其中，50、100μmol/L MT的處理效果明顯高于200μmol/L，與楊小龍[31]關于MT對干旱脅迫下番茄光合作用的研究結果一致。說明低中濃度MT能更好地促進葉片光合色素含量的增加，保護葉綠體和光合作用機構，進而提高光合作用[32]。

細胞膜具有控制細胞與外界環(huán)境物質交換和信息傳遞的作用，能維持細胞的微環(huán)境，穩(wěn)定細胞的代謝過程[33]。正常情況下，植物細胞內自由基的產(chǎn)生與消除處于動態(tài)平衡，當遭受脅迫時，會產(chǎn)生大量活性氧，造成膜相變和膜結構的破壞[11]。本試驗中，淹水脅迫下兩個品種MT0～MT200的相對電導率、H2O2和MDA含量大于CK，表明淹水脅迫導致幼苗產(chǎn)生大量H2O2，造成氧化損傷，進而使細胞受損，膜透性增大，細胞內電解質外滲，細胞物質交換平衡被破壞，膜脂過氧化產(chǎn)物MDA增加，但兩個品種MT50～MT200均低于MT0，表明不同濃度MT預處理減緩了相對電導率、H2O2和MDA含量的增加，其中，以50、100μmol/L MT效果比200μmol/L更明顯，說明低、中濃度MT對活性氧的清除具有更高的效率，能保護細胞膜的完整性，進而降低活性氧對細胞膜的傷害。在脅迫過程中，植株會通過提高滲透調節(jié)物質及抗氧化酶活性來緩解脅迫造成的損傷。SOD、POD和CAT是植物體內重要的細胞保護酶，主要作用是清除活性氧自由基，使活性氧保持動態(tài)平衡，進而保持細胞膜的穩(wěn)定性[34]。本試驗中，淹水脅迫下兩個品種MT50～MT200的SOD、POD和CAT活性整體高于MT0，50、100μmol/L MT的處理效果明顯高于200μmol/L，表明低、中濃度MT更能提高抗氧化酶的活性、基因表達量，促進了內源抗氧化劑的再生，降低了活性氧水平，從而保護生物膜免受氧化損傷[35-37]。與趙成鳳[38]和尉欣榮[39]關于噴施100μmol/L MT對干旱脅迫下玉米和黑麥草的緩解效果一致。

3.3 褪黑素根灌預處理促進了淹水脅迫下獼猴桃幼苗的根系活力和呼吸酶活性

根系主要供應植株生長所需要的水分和礦物質，根系活力是體現(xiàn)植物根系吸收、合成、氧化還原能力和生長發(fā)育狀況的綜合指標[40]。根系呼吸作用能為植物生命活動提供所需要的大部分能量，本試驗中，淹水脅迫下兩個品種MT0～MT200的根系活力和MDH活性小于CK，ADH活性整體大于CK，表明淹水脅迫導致植物有氧呼吸受阻，ATP供應不足，無氧呼吸被促進，ATP合成減少[41]，其中，MT50～MT200總體高于MT0，50、100 μmol/L MT的處理效果明顯高于200μmol/L，表明低、中濃度MT預處理能更好地緩解淹水脅迫對根系的損傷，使植株仍然能維持自身根系的生理機能，從而保證地上部的生長。

3.4 隸屬函數(shù)綜合分析

單一的指標不能充分反應獼猴桃對澇害的適應能力，也不能篩選出最適MT預處理濃度，只有通過多項指標的綜合評價，才能較準確地反映獼猴桃的抗?jié)承裕`屬函數(shù)法是模糊數(shù)學的一種方法，是將原本孤立的指標采用統(tǒng)計的方法轉化為綜合指標，因而評價結果較為準確和可靠。本試驗中，隸屬函數(shù)分析結果表明，兩個品種的最佳MT根灌預處理濃度均為100μmol/L。

4 結論

綜上所述，不同濃度褪黑素根灌預處理通過提高獼猴桃幼苗的根系活力、滲透調節(jié)能力和光合作用減小了淹水脅迫對獼猴桃幼苗的損害，從而促進了獼猴桃幼苗的生長發(fā)育和干物質的積累。綜合評價得，兩個品種在100μmol/L MT預處理下對淹水脅迫的緩解效果最好。