浙江象山港表層沉積物中甲藻孢囊多樣性與分布研究

謝昌良， 王朝暉， 王文婷， 陳佳卓， 張宇寧， 鄭虎， 柏瑤蘋

(1. 暨南大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 廣東 廣州 510632； 2. 惠州市海洋與漁業(yè)局大亞灣經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)分局， 廣東 惠州 516081)

甲藻是海洋生態(tài)系統(tǒng)中重要的浮游植物類群，其種類和數(shù)量僅次于硅藻，也是有毒有害赤潮的重要原因種。許多甲藻在其生活史的某個階段能形成體眠孢囊，當(dāng)外部環(huán)境條件惡劣時，甲藻細(xì)胞壁增厚形成甲藻孢囊，并隨其他碎屑物質(zhì)沉入海底，當(dāng)外部環(huán)境適宜時，甲藻重新以營養(yǎng)細(xì)胞的形式進入水體進行生命活動[1-2]。常見的近岸海域循環(huán)發(fā)生赤潮的物種許多為可形成孢囊的種類，沉積物中孢囊萌發(fā)亦成為翌年赤潮發(fā)生的種源。由于浮游植物有較厚的耐受性孢囊壁，在外部條件穩(wěn)定的情況下存活時間可達數(shù)十年、甚至上百年[3]。因此沉積物中孢囊的密度以及百分比含量可以反映當(dāng)時海域浮游植物狀況以及赤潮發(fā)生歷史，也可揭示水體營養(yǎng)細(xì)胞種群動態(tài)和未來赤潮的發(fā)生潛勢。

象山港是多種魚蝦貝藻等海洋生物棲息、生長繁殖和育肥的優(yōu)良場所，是浙江省最大的水產(chǎn)養(yǎng)殖基地，同時也具有海洋旅游及濕地保護的重要作用。近年來，隨著沿岸地區(qū)工農(nóng)業(yè)發(fā)展及人類活動影響，象山港海域富營養(yǎng)化問題顯著，養(yǎng)殖區(qū)水質(zhì)已經(jīng)呈現(xiàn)出劣Ⅳ類水質(zhì)[4-5]。象山港水域赤潮最早記錄出現(xiàn)在1973年，近年來象山港海域赤潮發(fā)生面積不斷擴大，頻率不斷增加，主要赤潮種類包括中肋骨條藻、角毛藻等硅藻赤潮，甲藻赤潮也時有發(fā)生[4]。孢囊被認(rèn)為是赤潮發(fā)生的“種源”[2]，但是目前有關(guān)象山港沉積物中甲藻孢囊的報道并不多見，對于有毒有害甲藻的孢囊的關(guān)注更是少有。為了了解象山港甲藻孢囊的分布狀況，揭示有毒有害甲藻赤潮發(fā)生潛勢，本研究采集了象山港表層沉積物樣品，對沉積物中甲藻孢囊的分布規(guī)律進行研究，重點闡明有毒有害甲藻孢囊的分布；同時測定了沉積物中生源要素含量，分析孢囊分布與生源要素的關(guān)系，以期為象山港的環(huán)境保護和海洋資源可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

甲醛溶液(37%)、氫氧化鈉(NaOH，上海麥克林)、過硫酸鉀(K2S2O8，上海麥克林)、鉬酸銨[(NH4)2MoO4，上海麥克林]、酒石酸氧銻鉀(C8H4K2O12Sb2，上海麥克林)、抗壞血酸(C6H8O6，上海邁瑞爾)、對甲氨基酚硫酸鹽(C7H9NO·1/2H2SO4，上海麥克林)、亞硫酸鈉(Na2SO3，上海麥克林)。

彼得遜抓斗式采泥器、元素分析儀(Perkin-Elmer 2400 Series Ⅱ，美國)、置于倒置顯微鏡(Nikon ECLIPSE，日本)、紫外可見分光光度計(Yoke Instrument-N5000，中國)、電熱恒溫箱(BJYSL-DHG-9030A，中國)、不銹鋼篩網(wǎng)。

1.2 采樣區(qū)與采樣方法

象山港，位于浙江省寧波市東南部，地處N29°24′～29°46′和E121°25′～122°00′的范圍內(nèi)，是一個由東北向西南深入內(nèi)陸的狹長型半封閉海灣，全港縱深60 km，一般水深10～15 m。在象山港海域設(shè)置了7個采樣點(圖1)，于2016年7月用彼得遜抓斗式采樣器采集了表層沉積物樣品。由于表層0～2 cm的沉積物為最近1～2年的沉降物形成[6]，因此采集0～2 cm深度的沉積物樣品，混勻后用聚乙烯取樣袋密封，低溫黑暗保存，運送至實驗室后-20 ℃避光保存待測。

圖1 象山港孢囊研究采樣圖

1.3 生源要素的測定

使用電熱恒溫箱對沉積物樣品進行前處理,45 ℃烘干至恒重，研磨后過100目篩網(wǎng)，放入自封袋中保存用于后續(xù)測定?？偟?total nitrogen, TN)和總有機碳(total organic carbon, TOC)質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用元素分析儀測定[7]，總磷(total phosphorus, TP)質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用過硫酸鹽同步消化法檢測[8]，生物硅(bio-silicon, Bsi)采用化學(xué)連續(xù)提取法提取[9]。生源要素測定過程中的質(zhì)控評估參考《近海海洋沉積物》(GBW 07314，中國)中空白試劑和10個重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)沉積物樣品的分析測定，各指標(biāo)的測定誤差均在5%以內(nèi)。

1.4 孢囊的分析與鑒定

將5 g濕沉積物與適量過濾海水混合均勻后，水浴超聲處理60 s，然后過孔徑為120目(125 μm)的篩網(wǎng)，收集濾過物過1250目(10 μm)的篩網(wǎng)，最后收集1600目篩網(wǎng)上的顆粒物，定容至10 mL，加入體積濃度為3%的福爾馬林固定劑。依據(jù)固定樣品的干凈程度，吸取0.1～1 mL處理后的樣品及適量過濾海水于計數(shù)框中，充分混勻擴展至整個計數(shù)框，置于倒置顯微鏡下進行孢囊形態(tài)鑒定和數(shù)量統(tǒng)計。對孢囊進行定性定量分析，要求每個樣品觀察分析至少100 個孢囊，以每克干沉積物中甲藻孢囊數(shù)量表示孢囊密度(cysts/g D Wt)[1,6]。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用EXCEL 2019對孢囊數(shù)據(jù)整理分析，并繪制孢囊多樣性折線圖及不同孢囊百分比柱狀圖?；阪吣颐芏葦?shù)據(jù)，使用R語言(Version 4.0.2)vegan包(Version 2.5.6)計算α多樣性指數(shù)，包括香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)(Shannon-Wiener diversity index，H′)和皮盧均勻度指數(shù)(Pielou’s evenness index，J)。基于皮爾森相關(guān)系數(shù)，利用R語言(Version 4.0.2)psych包(Version 0.9.2)計算孢囊與生源要素的相關(guān)關(guān)系，使用corrplot包(Version 0.89)將結(jié)果可視化。使用軟件ArcMap 10.2繪制采樣圖及孢囊密度的地理分布圖，孢囊密度的地理分布圖采用反距離權(quán)重插值法構(gòu)建?；诿糠N孢囊的平均密度確定其優(yōu)勢度，使用R語言(Version 4.0.2)ggplot2(Version 3.3.5)和reshape2(Version 1.4.4)函數(shù)包繪制氣泡圖可視化優(yōu)勢孢囊的分布。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲藻孢囊集群結(jié)構(gòu)

在象山港海域表層沉積物中，共分析鑒定出甲藻孢囊26種，其中膝溝藻目9種、Thoracosphaerales目2種(斯氏藻孢囊)、Suessiales目1種(別什藻孢囊)、裸甲藻目6種、多甲藻類目7種以及未確定至目(Dinophyceae incertae sedis)的1種(環(huán)胺藻，Azadiniumsp.)。每個站位所鑒定到的孢囊種類相近，為17～21種(表1)。本研究分析鑒定出10種有毒有害甲藻的孢囊，包括麻痹性貝類毒素(PSP)原因種奧氏亞歷山大藻(Alexandriumostenfeldii)和鏈狀/塔瑪亞歷山大藻(Alexandriumcatenella/tamarense)孢囊復(fù)合體，蝦夷扇貝毒素(YTX)原因種具刺膝溝藻(Gonyaulaxspinifera)、多邊舌甲藻(Lingulodiniumpolyedra)和網(wǎng)狀原角藻(Protoceratiumreticulatum)，環(huán)胺藻毒素(AZP)潛在原因種環(huán)胺藻, 產(chǎn)生魚毒素的哈曼多溝藻(Polykrikoshartmannii)以及赤潮藻類Barrufetabravensis、錐狀斯氏藻(Scrippsiellaacuminata)和垂裂萊萬藻(Levanderinafissa)；其中哈曼多溝藻、具刺膝溝藻、Barrufetabravensis、環(huán)胺藻和多邊舌甲藻在每個站位均有分布(表1，圖2)。H′偏低，為1.92～2.17；J則為0.68～0.74(圖3A)。

圖2顯示了26種甲藻孢囊按照優(yōu)勢度排列的分布狀況，9種孢囊在所有站位均有分布，除了5種有毒有害赤潮種類的孢囊外，另有4種孢囊在所有站位分布，分別為五角原多甲藻(Protoperidiniumpentagonum)、安倍原多甲藻(Protoperidiniumabei)、里昂原多甲藻(Protoperidiniumleonis)和長膝溝藻(Gonyaulaxelongata)。密度最高的為3種原多甲藻孢囊，平均孢囊密度為10.8～35.4 cysts/g D Wt；其次是別什藻(Biecheleriatirezensis)孢囊，平均孢囊密度為4.5 cysts/g D Wt，而其他孢囊密度均較低。

圖2 甲藻孢囊按優(yōu)勢度排列的分布

甲藻具有自養(yǎng)型及異養(yǎng)型營養(yǎng)方式，象山港沉積物中共分析鑒定出18種自養(yǎng)型甲藻孢囊和8種異養(yǎng)型甲藻孢囊(表1)，異養(yǎng)型甲藻孢囊包括7種原多甲藻屬的孢囊以及裸甲藻目中的無紋多溝藻(Polykrikosschwartzii)孢囊。象山港表層沉積物中異養(yǎng)型甲藻孢囊占據(jù)優(yōu)勢(圖3B)，各站位異養(yǎng)型甲藻孢囊密度占比為67.6%～81.0%，平均達到72.6%。在各類孢囊中，以多甲藻目的孢囊占據(jù)優(yōu)勢，全部為異養(yǎng)型的原多甲藻屬的孢囊，占比為67.6%～80.0%，平均為72.2%。膝溝藻目和裸甲藻目孢囊次之，平均占比分別為11.5%和6.5%，其他類別的孢囊密度較低，占比均低于5%(圖3C)。

表1 象山港海域表層沉積物中甲藻孢囊信息及分布狀況

(續(xù)上表)

A：香農(nóng)-威爾種類多樣性指數(shù)(H′)和皮盧均勻度指數(shù)(J)，B: 自養(yǎng)型和異養(yǎng)型甲藻孢囊百分比組成，C: 不同目的甲藻孢囊百分比組成

2.2 甲藻孢囊密度的地理分布

象山港海域甲藻孢囊及優(yōu)勢目的孢囊的地理分布見圖4，總孢囊密度和各類孢囊密度分布規(guī)律相近，均呈現(xiàn)出港中大于港頂和港口的趨勢，高值區(qū)位于XS5，而在位于港頂?shù)腦S1-XS4較低。孢囊密度介于69.8～174.4 cysts/g D Wt，平均為100.2 cysts/g D Wt，最高值位于XS5，XS6次之，其余站位的孢囊密度均小于100 cysts/g D Wt，最低值位于XS2(圖4A)。膝溝藻目孢囊的密度介于4.2～20.3 cysts/g D Wt，平均密度為11.6 cysts/g D Wt，最低值位于XS3，最高值位于XS5(圖4B)。裸甲藻目孢囊的密度介于7.6～26.5 cysts/g D Wt，平均密度為7.6 cysts/g D Wt，最低值位于XS1，最高值位于XS5(圖4C)。多甲藻目孢囊的密度介于49.8～119.9 cysts/g D Wt，平均密度為71.9 cysts/g D Wt，其分布規(guī)律與總孢囊密度相似，呈現(xiàn)出港中大于港頂和港口的趨勢，最高值位于XS5，最低值位于XS4(圖4D)。

A：總孢囊，B：膝溝藻目孢囊，C：裸甲藻目孢囊，D：多甲藻目孢囊

2.3 甲藻孢囊與生源要素之間的關(guān)系

圖5展示了象山港表層沉積物中甲藻孢囊與生源要素的皮爾森相關(guān)性分析可視化結(jié)果，孢囊密度以及主要類別孢囊密度均與BSi呈現(xiàn)出明顯的正相關(guān)關(guān)系(P<0.05或P<0.01)，Thoracosphaerales的孢囊密度(2種斯氏藻孢囊)與TOC明顯正相關(guān)(P<0.05)，Suessiales的孢囊密度與TP明顯負(fù)相關(guān)(P<0.05)，環(huán)胺藻孢囊密度與TP明顯正相關(guān)(P<0.01)。孢囊種類數(shù)與總孢囊密度及膝溝藻、裸甲藻和多甲藻等優(yōu)勢目孢囊密度均呈明顯正相關(guān)關(guān)系(P<0.05或P<0.01)，而總孢囊密度也與優(yōu)勢目孢囊密度呈明顯正相關(guān)關(guān)系(P<0.05或P<0.01)。

*P<0.05; **P<0.01; Thor、Sues分別表示Thoracosphaerales和Suessiales的孢囊密度

3 討論

本研究在浙江省象山港7個站點的表層沉積物中共發(fā)現(xiàn)甲藻孢囊26種，每個站位鑒定的孢囊種類數(shù)為17～21種。孢囊的種類多樣性與我國及世界其他海域沉積物中的甲藻孢囊種類豐富度相近，在我國其他海域表層沉積物中甲藻孢囊種類一般為20～40種[10-12]。休眠孢囊是很多甲藻類群生活史的特殊休眠階段，約有10%～20%的甲藻在休眠階段能夠形成休眠孢囊，包括許多有害赤潮藻類也能產(chǎn)生休眠孢囊[1]，而大部分可以形成孢囊的甲藻種類為近岸海域循環(huán)發(fā)生赤潮的藻類[1]。但是目前許多休眠孢囊的形態(tài)特征尚未被完全識別，一些孢囊與營養(yǎng)細(xì)胞的對應(yīng)關(guān)系還依然未明晰[13]。因此，通過顯微鏡觀察到的休眠孢囊種類多樣性和密度往往并不能真實的反映出自然狀態(tài)下的情況。盡管如此，通過傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類對孢囊集群進行分析鑒定，依然是沉積物中孢囊研究的基礎(chǔ)。

象山港海域各站點甲藻孢囊密度介于69.8～174.4 cysts/g D Wt，孢囊密度雖然小于膠州灣[14]、北黃海[15]、遼東半島[16]以及廣東大亞灣[17]和深圳灣[18]等，但相比其他近岸海域及河口地區(qū)如渤海灣[12]、長江口海域[11]、珠江口[13]以及福建興化灣[19]等略高。甲藻孢囊通常較易在顆粒大小、沉降性質(zhì)與之相近的粘土中積累，一般沉積物粒徑越小的粘性沉積物中甲藻孢囊密度較高[20]。同時孢囊密度與沉積物的沉降速率有關(guān)，沉降速率越高，單位時間內(nèi)形成的孢囊就會被稀釋，因此孢囊密度也較低。象山港沉積物多由粉砂粒徑的顆粒物組成，粉砂顆粒物占78%～90%[21]，粗糙的沉積物不利于孢囊的沉積。此外，象山港是一個半封閉性內(nèi)灣，也是浙江省的重要養(yǎng)殖基地，受人為活動干擾大，沉積速率較高[21]，導(dǎo)致沉積物中孢囊密度降低。傳統(tǒng)顯微鏡鑒定受人為影響較大，個體較小的孢囊以及形態(tài)學(xué)特征不明顯的孢囊可能被忽略，而孢囊上覆蓋的雜質(zhì)也可能遮蓋孢囊特征，無法準(zhǔn)確鑒定而被忽略，導(dǎo)致鑒定到的孢囊類型和密度的減少。

甲藻孢囊密度占比最高的為原多甲藻孢囊，平均達到72.3%。原多甲藻是最為常見的異養(yǎng)型甲藻，需要攝食水體中硅藻等小型浮游植物[22]。一般來說，自養(yǎng)型甲藻的生物量及生長速度應(yīng)高于作為消費者的異養(yǎng)型甲藻。因此，沉積物中自養(yǎng)型孢囊產(chǎn)量應(yīng)高于異養(yǎng)型孢囊。當(dāng)異養(yǎng)型甲藻孢囊百分比含量上升，說明其攝食的小型硅藻生物量高，在浮游植物群落中占優(yōu)勢，而小型硅藻的大量繁殖說明了富營養(yǎng)化程度的增加[22-23]。因此，較高的異養(yǎng)型孢囊百分比可用來指示水體較高的富營養(yǎng)化程度和初級生產(chǎn)力，如日本東京灣[23]、韓國南部沿海[24]、我國長江口[25]、廣東沿海等[13]。象山港表層沉積物中異養(yǎng)型甲藻孢囊占比較高，在一定程度上說明了水體中較高的初級生產(chǎn)力及富營養(yǎng)化水平。研究表明近年來象山港富營養(yǎng)化趨勢明顯[5]，硅藻為浮游植物主要類群，硅藻赤潮也時有發(fā)生[26-27]。BSi主要是硅藻死亡沉降形成，BSi含量可反映水體中硅藻生物量的高低。本研究中孢囊密度以及主要類別孢囊密度均與BSi呈現(xiàn)出明顯的正相關(guān)關(guān)系，說明硅藻生物量是決定孢囊生產(chǎn)力的重要因素。從孢囊密度的地理分布來看，孢囊峰值區(qū)位于港中的XS5站點，而在港頂區(qū)孢囊密度較低。吳燕妮等[5]分析了2007～2015年象山港海域的水質(zhì)變化情況，也發(fā)現(xiàn)港中海域富營養(yǎng)化程度要高于港頂。由此可見港中海域豐富的營養(yǎng)鹽孕育了大量小型硅藻，從而導(dǎo)致了原多甲藻孢囊及總孢囊密度的上升。

象山港沉積物中有毒有害甲藻孢囊豐富，共鑒定出有毒有害赤潮甲藻孢囊10種，其中具刺膝溝藻、多紋舌甲藻和網(wǎng)狀原角藻能產(chǎn)生蝦夷扇貝毒素(YTX)[28]，而且具刺膝溝藻和多紋舌甲藻在所有站位均有分布。貝類可通過濾食有毒藻細(xì)胞將YTX在體內(nèi)累積轉(zhuǎn)化并沿食物鏈傳遞，對貝類消費者、人類健康及生命安全造成了潛在的威脅。雖然我國目前尚無YTX毒素原因種的赤潮，但是這些藻類的孢囊在沉積物中普遍分布[10,15]，YTX類毒素也不時在浮游植物樣品和貝類樣品中檢出[29]。

亞歷山大藻是麻痹性貝類毒素(PSP)原因種，亞歷山大藻在我國沿海發(fā)生了多起赤潮[30]，同時亞歷山大藻的孢囊也廣泛分布在我國沿海沉積物中[10]；PSP毒素在浮游植物和貝類樣品中廣泛檢出[31-32]，而且大亞灣海域亞歷山大藻孢囊被認(rèn)為是貝類體內(nèi)PSP毒素的重要來源[33]。本研究鑒定出兩種亞歷山大藻孢囊，在5個站位檢出，分布較為廣泛但密度較低，最高值僅為6.3 cysts/g D Wt。其他有毒有害甲藻或者赤潮原因種如環(huán)胺藻、哈曼多溝藻和Barrufetabravensis等的孢囊在所有站位均有分布，密度均較低。但研究發(fā)現(xiàn)稀有類群也可以作為季節(jié)性演替或赤潮的種源[34]。雖然象山港尚未有這些赤潮的發(fā)生，但有毒有害甲藻孢囊種類豐富，分布廣泛，具有赤潮發(fā)生的潛在風(fēng)險，值得引起關(guān)注。

作者貢獻聲明

謝昌良：統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，修改論文；王朝暉：提出研究思路和框架，撰寫論文；王文婷：樣品采集，實驗操作；陳佳卓：論文修改；張宇寧：文獻資料查證；鄭虎：文獻整理及部分論文修改；柏瑤蘋：技術(shù)支持，文章審閱定稿。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。