高原環(huán)境因素致男性生殖系統(tǒng)氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制研究進(jìn)展

馬剛，張凱，常德輝，張斌

1 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州730000；2 中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院泌尿外科

高原是指具有寒冷干燥、低大氣壓、低氧分壓、高太陽(yáng)輻射等氣候特點(diǎn)，海拔位于500 m 以上的地區(qū)。研究高原環(huán)境因素對(duì)人體健康的影響，對(duì)于保護(hù)高原人群身體健康、促進(jìn)高原地區(qū)順利發(fā)展具有重要意義。高原相關(guān)生殖損傷近年來(lái)成為學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)。常德輝等［1］通過(guò)實(shí)驗(yàn)?zāi)M海拔4 000 m 成功建立高原大鼠生殖系統(tǒng)損傷模型，并且發(fā)現(xiàn)，隨著海拔高度升高，大鼠生殖功能改變?cè)矫黠@。鄧琛耀等［2］分析國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，認(rèn)為高原低氧環(huán)境對(duì)男性精液質(zhì)量影響的機(jī)制之一是活性氧（ROS）生成過(guò)多。過(guò)多的ROS 會(huì)損害精子DNA，破壞精子細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，加速生精細(xì)胞和精子凋亡等。但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于高原環(huán)境因素對(duì)男性生殖系統(tǒng)氧化應(yīng)激（OS）損傷的研究多數(shù)集中于生殖內(nèi)分泌、生殖系統(tǒng)組織生化代謝和精液參數(shù)等現(xiàn)象探討方面，針對(duì)生殖腺組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和生精細(xì)胞、精子損傷及其調(diào)控機(jī)制的研究比較缺乏，相應(yīng)抗氧化治療和預(yù)防措施的研究也很少見。現(xiàn)就高原環(huán)境因素致男性生殖系統(tǒng)OS損傷的機(jī)制相關(guān)研究作一綜述。

1 生殖內(nèi)分泌功能OS損傷及機(jī)制

睪丸Leydig細(xì)胞合成的睪酮對(duì)精子的產(chǎn)生至關(guān)重要，睪酮濃度高低對(duì)精子的質(zhì)量和數(shù)量影響非常大，睪酮濃度降低會(huì)導(dǎo)致無(wú)精子癥、少弱精子癥和精子無(wú)力癥等。而OS對(duì)男性性激素如睪酮、雌二醇等的影響主要為抑制作用。OS 反應(yīng)會(huì)損傷Leydig 細(xì)胞的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致睪酮合成減少。同時(shí)睪酮濃度降低會(huì)引起線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常，Leydig 細(xì)胞凋亡增加，形成惡性循環(huán)。此外，ROS還會(huì)干擾丘腦—垂體—睪丸軸的反饋調(diào)節(jié)及下丘腦—垂體—性腺軸與其他下丘腦—激素軸之間的相互作用，導(dǎo)致調(diào)節(jié)男性生殖功能的激素平衡被打破。有研究表明，與平原地區(qū)成年男性比較，高原低氧環(huán)境中男性體內(nèi)雌二醇、睪酮水平明顯降低，糖蛋白激素抑制素B9 水平明顯升高［3］。顧本宏等［4］發(fā)現(xiàn)，黃體生成素減少與高原低氧環(huán)境暴露時(shí)間長(zhǎng)短呈正相關(guān)，暴露時(shí)間越長(zhǎng)，黃體生成素生成抑制越明顯。同時(shí)，LIAO 等［5］發(fā)現(xiàn)，高原環(huán)境下，血清睪酮水平與低氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，認(rèn)為低氧環(huán)境下生精細(xì)胞凋亡與血清卵泡刺激素和睪酮含量的減少有重要關(guān)系?？罪w燕等［6］通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，左卡尼汀有助于提高高原低氧組大鼠精子質(zhì)量，維持睪酮、黃體生成素及卵泡刺激素水平。最近，LIU等［7］研究表明，低壓低氧可誘導(dǎo)成年雄性大鼠睪丸瘦素—瘦素受體的表達(dá)，提示瘦素—瘦素受體信號(hào)可能介導(dǎo)了低氧對(duì)雄性大鼠生殖系統(tǒng)的損傷。

2 生殖腺組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)OS損傷及機(jī)制

在高原環(huán)境中睪丸組織會(huì)產(chǎn)生大量ROS 發(fā)生蓄積，抗氧化物質(zhì)被大量消耗，丙二醛、過(guò)氧化氫等含量升高而超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽等水平降低，細(xì)胞毒性增加，引起生精上皮細(xì)胞脫落，曲細(xì)精管管壁變薄，生精細(xì)胞和Leydig細(xì)胞凋亡增加，睪酮合成和分泌減少，影響精子發(fā)生及生殖生理過(guò)程。附睪組織中OS會(huì)破壞精子成熟，引起附睪指數(shù)下降及形態(tài)萎縮，顯微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯破壞。FARIAS等［8］為研究持續(xù)性慢性低壓缺氧和間歇性慢性低壓缺氧對(duì)雄性大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)及生化代謝的影響，將雄性大鼠暴露在模擬海拔高度4 600 m（PO289.6 mmHg）60 d，發(fā)現(xiàn)持續(xù)性慢性低壓缺氧和間歇性慢性低壓缺氧的雄性大鼠在生精周期各階段都會(huì)引起睪丸形態(tài)明顯變化，如曲細(xì)精管管壁變薄、間隙增大，生精上皮細(xì)胞空泡化，基底膜折疊和生精細(xì)胞凋亡。MADRID 等［9］發(fā)現(xiàn)，缺氧最重要的早期變化是睪丸水腫，血漿和睪丸睪酮水平升高，常壓缺氧與高原低壓缺氧產(chǎn)生的效果相似。同時(shí)，常德輝等［10］電鏡下觀察高原低氧組大鼠睪丸組織，發(fā)現(xiàn)睪丸超微結(jié)構(gòu)受損顯著，而左卡尼汀可提高大鼠的抗氧化能力，減輕低氧對(duì)睪丸組織的損傷。

3 精液精子OS損傷及機(jī)制

高原低壓低氧環(huán)境對(duì)精液精子的影響一直是高原生殖損傷研究的焦點(diǎn)。顧本宏等［11］對(duì)1 563 例高原地區(qū)藏民和藏區(qū)漢族移民進(jìn)行常規(guī)精液分析和精子DNA 斷裂指數(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在高原低氧環(huán)境的適應(yīng)過(guò)程中，藏區(qū)漢族移民精子濃度和活力發(fā)生適應(yīng)性變化，無(wú)精子癥和嚴(yán)重少精子癥的發(fā)病率均低于本地藏族男性。ZHENG 等［12］研究表明，在3 600 m 海拔高度短期暴露1個(gè)月會(huì)增加精子畸形的分布。并且，AL-HASHEM 等［13］發(fā)現(xiàn)在低壓低氧條件下生活可下調(diào)干細(xì)胞因子表達(dá)、降低精子數(shù)和血清生殖激素水平，并顯著增強(qiáng)睪丸組織OS 和脂質(zhì)過(guò)氧化。PELLICCIONE 等［14］研究表明，高海拔地區(qū)的體育鍛煉與睪丸功能障礙相關(guān)，會(huì)導(dǎo)致精子濃度降低，但精子質(zhì)量健康。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，卵生動(dòng)物在極端高海拔缺氧條件下孵育幼體，不會(huì)阻止卵生外胚層產(chǎn)生可存活的幼體，但可能對(duì)卵生后代的發(fā)育造成影響［15］。HE等［16］表明，雖然高原缺氧會(huì)對(duì)精液質(zhì)量和生殖激素產(chǎn)生不利影響，但這些影響是可逆的。OS可由一系列內(nèi)源性和外源性因素觸發(fā)，高原暴露就是其中之一。ROS是在間歇性慢性低壓缺氧的復(fù)氧階段產(chǎn)生的，有助于生理反應(yīng)的恢復(fù)，但當(dāng)產(chǎn)生的ROS過(guò)多，ROS與抗氧化物之間的動(dòng)態(tài)平衡被破壞，則發(fā)生OS。OS 會(huì)對(duì)精子產(chǎn)生諸多不利影響，如脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA片段化和凋亡。

3.1 精子脂質(zhì)過(guò)氧化 精子質(zhì)膜存在豐富的脂質(zhì)，主要是多不飽和脂肪酸，其亞甲基之間的六個(gè)雙鍵是不共軛的。ROS的增加引起精子質(zhì)膜內(nèi)多不飽和脂肪酸過(guò)氧化，質(zhì)膜失去了精卵結(jié)合所需的膜流動(dòng)性和完整性，從而導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙。脂質(zhì)過(guò)氧化除了破壞精子質(zhì)膜外，其產(chǎn)物還可與電子傳遞鏈上的線粒體蛋白結(jié)合并破壞其結(jié)構(gòu)，發(fā)生電子泄漏，導(dǎo)致線粒體膜電位降低，ATP 產(chǎn)生減少，精子活力降低［17］。脂質(zhì)過(guò)氧化有三個(gè)階段：第一階段是“引發(fā)”，即ROS 從多不飽和脂肪酸的碳—碳雙鍵中提取氫原子產(chǎn)生脂肪酸基；第二階段是“擴(kuò)散”，產(chǎn)生的脂肪酸基與氧快速反應(yīng)形成過(guò)氧脂肪酸基團(tuán)，當(dāng)有銅、鐵等金屬離子存在時(shí)，過(guò)氧脂肪酸基團(tuán)可再次從多不飽和脂肪酸中提取一個(gè)氫原子，產(chǎn)生脂肪酸自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化物；第三階段是“終止”，這些形成的脂肪酸自由基彼此反應(yīng)，生成細(xì)胞毒性醛和其他終產(chǎn)物。脂質(zhì)過(guò)氧化的主要產(chǎn)物是4-羥基壬烯醛、丙二醛和丙烯醛，其中丙二醛是分析和監(jiān)測(cè)多不飽和脂肪酸過(guò)氧化程度的重要生物標(biāo)志物。

3.2 精子DNA片段化 研究表明，高原環(huán)境因素可改變精子核DNA（nDNA）完整性和線粒體DNA（mtDNA）數(shù)目［18］。王瑞等［19］研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期在高原工作會(huì)損傷精子nDNA，精液中ROS過(guò)量產(chǎn)生和抗氧化物質(zhì)水平降低所引起的OS 是導(dǎo)致DNA 片段化的原因之一。OS 可通過(guò)激活精子半胱氨酸蛋白酶（Caspase）和核酸內(nèi)切酶直接或間接損傷精子nDNA 而發(fā)生DNA片段化。精子從生精小管通過(guò)睪丸網(wǎng)轉(zhuǎn)移至附睪尾部的過(guò)程中暴露于ROS，可使精子發(fā)生過(guò)程中染色質(zhì)壓縮錯(cuò)誤，引起DNA脆弱性增加，導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)從組蛋白到魚精蛋白的替代失敗，產(chǎn)生8-OH-鳥嘌呤和8-OH-2-脫氧鳥苷（8-OHdG）。8-OHdG 是一種氧化的鳥嘌呤加合物，其水平升高與DNA 片段化和斷鏈顯著相關(guān)。王曉蘭等［20］研究發(fā)現(xiàn)，精液中ROS和8-OHdG水平與精子運(yùn)動(dòng)能力呈負(fù)相關(guān)，表明精子DNA氧化損傷與精子活力低下有關(guān)。目前已知，Sirtuins 蛋白家族中的沉默信息調(diào)節(jié)因子SIRT1 和SIRT3參與腫瘤遺傳信息傳遞、細(xì)胞衰老和OS。NASIRI等［21］通過(guò)研究弱精子癥和正常精子男性精液中SIRT1、SIRT3 與抗氧化劑、OS 標(biāo)志物和DNA 片段化的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)弱精子組過(guò)氧化氫酶、SOD活性和總抗氧化能力水平低于正常精子組，DNA 斷裂指數(shù)和丙二醛水平高于正常精子組，弱精子癥組精漿SIRT1、SIRT3 蛋白水平低于正常精子組。這表明SIRT1、SIRT3 蛋白水平與精液中的OS 程度和DNA斷裂水平呈負(fù)相關(guān)。低水平的SIRT1、SIRT3可能引起OS、DNA片段化和脂質(zhì)過(guò)氧化增強(qiáng)，最終導(dǎo)致精子不活躍和不成熟（弱精子癥）［22］。

在精子mtDNA 數(shù)目方面，VENKATESH 等［23］研究發(fā)現(xiàn)，在無(wú)精子癥、少弱精子癥、精子無(wú)力癥和精子數(shù)正常性不育的男性精液樣本中均存在mtDNA損傷和數(shù)目減少。mtDNA 因缺失DNA 結(jié)合蛋白和組蛋白保護(hù)以及自身缺乏修復(fù)功能，較nDNA 更易受到OS 損傷。mtDNA 損傷會(huì)導(dǎo)致部分結(jié)構(gòu)和（或）功能異常的蛋白被編碼產(chǎn)生，進(jìn)一步促進(jìn)ROS，形成惡性循環(huán)。

DNA 具有雙螺旋結(jié)構(gòu)，DNA 斷裂有單鏈（ss-）和雙鏈（ds-）兩種形式。DNA 修復(fù)只能在精子發(fā)生的特定階段進(jìn)行，附睪細(xì)胞核凝聚期間，修復(fù)機(jī)制不再激活。ss-DNA 斷裂修復(fù)的下一個(gè)機(jī)會(huì)是人卵母細(xì)胞，這是胚胎發(fā)育的關(guān)鍵一步，但修復(fù)DNA 片段化的能力將隨孕婦年齡增加而下降。ds-DNA 斷裂會(huì)導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定以及在沒有修復(fù)的情況下發(fā)生細(xì)胞凋亡［24］。據(jù)報(bào)道，未修復(fù)的DNA 片段化超過(guò)臨界閾值會(huì)對(duì)胚胎發(fā)育和妊娠結(jié)局有不利影響，稱為“父系效應(yīng)”，含有DNA 片段化的精子在受精后會(huì)對(duì)囊胚形成、植入和妊娠結(jié)局產(chǎn)生負(fù)面影響。此外，有學(xué)者［25］發(fā)現(xiàn)，OS 對(duì)卵裂期胚胎發(fā)育有不利影響，稱為“早期父系效應(yīng)”。同時(shí)，ZHAO 等［26］通過(guò)Meta 分析研究DNA 片段化和輔助生殖技術(shù)結(jié)局之間的關(guān)系，結(jié)果表明，DNA 片段化與妊娠結(jié)局呈負(fù)相關(guān)，與流產(chǎn)的發(fā)生呈正相關(guān)。SMITH 等［27］研究還發(fā)現(xiàn)，ROS通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，不僅可引起精子膜流動(dòng)性發(fā)生障礙，還可通過(guò)影響精子DNA 功能，使SOD 基因表達(dá)減少，減弱機(jī)體的抗氧化能力，使過(guò)量的ROS不能被有效清除。

3.3 生精細(xì)胞和精子細(xì)胞凋亡 生精細(xì)胞和精子細(xì)胞的適度凋亡對(duì)于控制精子濃度和保障精子質(zhì)量至關(guān)重要，但過(guò)度凋亡則嚴(yán)重?fù)p害男性生殖健康。以往研究表明，高原低壓低氧環(huán)境誘發(fā)的OS能顯著增加生精細(xì)胞和精子細(xì)胞凋亡，其機(jī)制是細(xì)胞通過(guò)多條死亡信號(hào)通路和調(diào)控途徑進(jìn)行凋亡，被稱為DNA片段化引起的生理性程序性細(xì)胞死亡。

目前認(rèn)為，有三條通路參與生精細(xì)胞和精子細(xì)胞凋亡。第一條是線粒體通路，也是體內(nèi)存在最廣泛的凋亡通路。研究表明，ROS誘導(dǎo)的ds-DNA斷裂可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，其機(jī)制為ROS破壞線粒體膜，使線粒體膜釋放細(xì)胞色素C，激活凋亡相關(guān)的Caspase 和膜聯(lián)蛋白Ⅴ與磷脂酰絲氨酸結(jié)合，產(chǎn)生相應(yīng)的核酸內(nèi)切酶損傷精子nDNA，發(fā)生DNA 片段化，繼而出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。因此，精漿中細(xì)胞色素C水平過(guò)高可能表明過(guò)多的ROS對(duì)線粒體造成了嚴(yán)重的損傷。LU等［28］的實(shí)驗(yàn)表明，線粒體膜電位下降與增加的ROS 直接或間接損傷線粒體膜有關(guān)。第二條通路是死亡受體通路。FasL/Fas 死亡受體通路已被證實(shí)是OS 損傷導(dǎo)致生精細(xì)胞凋亡的途徑之一［29］。當(dāng)外界有害因素（如缺氧、輻射等）刺激睪丸組織產(chǎn)生大量ROS，ROS作為凋亡啟動(dòng)劑，引發(fā)Fas 與FasL 結(jié)合，活化Caspase，進(jìn)入連續(xù)反應(yīng)階段，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。最近，YIN 等［30］研究顯示，HIF-1α 基因敲除可減少缺氧誘導(dǎo)的小鼠精母細(xì)胞衍生細(xì)胞系凋亡，提示HIF-1α 介導(dǎo)的死亡受體通路和線粒體通路可能都參與了缺氧導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。學(xué)者們還發(fā)現(xiàn)，自噬和凋亡在廣泛的串?dāng)_中相互關(guān)聯(lián)，缺氧通過(guò)線粒體通路和死亡受體通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并以時(shí)間依賴性方式抑制細(xì)胞自噬。研究表明，缺氧抑制自噬，自噬通過(guò)促進(jìn)Caspase-8 的時(shí)間依賴性激活，進(jìn)一步增強(qiáng)缺氧誘導(dǎo)的小鼠精母細(xì)胞凋亡，提示凋亡抑制和自噬激活聯(lián)合應(yīng)用可能是治療缺氧性男性不育的一種策略［31］。同時(shí)，YIN 等［32］還發(fā)現(xiàn)，生精細(xì)胞凋亡和胞質(zhì)特化破壞可能是缺氧性男性不育的關(guān)鍵生物學(xué)事件，在生理和（或）病理?xiàng)l件下（如饑餓、缺氧等），自噬在生精細(xì)胞或支持細(xì)胞中被激活，通過(guò)降解細(xì)胞骨架組織的負(fù)調(diào)節(jié)因子PDZLIM 結(jié)構(gòu)域1 來(lái)抑制生精細(xì)胞凋亡、穩(wěn)定ES的完整性，從而維持生精細(xì)胞存活。第三條通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能失常引起的不以細(xì)胞膜或線粒體為靶點(diǎn)的凋亡信號(hào)觸發(fā)即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路，也在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮一定作用［33］。OS 會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能失調(diào)，腔內(nèi)出現(xiàn)大量未折疊和錯(cuò)誤折疊蛋白堆積及鈣泵功能紊亂，該狀態(tài)被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）。崔艷華等［34］研究認(rèn)為，持續(xù)的ERS 會(huì)引起睪丸生殖細(xì)胞凋亡，ERS 引起的細(xì)胞凋亡與Caspase 家族有關(guān)。ERS 誘導(dǎo)胞質(zhì)中的Caspase-7 激活位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的Caspase-12，后者可進(jìn)一步激活Caspase-3，引起細(xì)胞凋亡。

高原地區(qū)具有獨(dú)特的地勢(shì)地貌和典型的氣候特點(diǎn)，機(jī)體在其低壓、低氧的環(huán)境因素刺激下，通過(guò)功能狀態(tài)的改變，產(chǎn)生不同的效應(yīng)來(lái)適應(yīng)環(huán)境［35］，但同時(shí)也會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生一些不利影響，如高原低壓低氧環(huán)境誘發(fā)OS 對(duì)男性生殖系統(tǒng)的損害。高原環(huán)境對(duì)男性生殖系統(tǒng)的影響在生殖內(nèi)分泌、生殖腺組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生殖系統(tǒng)組織生化代謝以及精液層面有不同的表現(xiàn)。隨著對(duì)細(xì)胞、基因、分子層面的研究進(jìn)一步深入，高原環(huán)境因素致男性生殖系統(tǒng)OS損傷的分子機(jī)制將被進(jìn)一步解釋，與之對(duì)應(yīng)的預(yù)防和診治措施也會(huì)進(jìn)一步完善。