肝再生增強因子對腎間質(zhì)纖維化發(fā)病的干預(yù)作用機制及其治療應(yīng)用研究進(jìn)展

于瓊，蒲濤，于泓

遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿內(nèi)科，貴州遵義563000

慢性腎臟病（CKD）會隨著病理改變最終發(fā)展為終末期腎病。近些年來，CKD 的發(fā)病率呈明顯上升趨勢［1］。腎間質(zhì)纖維化是導(dǎo)致CKD進(jìn)展為終末期腎病的關(guān)鍵病理特征之一［2］。而腎間質(zhì)纖維化的病理進(jìn)展過程受多因素的調(diào)控，其包含腎小管上皮細(xì)胞損傷、成纖維細(xì)胞活化與增殖、腎小管周圍毛細(xì)血管通透性改變及細(xì)胞外基質(zhì)沉積等病理特征［3-4］。因此，對腎纖維化過程的調(diào)控已成為延緩CKD 進(jìn)展的最具前景的手段。肝再生增強因子（ALR）是一種廣泛分布于哺乳動物所有組織中的多功能生長因子［5］。動物實驗研究結(jié)果顯示，予缺血再灌注（I/R）大鼠外源性注射重組ALR，可減少腎小管上皮細(xì)胞凋亡，對受損腎臟起到保護(hù)作用［6］。但目前臨床尚未明確ALR 在腎小管間質(zhì)損傷過程中的作用及機制?，F(xiàn)就ALR 對腎間質(zhì)纖維化發(fā)病的干預(yù)作用及其臨床應(yīng)用相關(guān)研究進(jìn)行綜述。

1 ALR對腎間質(zhì)纖維化發(fā)病的干預(yù)作用機制

1.1 抑制轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）信號通路延緩腎間質(zhì)纖維化 腎小管上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)展過程中有重要作用，進(jìn)而導(dǎo)致CKD 的發(fā)生。相關(guān)研究表明，在缺血和（或）中毒性急性腎損傷（AKI）的小鼠模型中，ALR 表達(dá)上調(diào)，以利于增強腎小管細(xì)胞的再生，減輕腎功能障礙［7］。有證據(jù)表明，重組人ALR 參與TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管EMT。已知TGF-β1是一種促腎小管EMT 的細(xì)胞因子，通過激活間質(zhì)成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞和小管上皮細(xì)胞［8］，增加細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的生成，進(jìn)一步誘導(dǎo)腎纖維化的發(fā)生［9］。TGF-β1也通過EMT誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化介導(dǎo)腎纖維化［10］。ALR 對TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管EMT 抑制作用與抑制TGF-β1激活招募SMAD 家族成員（Smad2、Smad3）、促進(jìn)NF-κB磷酸化和下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子受體Ⅱ表達(dá)有關(guān)［11］。相關(guān)研究表明，單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）誘導(dǎo)的梗阻損傷促使Smad2 和Smad3 蛋白磷酸化，進(jìn)而激活了UUO 大鼠TGF-β/Smads 通路的下游信號分子，而外源性ALR 可抑制UUO 大鼠Smad2 和Smad3磷酸化［12］。

TGF-β1在腎損傷早期的腎修復(fù)過程中發(fā)揮抗炎細(xì)胞因子的作用［13］。在新月體腎小球腎炎小鼠模型中，TGF-β1抑制炎癥細(xì)胞因子的釋放及巨噬細(xì)胞和CD3+T 淋巴細(xì)胞的浸潤，以保護(hù)受損的腎臟［14］。此外，TGF-β1也可促進(jìn)巨噬細(xì)胞由促炎M1 型向抗炎M2 型轉(zhuǎn)化［15］。然而，TGF-β1短期激活會促進(jìn)腎修復(fù)過程，長期激活則會導(dǎo)致腎纖維化。TGF-β1還可通過Smad7 阻斷NF-κB 通路與β-catenin/Foxo complex 相互作用［16］，或調(diào)節(jié)c-Jun N 端激酶信號通路來發(fā)揮抗炎作用［17］。在小鼠UUO 和I/R 模型中，TGF-β1也能促進(jìn)β-catenin 與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用，借此驅(qū)動抗炎和促纖維化反應(yīng)［17］。

TGF-β1在EMT 發(fā)生中的作用已非常明確。研究發(fā)現(xiàn)，90%以上EMT 的發(fā)生都受到TGF-β 的直接或間接誘導(dǎo)［18］。相關(guān)研究表明，EMT 過程受到自噬的負(fù)調(diào)控，雷帕霉素可以通過增強自噬和抑制EMT而減輕梗阻性腎病腎纖維化。轉(zhuǎn)錄因子Snail1 是一種含有鋅指結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合蛋白，是誘導(dǎo)EMT的關(guān)鍵促進(jìn)調(diào)節(jié)因子，也可促進(jìn)腎纖維化［19］。還有相關(guān)研究表明，ALR 參與了I/R 誘導(dǎo)的腎小管上皮HK-2細(xì)胞自噬過程，下調(diào)HK-2 細(xì)胞的ALR 表達(dá)可上調(diào)自噬水平，而抑制自噬則使HK-2細(xì)胞凋亡增加。故而ALR 也可能通過調(diào)節(jié)自噬影響EMT 的水平，進(jìn)而影響腎間質(zhì)纖維化［20］。

1.2 抗腎小管細(xì)胞凋亡抑制腎間質(zhì)纖維化 ALR是一種抗凋亡因子，在大鼠腎I/R 損傷后高表達(dá)于腎皮質(zhì)、髓質(zhì)腎小管中。已有研究表明，外源性ALR 可促進(jìn)腎小管再生。I/R 是AKI 最常見的原因，可誘導(dǎo)腎上皮小管細(xì)胞凋亡。線粒體功能障礙是I/R 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要原因之一。越來越多的證據(jù)表明，ALR 表達(dá)下調(diào)抑制磷酸酶及張力蛋白同源基因誘導(dǎo)激酶1（PINK1）和Parkin 活化、加重了線粒體功能障礙、增加了線粒體活性氧（ROS）水平，通過抑制線粒體自噬導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。PINK1/parkin介導(dǎo)的線粒體自噬可能通過清除受損的線粒體和保存健康的線粒體從而延緩腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展［7，21］。也有研究表明，重組ALR 可刺激腎小管上皮細(xì)胞增殖，對腎小管細(xì)胞凋亡進(jìn)程起到明顯的抑制作用，在此基礎(chǔ)上控制腎間質(zhì)纖維化發(fā)展。ALR在慶大霉素和I/R 誘導(dǎo)的AKI 病變組織中表達(dá)增加，并可減輕腎損傷，這可能與ALR 抑制腎小管細(xì)胞凋亡、阻止NF-κB 通路激活和保護(hù)線粒體功能有關(guān)［22-23］，而下調(diào)ALR 表達(dá)可通過磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）途徑來誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。研究表明，干擾HK-2 細(xì)胞中ALR 的表達(dá)可增加ROS 水平，激活A(yù)MPK/mTOR 通路，增加I/R 誘導(dǎo)的自噬水平［24-25］。此外，ALR 抑制順鉑或馬載鈴酸Ⅰ誘導(dǎo)的自噬，從而控制腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展［26-28］。因此，ALR 在AKI 中具有腎保護(hù)作用，主要機制與抑制凋亡、控制炎癥、減輕纖維化和調(diào)節(jié)線粒體生物功能等有關(guān)。

已知線粒體功能與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下，如缺血、缺氧和葡萄糖剝奪，均可導(dǎo)致線粒體損傷或功能障礙。相關(guān)研究表明，ALR 表達(dá)下調(diào)也可加重線粒體損傷或功能障礙，表現(xiàn)為線粒體呼吸蛋白腺嘌呤核苷三磷酸合酶亞基β、細(xì)胞色素C氧化酶亞基1和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶亞基表達(dá)下降，ROS水平和細(xì)胞凋亡相關(guān)因子表達(dá)增加，促使HK-2細(xì)胞凋亡［29］。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，ALR的過表達(dá)可能通過抑制線粒體裂變和促進(jìn)線粒體內(nèi)膜融合來保護(hù)線粒體功能，減少HK-2細(xì)胞的凋亡［22］。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，PINK1/Parkin 可介導(dǎo)線粒體自噬而抑制腎纖維化過程［30］。當(dāng)線粒體受損時，PINK1 積聚在線粒體外膜上，線粒體外膜從胞質(zhì)中吸收Parkin 并磷酸化其泛素連接酶。磷酸化后，Parkin 將線粒體外膜中的各種蛋白泛素化，通過結(jié)合自噬選擇性底物p62 蛋白和微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3β 將泛素線粒體傳遞到自噬體，誘導(dǎo)自噬和受損線粒體的清除［31］。而在腎臟的損傷過程中，ALR 表達(dá)上調(diào)可活化PINK1 和Parkin 途徑介導(dǎo)的線粒體自噬，以減少HK-2細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。此外，ALR 也可通過影響AMPK/mTOR 信號通路，降低自噬通量，減少HK-2細(xì)胞凋亡。

1.3 與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用干預(yù)腎間質(zhì)纖維化細(xì)胞外基質(zhì)是經(jīng)細(xì)胞分泌至細(xì)胞外間質(zhì)的物質(zhì)，形成復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可對組織結(jié)構(gòu)起到連接作用，也能對細(xì)胞和組織生理活動起到調(diào)節(jié)作用［32］。腎間質(zhì)纖維化與細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解失衡之間存在明顯相關(guān)性。組織金屬蛋白酶抑制物（TIMP）和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）兩種酶系的調(diào)控對細(xì)胞外基質(zhì)降解作用明顯。MMP 對大部分細(xì)胞外基質(zhì)蛋白具有降解作用［33］。TIMP 能夠明顯抑制MMP 的生物學(xué)活性。在腎間質(zhì)纖維化發(fā)展進(jìn)程中，TIMP 表達(dá)上調(diào)，通過抑制MMP 活性使細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積于腎臟組織內(nèi)。MMP/TIMP失衡在腎間質(zhì)纖維化進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。此外，大鼠模型實驗表明，ALR 對腎臟組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)沉積具有明顯的抑制作用，進(jìn)而阻遏腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展進(jìn)程［34］。ALR 可抑制TIMP-1 表達(dá)，使MMP-9 活性與表達(dá)水平增強，降解細(xì)胞外基質(zhì)。在梗阻性腎損傷發(fā)生初期，內(nèi)源性ALR 水平增加可能是機體保護(hù)性機制的一種，而損傷加重會削弱該反應(yīng)，使得腎臟纖維化加重。

1.4 抑制炎癥反應(yīng)干預(yù)腎間質(zhì)纖維化 已知炎癥是I/R損傷中腎臟損傷起始和加重的主要因素。在炎癥狀態(tài)下，中性粒細(xì)胞脫顆?？蓪?dǎo)致正常細(xì)胞破壞。有證據(jù)表明，促炎細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）1β和IL-6參與了I/R后反應(yīng)［35］。NF-κB通路長期以來被認(rèn)為是一種典型的促炎信號通路，主要基于NF-κB在促炎基因（包括細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子）表達(dá)中的作用［36］。轉(zhuǎn)錄因子p65 是NF- κB 家族成員，大多數(shù)NF-κB 靶基因受p65 調(diào)控［37］。實驗發(fā)現(xiàn)，p65 基因敲除的大鼠外周血管炎癥較輕［38］。相關(guān)研究表明，I/R 后ALR 處理降低了p65 mRNA 和蛋白的表達(dá)，并顯著抑制NF-κB 活化，這可能與下調(diào)細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)有關(guān)［23］。研究顯示，重組人肝細(xì)胞再生因子（rhALR）可減輕I/R 誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞浸潤，還能抑制單核細(xì)胞趨化蛋白1、IL-1β、IL-6 mRNA 和蛋白的表達(dá)［39］。炎癥與MAPK 和NF-κB 通路的激活有關(guān)，缺氧/再氧化（H/R）可刺激細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun 氨基酸末端激酶（JNK）、p38絲裂源激活蛋白激酶磷酸化，并導(dǎo)致NF-κB 向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移；下調(diào)ALR 可抑制ERK、JNK、p38 磷酸化及NF-κB 的轉(zhuǎn)錄活性，從而干預(yù)HK-2細(xì)胞H/R的進(jìn)程。

目前發(fā)現(xiàn)TLR4/NF-κB 信號通路參與了多種纖維化過程［40］。紅景天苷可通過改善腎功能，減輕體外細(xì)胞基質(zhì)沉積，緩解UUO 小鼠和TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞中EMT 標(biāo)志物蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎和腎臟保護(hù)作用。此外，紅景天苷處理顯著減少炎癥因子（IL-1b、IL-6和TNF-α）釋放，并抑制脂多糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞TLR4/NF-κB 和MAPK 信號通路激活［3］。也有研究表明，姜黃素可通過TLR4/NF-κB途徑緩解TGF-β1或LPS 誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞的EMT 和炎癥反應(yīng)［41］。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基可抑制腎小管間質(zhì)炎癥和腎間質(zhì)纖維化，機制與抑制TLR4/NF-κB 信號通路有關(guān)［42］。以上研究結(jié)果提示，ALR 可能通過TLR4/NF-κB 通路來干預(yù)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展進(jìn)程。

2 基于ALR的方案在腎間質(zhì)纖維化治療中的應(yīng)用

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，ALR 在再生腎小管上皮細(xì)胞（RTECs）中的表達(dá)隨損傷加重而增加，ALR 可抑制腎組織局部炎癥病理改變，促進(jìn)RTECs 的再生和修復(fù)［43］。此外，rhALR 能明顯降低慢性腎衰竭大鼠血清BUN、Scr水平，減輕腎間質(zhì)纖維化及腎小球硬化。相關(guān)研究報道，應(yīng)用rhALR干預(yù)后，大鼠體內(nèi)毒素水平減低，腎小球硬化程度減輕，Ⅳ型膠原、TIMP-1 表達(dá)減少，MMP-9 表達(dá)增加，細(xì)胞外基質(zhì)沉積減輕［34］。rhALR 可以通過作用于MMP-9/TIMP-1 延緩腎小球硬化進(jìn)程，對5/6 腎切除大鼠慢性腎衰竭模型有保護(hù)作用。大鼠與人具有高度同源性，ALR 在臨床上也有望作為治療腎間質(zhì)纖維化的一種手段。

綜上所述，ALR 生物學(xué)效應(yīng)明顯，在腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。隨著相關(guān)研究的不斷深入，ALR 在腎間質(zhì)纖維化發(fā)展進(jìn)程中的作用機制將會逐一被探明，有助于腎臟疾病研究人員從更多層面了解以腎間質(zhì)纖維化為基礎(chǔ)的腎臟疾病的發(fā)生原因、癥狀表現(xiàn)、預(yù)防與治療措施以及預(yù)后評估，也可從不同方面對ALR 的組織表達(dá)、生物學(xué)功能和免疫調(diào)節(jié)功能的發(fā)揮進(jìn)行探討。臨床有望通過應(yīng)用ALR 預(yù)防和治療腎纖維化，控制疾病進(jìn)展，降低腎纖維化高?；颊叩陌l(fā)病風(fēng)險，改善預(yù)后。