5種晚熟柑橘多甲氧基黃酮提取方法比較及應(yīng)用

金錚華，黃澤浩，畢曉藝，李云杰，王 迅，鄧紅紅，古咸杰，廖 玲*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，成都 611130；2.綿陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，四川 綿陽(yáng) 621000）

柑橘是我國(guó)南方栽培面積最廣、經(jīng)濟(jì)地位最重要的果樹(shù)[1-2]。柑橘屬植物的果皮具有很高的藥用價(jià)值，柑橘果皮中生物活性物質(zhì)包括類黃酮、類檸檬苦素和類胡蘿卜素等；類黃酮可分為黃酮、黃酮醇和黃烷酮等[3]。多甲氧基黃酮（polymethoxylated flavones，PMFs）是指含有兩個(gè)或兩個(gè)以上甲氧基團(tuán)的天然黃酮類物質(zhì)的總稱，具有多種生物活性[4-6]，幾乎僅存在于柑橘屬中，特別是柑橘果皮中的黃酮類化合物[7-9]。如寇廣寧[5]用醇提法配合超聲法輔助提取大紅袍紅橘多甲氧基黃酮，最終檢測(cè)出其總多甲氧基黃酮含量高達(dá)(283.40±13.20)mg/100 g FW。最新的醫(yī)學(xué)報(bào)道中，有研究者通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬篩選，發(fā)現(xiàn)橙皮苷對(duì)冠狀病毒SARS-CoV-2所含蛋白酶的抑制作用，這表明將柑橘果皮運(yùn)用到新型冠狀病毒的防治成為可能[10]。

柑橘按成熟期分為10月底前成熟的早熟品種、11—12月成熟的中熟品種、翌年1—5月成熟的晚熟品種。晚熟柑橘對(duì)優(yōu)化柑橘產(chǎn)業(yè)供應(yīng)具有重要作用[11-12]。四川目前主栽的晚熟柑橘品有‘春見(jiàn)’‘大雅’‘沃柑’‘黃果柑’和‘塔羅科血橙’等。‘春見(jiàn)’是橘橙‘清見(jiàn)’與‘椪柑’F-2432雜交育成的高糖、低酸、晚熟優(yōu)良雜交柑橘品種。因四川地區(qū)獨(dú)特的地理優(yōu)勢(shì)，使得‘春見(jiàn)’果實(shí)品質(zhì)優(yōu)良，經(jīng)濟(jì)效益良好，深受柑橘種植戶們的喜愛(ài)[13]。吳躍輝等[14]研究發(fā)現(xiàn)，‘春見(jiàn)’果實(shí)中的橙皮苷、柚皮苷集中在皮渣囊衣部分，在果肉和籽粒中幾乎為零?！笱拧怯芍袊?guó)柑橘研究所用‘清見(jiàn)’和新生系3號(hào)椪柑雜交育成，果實(shí)外觀和樹(shù)體均酷似‘春見(jiàn)’，但品質(zhì)超過(guò)‘春見(jiàn)’。蒲成偉等[15]研究發(fā)現(xiàn)，‘大雅’果皮光滑，油胞密度密，極易剝皮，耐貯性中等，適合用于提取多甲氧基黃酮?！指獭恰蛊諣枴俪群汀の鳌t橘的雜交品種，屬于寬皮柑橘類型[16]。蒲成偉等[15]研究表明，‘沃柑’果皮較薄，平均厚度為0.66 mm，油胞密度密，有果皮加工的潛力?！S果柑’屬蕓香科柑橘屬的橘、橙天然晚熟雜交品種，在雅安市石棉縣境內(nèi)已有數(shù)百年栽培歷史[17]，具有特晚熟、極豐產(chǎn)、適應(yīng)性廣和易栽培等特點(diǎn)，僅石棉縣已有0.53萬(wàn)hm2的種植面積[18]。李秀娟[19]用超聲波輔助提取法提取‘黃果柑’、紅橘和莽山野橘果皮的黃烷酮，結(jié)果顯示‘黃果柑’果皮中柚皮苷含量極少，橙皮苷含量較高，且明顯高于紅橘和莽山野橘?！_科血橙’是蕓香科柑橘屬甜橙類的栽培品種，成熟期在1月中旬—2月中旬，因果肉有紅色血絲或血斑而得名，其皮渣中含有豐富的果膠、維生素和橙皮苷等成分[20]。

目前對(duì)柑橘PMFs的研究主要以早、中熟品種為研究對(duì)象，且主要集中于1～2種提取方法的評(píng)價(jià)，對(duì)‘黃果柑’果皮中PMFs的提取和綜合考慮多種提取方法的研究較少。如趙梓燕[21]利用震蕩提取和超聲提取對(duì)紅橘果皮多甲氧基黃酮進(jìn)行單因素試驗(yàn)的提取比較。當(dāng)兩種方法提取TPMF含量相同時(shí)，超聲輔助提取用時(shí)明顯小于浸漬震蕩提取，表明超聲波對(duì)PMFs的溶解具有顯著的促進(jìn)作用?！S果柑’作為石棉縣內(nèi)種植廣泛，產(chǎn)量極高，易于栽培的生產(chǎn)栽培品種，具有極大的研究?jī)r(jià)值。因此本試驗(yàn)分別對(duì)超聲提取、振蕩提取和微波提取這3種方法進(jìn)行優(yōu)化、比較，篩選出一種簡(jiǎn)單、提取率高和經(jīng)濟(jì)的‘黃果柑’PMFs提取方法，并用該方法對(duì)5種晚熟柑橘果皮中PMFs含量進(jìn)行對(duì)照分析，本研究為多甲氧基黃酮的分離檢測(cè)提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選取位于四川省雅安市石棉縣坪陽(yáng)村柑橘標(biāo)準(zhǔn)示范園內(nèi)長(zhǎng)勢(shì)良好、樹(shù)齡樹(shù)勢(shì)基本一致的‘黃果柑’‘沃柑’‘春見(jiàn)’‘大雅’和‘塔羅科血橙’5 個(gè)品種的果樹(shù)為材料，園內(nèi)以枳殼為基砧，株行距為3 m×4 m，樹(shù)齡5 a。該示范園地處亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，以低山河谷干熱氣候?yàn)橹?，平均降水量偏少。全年干濕分明，年降水?77.4 mm，氣溫年較差較小，日較差較大，多年平均氣溫17.1℃，無(wú)霜期平均326 d，年日照實(shí)數(shù)為1 245.6 h。采摘時(shí)于果實(shí)成熟期選取每個(gè)品種果樹(shù)各3棵，每株為一個(gè)處理，共3次重復(fù)，在果樹(shù)的東、南、西和北4個(gè)方向樹(shù)冠外圍選取大小均衡、果形一致的果實(shí)各2個(gè)，每株樹(shù)8個(gè)果實(shí)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 樣品制備

采摘后將果實(shí)洗凈擦干并用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，在冰上分離果皮，將果皮剪碎成1 cm2大小的碎片裝袋冷凍，以便于粉碎研磨，試驗(yàn)前統(tǒng)一用粉碎機(jī)充分研磨并置于-80℃冰箱中保存。

表1 樣品信息Table1 Information of samples

1.2.2 試驗(yàn)方法

分別參照寇廣寧[5]的超聲提取方法、張?jiān)穂22]的振蕩提取方法和劉志聰[23]的微波提取方法；加以適當(dāng)調(diào)整，以提取劑、時(shí)間和料液比為影響因素，每因素設(shè)定三個(gè)水平，進(jìn)行三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，選用L9(33)正交實(shí)驗(yàn)表（表2）。所有提取均重復(fù)兩次且合并提取液。

表2 提取方法正交表Table 2 Orthogonal table of multiple extraction methods

1.3 測(cè)定方法

采用紫外-分光光度計(jì)對(duì)提取液的總多甲氧基黃酮含量進(jìn)行測(cè)量比較，檢測(cè)波長(zhǎng)采用330 nm[24]。以川陳皮素作為對(duì)照品[6]進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定制作。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2016軟件，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 26進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用Origin 2022進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

精密稱取川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)品400μg，分別用甲醇、乙醇和乙酸乙酯溶解并定容，配置成含川陳皮素200μg/mL的對(duì)照品溶液備用，4℃下避光保存。用對(duì)應(yīng)試劑稀釋配置成7個(gè)質(zhì)量濃度水平，在330 nm波長(zhǎng)下分別測(cè)定吸光度值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，制成下表。

2.2 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液高（26μg/mL）、中（14μg/mL）和低（2μg/mL）3個(gè)質(zhì)量濃度，在330 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，平行3次，測(cè)得其RSD值分別為0.45%、0.55%和0.40%，說(shuō)明試驗(yàn)所用分光光度計(jì)在不同濃度下精密度良好。

2.3 不同提取方法對(duì)‘黃果柑’果皮PMFs提取量的影響

由表4可知，超聲提取中，處理U2（提取劑：甲醇；時(shí)間：45 min；料液比為1∶20）的提取效果最好，為(373.961±2.069)μg/100 mg；顯著高于其余8個(gè)處理。震蕩提取中處理O3（提取劑：甲醇；時(shí)間：3 h；料液比為1∶30）的提取效果最好，為(345.377±0.748)μg/100 mg。顯著高于其余7個(gè)處理，提取量高于O2，但與O2處理間差異不大。微波提取法中，處理M2（提取劑：甲醇；時(shí)間：45 s；料液比為1∶20）的提取效果最好，為(389.559±2.820)μg/100 mg。顯著高于其余8個(gè)處理。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)表Table 3 Standard curve data sheet

表4 ‘黃果柑’果皮PMFs 3種提取方法提取結(jié)果Table 4 The results of three extraction methods in ′Huangguogan′peel

2.4 3種PMFs提取方法的篩選

采用不同提取方法提取‘黃果柑’PMFs的效果不同，超聲提取法、振蕩提取法和微波提取法3種提取方法中PMFs提取量最大的處理分別為U2（373.961±2.069） μg/100 mg、O3（348.654±4.513）μg/100 mg 和 M2（389.559±2.820）μg/100 mg。其中，最有效、提取率最高的為M2處理組合（提取劑：甲醇；時(shí)間：45 s；料液比為1∶20）。

對(duì)以上3種處理進(jìn)行LSD分析，結(jié)果表明，M2（提取劑∶甲醇；時(shí)間：45 s；料液比為1∶20）的提取方法對(duì)‘黃果柑’果皮中多甲氧基黃酮的提取率最高（圖1）。這可能與提取過(guò)程中的作用方式相關(guān)，超聲輔助提取法通過(guò)超聲波的空化效應(yīng)，破壞植物細(xì)胞壁來(lái)提高目標(biāo)化合物的釋放[9]；振蕩提取法通過(guò)增大提取劑與樣品間的接觸，增大提取效率；而微波輔助提取法則是通過(guò)微波作用使得植物樣品吸收大量的能量，而外部溶劑熱量較低，從而在細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生熱應(yīng)力，加快植物細(xì)胞壁的破裂，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)直接與較冷的提取劑接觸，從而加快了目標(biāo)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)移過(guò)程。所以在提取劑、料液比相同的情況下，微波提取法提取率更高，用時(shí)更短，耗能更少[23]，對(duì)‘黃果柑’果皮中PMFs的提取有明顯促進(jìn)作用。

圖1 不同處理方法對(duì)‘黃果柑’PMFs提取量的結(jié)果Figure 1 Results of PMFs extraction from ′Huangguogan′by different treatment methods

2.5 5種晚熟柑橘間PMFs含量的比較

以2.3的3種處理方法對(duì)‘黃果柑’‘沃柑’‘春見(jiàn)’‘大雅’和‘塔羅科血橙’5個(gè)品種進(jìn)行PMFs含量的比較發(fā)現(xiàn)，不同品種PMFs提取量不同。U2處理中，PMFs提取量大小的品種順序?yàn)椤指獭?‘黃果柑’>‘大雅’>‘春見(jiàn)’>‘血橙’；O3處理中，順序?yàn)椤指獭?‘黃果柑’>‘春見(jiàn)’>‘大雅’>‘血橙’；M2處理中的順序?yàn)椤指獭?‘黃果柑’>‘春見(jiàn)’>‘大雅’>‘塔羅科血橙’。結(jié)果表明3種處理方法中，‘沃柑’PMFs提取量均最高且顯著高于‘黃果柑’；‘黃果柑’PMFs提取量次之，且顯著高于‘春見(jiàn)’‘大雅’‘沃柑’，這與李利改[25]的研究結(jié)果相符合。

3 討論

由表4可知，不同提取方法對(duì)‘黃果柑’果皮中PMFs的提取量的影響不同。超聲提取法最優(yōu)處理為U2組合（提取劑：甲醇；時(shí)間：45 min；料液比：1∶20），這與趙梓燕[21]對(duì)提取劑、時(shí)間和料液比的單因素試驗(yàn)結(jié)果相符合；振蕩提取法最優(yōu)處理為O3組合（提取劑：甲醇；時(shí)間：3 h；料液比：1∶30），這與聶超[26]對(duì)震蕩提取的結(jié)論相一致；微波提取法最優(yōu)處理為M2組合（提取劑：甲醇；時(shí)間：45 s；料液比：1∶20），這與呂名秀[27]對(duì)微波提取法中料液比的單因素試驗(yàn)結(jié)論一致。在這3種提取方法中，‘黃果柑’PMFs提取量最高的處理方法是微波提取法M2處理組合，提取量高達(dá)(389.559±2.820)μg/100 mg。并且在相同處理?xiàng)l件下，PMFs提取量大小為微波提取法>超聲提取法>振蕩提取法，這表明微波對(duì)PMFs的提取促進(jìn)效果更強(qiáng)，這也與呂名秀[27]等的研究結(jié)果相一致。

由表5可知，其余4個(gè)柑橘品種均能提取并檢測(cè)出目標(biāo)化合物，且產(chǎn)物含量均在200μg/100 mg以上。PMFs提取量在(195.120～431.651)μg/100 mg之間，這與許引[28]的研究結(jié)果相符合，說(shuō)明3種提取方法有效。

表5 3種處理對(duì)5種柑橘PMFs提取量的影響Table 5 Effects of three treatments on PMFs extraction of five kinds of citrus

表5結(jié)果說(shuō)明柑橘品種本身對(duì)提取量的影響較大，這也可能與柑橘果實(shí)的品質(zhì)相關(guān)[17]。從表5中可以明顯看出3種提取方法在不同品種上的提取效果差異很大，其原因可能與柑橘品種果皮本身的特性有關(guān)?！指獭贩N生長(zhǎng)勢(shì)旺，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累豐富，且油胞密度大，單位質(zhì)量的果皮粉末中所含的PMFs百分含量更大，因此在相同處理中，提取量均高于其他品種?！S果柑’果樹(shù)生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，掛果時(shí)間長(zhǎng)又極其豐產(chǎn)，較長(zhǎng)的果實(shí)發(fā)育和保留期在果皮PMFs的積累中也存在一定的影響。由此導(dǎo)致‘黃果柑’果皮PMFs含量較高。

5個(gè)品種PMFs提取量在不同組合下并不一致，且在提取量上也存在極大差異，該現(xiàn)象與寇廣寧[5]在研究討論時(shí)描述的現(xiàn)象相同，其中‘沃柑’‘大雅’和‘塔羅科血橙’3個(gè)品種PMFs提取量大小順序?yàn)閁2>M2>O3，‘黃果柑’與‘春見(jiàn)’的PMFs提取量大小順序均為：M2>U2>O3。這表明相同處理?xiàng)l件下，不同品種對(duì)PMFs提取量大小的影響不同。進(jìn)一步說(shuō)明了M2處理是針對(duì)‘黃果柑’品種PMFs提取的最優(yōu)處理組合。

4 結(jié)論

綜上所述，本試驗(yàn)通過(guò)研究超聲提取法、振蕩提取法和微波提取法對(duì)‘黃果柑’果皮PMFs提取量的影響，從27種處理中篩選出‘黃果柑’PMFs提取的最優(yōu)組合為M2組合（提取劑：甲醇；提取時(shí)間：45 s；料液比：1∶20）。其次，在相同處理方法（M2）中，PMFs提取量最高的是‘沃柑’，達(dá)到(431.651±1.711)μg/100 mg?！S果柑’中的PMFs提取量居于第二，‘春見(jiàn)’和‘大雅’間差異不大，‘塔羅科血橙’提取量最小。本試驗(yàn)結(jié)果為多甲氧基黃酮的分離檢測(cè)提供了參考依據(jù)。