睪丸位置不同的隱睪患兒睪丸引帶組織雄激素受體表達(dá)觀察

高靖達(dá)，齊燦，周云，張鐵軍，史麗萍，許鵬，賈鵬宇

河北省兒童醫(yī)院泌尿外科，石家莊 050000

隱睪又稱睪丸下降不全，是指患兒出生時(shí)單側(cè)或雙側(cè)睪丸未能正常降入陰囊內(nèi)，是小兒泌尿外科常見(jiàn)的先天性畸形之一。新生兒隱睪發(fā)病率2%～5%，是導(dǎo)致不育及睪丸癌的危險(xiǎn)因素。目前隱睪的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，睪丸引帶的牽拉作用可能在睪丸下降過(guò)程中發(fā)揮重要作用。睪丸的分化和發(fā)育與雄激素密切相關(guān)，雄激素必須通過(guò)其靶器官雄激素受體（AR）的介導(dǎo)才能發(fā)揮其生物學(xué)作用。研究［1］發(fā)現(xiàn)，睪丸引帶組織中存在AR 表達(dá)，睪丸引帶可能作為睪丸下降過(guò)程中雄激素作用的靶器官，在雄激素的作用下睪丸引帶發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，參與睪丸下降過(guò)程。我們觀察了不同睪丸位置的隱睪患兒睪丸引帶組織AR表達(dá)情況，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2020 年1 月—2021 年8 月間河北省兒童醫(yī)院泌尿外科收治的單側(cè)隱睪患兒55例，其中左側(cè)隱睪26 例，右側(cè)隱睪29 例，；根據(jù)睪丸位置分為腹腔型隱睪18例、腹股溝型隱睪25例和陰囊高位型隱睪12 例；腹腔型、腹股溝型和陰囊高位型睪丸引帶長(zhǎng)度分別為（2.3 ± 0.4）、（3.1 ± 0.3）、（3.6 ± 0.5）cm。排除標(biāo)準(zhǔn)：①雙側(cè)隱睪患兒；②伴發(fā)其他泌尿生殖系統(tǒng)畸形患兒；③接受內(nèi)分泌治療及其他促進(jìn)睪丸下降的治療患兒。根據(jù)睪丸位置將患兒分為腹腔型隱睪、腹股溝型隱睪和陰囊高位型隱睪。本研究已通過(guò)河北省兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，獲得患兒家長(zhǎng)同意。

1.2 隱睪患兒睪丸引帶組織AR 檢測(cè) 患兒麻醉后觸診確定睪丸位置，經(jīng)腹股溝切口找到睪丸，睪丸引帶為睪丸遠(yuǎn)端向陰囊走形的唯一條索狀組織，提起睪丸牽拉引帶，可見(jiàn)與引帶遠(yuǎn)端相連的皮膚回縮，回縮處為睪丸引帶附著點(diǎn)，引帶長(zhǎng)度為睪丸遠(yuǎn)端到睪丸引帶附著點(diǎn)之間的距離。術(shù)中留取患兒睪丸引帶近端組織標(biāo)本。分別采用免疫組織化學(xué)法、WESTERN Blotting 法檢測(cè)患兒睪丸引帶組織AR。①免疫組織化學(xué)法：取標(biāo)本，石蠟包埋4 μm 切片，70 ℃烤片1 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，PBS 洗滌3 次，微波爐抗原修復(fù)（中高火5 min，中低火20 min），冷卻至室溫，PBS洗滌3次，3%H2O2避光室溫孵育10 min，PBS 洗滌3 次，滴加特異性一抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，第二天恢復(fù)室溫后PBS 洗滌3 次，滴加二抗，37 ℃孵育40 min，PBS 洗滌3 次，DBA 顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明，中性樹(shù)膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察，在顯微鏡下×400倍隨機(jī)選擇10個(gè)區(qū)域，使用Image Pro Plus 軟件測(cè)定平均光密度值，并以10 個(gè)視野下測(cè)的光密度值的平均值作為標(biāo)本AR光密度值。研究重復(fù)3 次，取平均值。②WESTERN Blotting 法：采用組織裂解法提取睪丸引帶組織總蛋白，Bradford 法測(cè)量蛋白質(zhì)含量，SDS-PAGE 電泳分離蛋白質(zhì)，硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，AR（1∶1 000）一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗IgG（1∶5 000）室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯色。以β-actin 為內(nèi)參，用IMAGE J 軟件分析目的條帶的灰度值，以目的條帶灰度值與β-actin 灰度值比值作為AR 相對(duì)表達(dá)量。研究重復(fù)3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析；采用PEARSON 相關(guān)性分析及線性回歸法分析睪丸引帶長(zhǎng)度與隱睪患兒睪丸引帶組織AR 光密度值的相關(guān)性。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果為：腹腔型、腹股溝型和陰囊高位型隱睪患兒睪丸引帶組織AR 的光密度值分別為（212.67 ± 82.84）×10-4、（288.76 ± 68.70）×10-4、（375.75 ± 52.08）×10-4，腹腔型、腹股溝型和陰囊高位型隱睪患兒睪丸引帶組織AR 光密度值逐漸升高，兩兩比較，P均<0.05。

WESTERN Blotting結(jié)果為：腹腔型、腹股溝型和陰囊高位型隱睪患兒睪丸引帶組織AR 相對(duì)表達(dá)量分別為0.60±0.10、0.78±0.10、0.89±0.10，腹腔型、腹股溝型和陰囊高位型隱睪患兒睪丸引帶組織AR相對(duì)表達(dá)量逐漸升高，兩兩比較，P均<0.05。

腹腔型、腹股溝型和陰囊高位型睪丸引帶長(zhǎng)度分別為（2.3 ± 0.4）、（3.1 ± 0.3）、（3.6 ± 0.5）cm 睪丸引帶長(zhǎng)度與隱睪患兒睪丸引帶組織AR 光密度值呈負(fù)相關(guān)（r=-0.770，P<0.001）。

3 討論

小兒隱睪癥是小兒泌尿外科常見(jiàn)疾病，目前對(duì)于隱睪的發(fā)病機(jī)制目前尚未闡明。睪丸下降過(guò)程是一多因素、多階段參與的復(fù)雜的生理過(guò)程，其主要包括腹腔內(nèi)下降階段和腹股溝陰囊下降階段兩個(gè)階段［1-2］。睪丸下降第一階段主要發(fā)生于胚胎10～23周左右，目前研究表明，腹腔內(nèi)階段睪丸的下降主要是由睪丸Leydig 細(xì)胞分泌的胰島素樣因子-3（Insu‐lin like3、INSL-3）在這以階段發(fā)揮重要作用［3］，其主要通過(guò)睪丸引帶上的INSL-3 受體，刺激睪丸引帶生長(zhǎng)牽拉睪丸，將睪丸從腎周分離出來(lái)，牽拉至腹股溝去。INSL-3受體目前已經(jīng)被確定為富含亮氨酸G蛋白耦聯(lián)受體8（leucine-richG-protein-coupled recep‐tor8，LGR8），其在睪丸曲細(xì)精管細(xì)胞膜表面結(jié)合，激活G 蛋白，使位于內(nèi)膜表面的腺苷酸環(huán)化酶活性上調(diào)，從而促進(jìn)引帶細(xì)胞分化，睪丸位置下降。INSL-3基因突變可能影響LGR8 結(jié)構(gòu)、活性及表達(dá)量，進(jìn)而導(dǎo)致引帶退化而使睪丸下降受阻，最終導(dǎo)致隱睪。睪丸下降第二階段主要始于胚胎26～28 周，至出生完成，目前認(rèn)為，雄激素在此階段發(fā)揮重要作用［4］，并且誘導(dǎo)腹股溝管和外生殖器官的發(fā)育，在此過(guò)程中睪丸引帶扮演重要的角色，但雄激素通過(guò)何種途徑和機(jī)制影響引帶，并通過(guò)它進(jìn)一步影響生殖系統(tǒng)的發(fā)育尚存在很大爭(zhēng)議。GEORGE 等［5］首次研究發(fā)現(xiàn)，睪丸引帶上存在AR 表達(dá)，為雄激素的直接作用提供了理論依據(jù)。PARK等［6］研究發(fā)現(xiàn)，在睪丸下降過(guò)程中睪丸引帶存在節(jié)律性收縮，該過(guò)程與生殖股神經(jīng)（GFN）及其神經(jīng)遞質(zhì)降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）的調(diào)節(jié)相關(guān)，并進(jìn)一步證實(shí)了雄激素可能通過(guò)位于脊髓的GFN 核上的AR 調(diào)節(jié)GNS末梢分泌CGRP，CGRP再作用于睪丸引帶CGRP受體，發(fā)揮影響睪丸引帶的作用。

在孕早期，胎兒睪丸引帶由稀疏的膠原纖維和松散的細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，隨后膠原纖維不斷增加，彈性纖維也以同樣的方式增加，纖維母細(xì)胞成為占主導(dǎo)地位的細(xì)胞類型，隨著孕齡的增加而降低，平滑肌細(xì)胞主要位于血管壁；橫紋肌細(xì)胞位于睪丸引帶的遠(yuǎn)端近陰囊處，分成不同方向的幾束，其含量隨孕齡的增加而降低［7］。睪丸引帶在睪丸下降過(guò)程中的不同階段發(fā)生著不同的變化，主要可以分為引帶組織腫脹階段和引帶組織退化階段。第一階段主要表現(xiàn)為以下特征：細(xì)胞明顯增殖，粘多糖及透明質(zhì)酸鈉大量積聚，細(xì)胞內(nèi)水分增多，細(xì)胞外基質(zhì)增多［8-9］。HO‐SIE 等［10］提出雄激素對(duì)睪丸發(fā)育影響有可能通過(guò)增加粘多糖引起睪丸引帶組織腫脹，擴(kuò)張腹股溝管，從而促進(jìn)睪丸下降。林慶軍等［11］通過(guò)對(duì)小鼠引帶組織AR 表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)睪丸引帶積極參與了睪丸一期下降過(guò)程，并且與雄激素代謝密切相關(guān)，雄激素通過(guò)引帶AR 增強(qiáng)引帶發(fā)育，并促進(jìn)或成為睪丸下降奠定基礎(chǔ)。第二階段主要表現(xiàn)為伴隨睪丸下降，睪丸引帶長(zhǎng)度的縮短；在雄激素介導(dǎo)作用下，細(xì)胞內(nèi)積聚的粘多糖及透明質(zhì)酸鈉成分降解，細(xì)胞外基質(zhì)呈脫水改變，睪丸引帶細(xì)胞出現(xiàn)凝聚反應(yīng)［12］。雄激素缺乏與睪丸引帶退化失敗關(guān)系密切，兩者的密切關(guān)系對(duì)于闡明雄激素介導(dǎo)睪丸下降具有重要意義［13］。

BARTECZKO 等［14］研究認(rèn)為，睪丸引帶發(fā)育可分為三個(gè)時(shí)期：Ⅰ期為早期，引帶結(jié)構(gòu)通過(guò)中腎管皺褶的尾部與腹側(cè)壁相連至臍動(dòng)脈；Ⅱ期可看到引帶的腹側(cè)面緊密連接于腹膜鞘突的背側(cè)面，在它們的相交處引帶頭端插入生殖管的間質(zhì)部，引帶尾端將睪丸尾端和生殖管間質(zhì)的背部連在一起。Ⅲ期時(shí)可以觀察到引帶的內(nèi)部結(jié)構(gòu)并可通過(guò)性腺位置判斷性別，此期睪丸體積增大并靠近生殖管的間充質(zhì)。并且研究還發(fā)現(xiàn)睪丸引帶與腹膜鞘突的結(jié)構(gòu)和排列與睪丸下降關(guān)系密切，與臨床上隱睪總是與睪丸引帶和腹膜鞘突異常關(guān)聯(lián)的情況一致。

睪丸與附睪自腹腔內(nèi)的下降過(guò)程中依賴于位于其遠(yuǎn)端的睪丸引帶的發(fā)育和重塑。對(duì)于睪丸引帶的作用機(jī)制，現(xiàn)在認(rèn)為睪丸引帶上存在許多與睪丸下降有關(guān)的受體，多種因子作用于睪丸引帶上的這些受體后會(huì)產(chǎn)生收縮性改變和位置遷移，從而促使睪丸下降。本研究中觀察了不同睪丸位置的患兒睪丸引帶組織AR 表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，睪丸位置較高的隱睪患兒睪丸引帶組織AR 低表達(dá)，睪丸引帶長(zhǎng)度較長(zhǎng)，隨著睪丸位置的降低，睪丸引帶長(zhǎng)度逐漸縮短，睪丸引帶組織中AR 表達(dá)增多，且睪丸引帶長(zhǎng)度與睪丸引帶組織AR 表達(dá)成線性相關(guān)。在睪丸進(jìn)入陰囊階段，睪丸引帶引導(dǎo)睪丸通過(guò)擴(kuò)張的腹股溝管進(jìn)入陰囊，同時(shí)引帶逐步縮短退化，含水量不斷減少，纖維成分不斷增加，最終退化成纖維帶，錨定睪丸于陰囊內(nèi)［15］。劉新福等［16］研究表明睪丸引帶參與引導(dǎo)和牽拉睪丸進(jìn)入腹股溝和陰囊，并最終退化形成在附睪與陰囊之間固定睪丸并阻止其上升。目前研究均已表明睪丸下降過(guò)程中第二階段，睪丸引帶組織退化的重要作用，與本研究中隨睪丸位置降低，睪丸引帶組織退化的表現(xiàn)相一致，進(jìn)一步說(shuō)明在睪丸下降第二階段過(guò)程中雄激素發(fā)揮重要作用。

綜上所述，陰囊高位型隱睪患兒睪丸引帶組織AR 表達(dá)高于腹腔型、腹股溝型患兒。睪丸引帶長(zhǎng)度與隱睪患兒睪丸引帶組織AR 光密度值呈負(fù)相關(guān)。睪丸位置較高的隱睪患兒睪丸引帶組織AR 表達(dá)低，睪丸引帶長(zhǎng)度較長(zhǎng)。睪丸引帶組織AR 表達(dá)可能參與了睪丸下降。深入研究雄激素在睪丸引帶發(fā)育中的作用機(jī)制，有利于進(jìn)一步對(duì)睪丸下降機(jī)制的了解，為激素治療隱睪理論研究提供新思路。