高效液相色譜－串聯(lián)質譜法檢測配合飼料中11種蛋白同化激素含量

王 博，張 婧，貢松松，張浩然，徐 汀，陳思思，吳劍平，嚴 鳳

（上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103）

蛋白同化激素俗稱合成類固醇，是一類擬雄性激素的人工合成的甾體激素，用藥后易吸收，血中濃度高，體內(nèi)活性大，具有促進蛋白質合成和抑制蛋白質異化，增加食欲、增長肌肉、增加體重及增強體質等多種作用［1－2］。因此有不法商家在肉用畜禽飼料中添加此類激素以提高產(chǎn)量和品質，但這些激素會通過肉、奶、蛋等副食品向人體內(nèi)遷移蓄積，長期食用會導致肝功能障礙，兒童性早熟，異性特征顯現(xiàn)，內(nèi)分泌紊亂，甚至誘發(fā)一些腺體腫瘤［3－5］。

國內(nèi)在2008年制定了GB/T 22260－2008《飼料中甲基睪丸酮的測定高效液相色譜串聯(lián)質譜法》［6］，但檢測藥物只有1種，而同年發(fā)布的農(nóng)業(yè)部公告1068－3－2008《飼料中10種蛋白同化激素的測定液相色譜－串聯(lián)質譜法》［7］中涵蓋了10種常用蛋白同化激素，但檢測的蛋白同化激素只有4大類。根據(jù)生化結構與化學合成方法，常用的蛋白同化激素可分為睪酮衍生物、雄烷衍生物、諾龍衍生物、雜環(huán)衍生物、雜類合成類固醇5大類，現(xiàn)有檢測標準均不能滿足實際檢測要求。自1988年起，歐盟就已禁止動物源性食品中使用激素，日本規(guī)定牛肉中雌三醇、孕酮的最大殘留限量（MRL）為0.01 mg/kg，美國規(guī)定牛肉、羊肉中孕酮的MRL為0.003 mg/kg，韓國規(guī)定牛肉中孕酮的MRL也為0.003 mg/kg［8］。

國內(nèi)外有較多關于蛋白同化激素含量檢測的文獻，檢測方法多為液相色譜－質譜法［9－12］、氣相色譜－質譜法［13－16］，檢測對象多為血清［17－18］、動物組織［19－20］和尿液［21－22］，關于飼料中蛋白同化激素的研究較少。飼料基質復雜，基質效應明顯，已有標準采用基質匹配方法進行定量，但操作繁瑣不便于推廣。本文以睪酮衍生物（睪酮、甲基睪酮、勃地龍）、雄烷衍生物（美雄酮、雄烯二酮、脫氫異雄酮）、諾龍衍生物（諾龍、丙酸諾龍）、雜環(huán)衍生物（司坦唑醇）和雜類合成類固醇（美倫孕酮、黃體酮）5大類蛋白同化激素為研究對象，建立了同時檢測配合飼料中11種蛋白同化激素的高效液相色譜－串聯(lián)質譜法，采用內(nèi)標法輔助定量，能很好彌補國內(nèi)外的研究空白。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UPLC－XEVO－TQ－MS高效液相色譜串聯(lián)四極桿質譜（美國Waters公司）；離心機（德國Beckman公司）；萬分之一電子天平（瑞士梅特勒－托利多儀器有限公司）；旋渦振蕩器（北京Targin公司）；氮吹儀（上海安譜實驗科技股份有限公司）；Milli－Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

甲醇、乙腈、甲酸（色譜純，德國默克公司）；乙酸乙酯（色譜純，美國J.T.Baker公司）；睪酮、甲基睪酮、勃地龍、美雄酮、雄烯二酮、脫氫異雄酮、諾龍、丙酸諾龍、司坦唑醇、美倫孕酮、黃體酮、睪酮－D3、甲基睪酮－D3、勃地龍－D3、美雄酮－D3、雄烯二酮－D7、脫氫異雄酮－D2、諾龍－D3、丙酸諾龍－D3、司坦唑醇－D3、美倫孕酮－D3、黃體酮－D9（德國Dr.Ehrenstorfer公司）。飼料樣品均來自市面收集，于3℃下保存。

1.2 標準溶液的配制

11種蛋白同化激素混合標準儲備液（1 mg/mL）：稱取各蛋白同化激素對照品10 mg，用乙腈定容于10 mL容量瓶中；11種同位素內(nèi)標混合儲備液（1 μg/mL）：準確量取各同位素內(nèi)標母液（100 μg/mL）100 μL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容。標準溶液均置于-20℃保存，備用。

1.3 樣品前處理

稱取試樣1 g（精確至0.01 g），置于50 mL離心管中，準確加入100 μL內(nèi)標溶液和20 mL乙腈，以1 500 r/min振蕩提取20 min，9 000 r/min離心5 min。取3 mL上清液至50 mL離心管中，加入100 mg PSA粉，渦旋1 min，9 000 r/min離心5 min，取2 mL上清液至10 mL離心管中，于50℃下用氮氣吹干，用1 mL 50%乙腈溶液溶解，渦旋混勻，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后上機測定。

1.4 測定條件

色譜條件：色譜柱：Phenomenex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；柱溫：35℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：10 μL；流動相：A為乙腈，B為0.01%甲酸溶液；梯度洗脫程序：0～2 min，40%A；2～5 min，40%～100%A；5～6 min，100%A；6～6.1 min，100%～40%A；6.1～7.5 min，40%A。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI），采用正離子模式掃描；載氣：800 L/min；反吹氣：3 L/min；霧化氣溫度：500℃；電離電壓：3.5 kV；離子源溫度：150℃。各目標物的采集離子對信息及質譜條件見表1。

表1 各目標化合物和內(nèi)標的質譜碎片離子信息、錐孔電壓、碰撞能量及保留時間Table 1 Mass spectral fragment ion informations，cone voltages，collision energies and retention times of analytes and their internal standards

2 結果與討論

2.1 色譜－質譜條件的優(yōu)化

ESI+離子化模式下，在m/z50～1 000范圍內(nèi)進行一級質譜全掃描，得到11種目標物的總離子色譜圖，選擇2個離子作為定性離子，選擇響應高且無雜質干擾的1個離子作為定量離子，各目標物的母離子和子離子見表1。比較其提取離子色譜圖的響應和峰形，依次優(yōu)化得到各參數(shù)如“1.4”所示。

以Phenomenex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）為分離色譜柱，分別考察了甲醇-0.1%甲酸（40∶60，體積比，下同）、甲醇-0.1%甲酸（80∶20）、乙腈-0.1%甲酸（60∶40）、乙腈-0.1%甲酸（40∶60）、乙腈-0.05%甲酸（40∶60）、乙腈-0.01%甲酸（40∶60）、乙腈-水（40∶60）為流動相時對目標物響應的影響。結果顯示，當流動相有機相為甲醇時，部分目標物的峰形較差，響應較低，可能是因為部分目標物難溶于甲醇；當流動相不含酸時，丙酸諾龍的響應差，當流動相中含少量酸時，各目標物的峰形好，響應高，因此選用乙腈-0.01%甲酸（40∶60）作為流動相。同時對流速、色譜柱溫度等條件進行優(yōu)化，確定色譜條件如“1.4”所示。

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇向空白豬配合飼料中添加11種蛋白同化激素標準品，考察了分別以甲醇、30%甲醇、乙腈、30%乙腈、乙酸乙酯為提取溶劑時的提取效果。結果表明，以乙腈和乙酸乙酯為提取溶劑時的提取效率相對較高，這可能是因為部分目標物不溶于水或甲醇所致。考慮到后續(xù)實驗操作的簡便性，選擇乙腈作為提取溶劑。

2.2.2 凈化條件的選擇向空白豬配合飼料中添加11種蛋白同化激素標準品，經(jīng)乙腈提取后，分別選擇常用的SPE法（分別為HLB（60 mg/3mL）、PRIME HLB（60 mg/3mL）、MCX（60 mg/3 mL）固相萃取柱）、正己烷液液萃取法和QuEChERS法進行凈化條件考察。結果發(fā)現(xiàn)，使用SPE法凈化時司坦唑醇較難洗脫，可能是因為甾醇類藥物易被吸附；使用正己烷液液萃取凈化時，正己烷會將一部分蛋白同化激素除去，造成損失。因此采用QuEChERS法凈化，分別對比了酸性Al2O3、C18和PSA粉3種凈化劑的效果，發(fā)現(xiàn)選擇酸性Al2O3時司坦唑醇約有40%被吸附，選擇C18粉時會造成部分目標物損失，而選擇PSA粉時能較大提高丙酸諾龍的提取效率，且對其余目標物影響不大。因此，實驗選擇PSA粉作為凈化條件。

2.3 方法學驗證

2.3.1 基質效應基質效應是指在樣品測試過程中，待測物以外的其他物質直接或間接影響待測物響應的現(xiàn)象，從而影響定量分析的可靠性和準確性?；|效應可通過下式評價：ME（%）=基質溶液中分析物的峰面積/純?nèi)軇┲蟹治鑫锏姆迕娣e×100%。當ME在85%～115%之間，表明不存在基質效應；當ME大于或小于85%時，表明存在基質效應。實驗分別比較了不同空白豬配合飼料和雞配合飼料基質中添加100 μg/kg蛋白同化激素標準品的檢測結果。如圖1所示，11種蛋白同化激素的ME值為51.6%～105%，表明基質對部分目標物檢測有抑制作用。消除基質效應的常見方法有基質匹配標準曲線法、內(nèi)標法，本實驗選擇內(nèi)標法輔助定量。

圖1 11種蛋白同化激素的基質效應Fig.1 Matrix effects of 11 anabolic androgenic steroids

2.3.2 標準曲線精密移取適量11種蛋白同化激素標準儲備液，加入適量內(nèi)標，用50%乙腈溶液稀釋成質量濃度分別為1、5、10、50、100 ng/mL的標準曲線系列工作溶液（內(nèi)標質量濃度為10 ng/mL），在優(yōu)化的色譜和質譜條件下進行測定。

以蛋白同化激素和同位素內(nèi)標質量濃度的比值為橫坐標（X），蛋白同化激素和同位素內(nèi)標的峰面積比值為縱坐標（Y），繪制標準曲線。結果顯示，各蛋白同化激素在1～100 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，相關系數(shù)（r2）均為0.999。

2.3.3 檢出限與定量下限在上述空白豬配合飼料和雞配合飼料中添加一定濃度的蛋白同化激素對照品，按照本方法進行測定，分別以3倍和10倍信噪比（S/N）對應的質量濃度為檢出限和定量下限。確定本方法的檢出限為20 μg/kg，定量下限為50 μg/kg?？瞻纂u配合飼料中添加50 μg/kg的特征離子質量色譜圖見圖2。

圖2 空白雞配合飼料中添加50 μg/kg的色譜圖Fig.2 Chromatograms of blank chicken compound feed added 50 μg/kg

2.3.4 回收率與相對標準偏差選取9類空白飼料樣品進行加標回收率及精密度實驗，樣品分別添加50、250、500 μg/kg 3個濃度水平的標準溶液，每個濃度平行測定5次，計算平均回收率及相對標準偏差（RSD），其中，雞配合飼料和豬配合飼料的結果分別見表2和表3。3個加標水平下，雞配合飼料中各蛋白同化激素的回收率為94.5%～111%，日內(nèi)RSD為1.2%～13%，日間RSD為1.4%～13%；豬配合飼料中各蛋白同化激素的回收率為90.1%～109%，日內(nèi)RSD為1.5%～9.0%，日間RSD為1.6%～8.8%。結果均符合GB/T 23182－2008《飼料中獸藥及其他化學物檢測試驗規(guī)程》［23］的要求。

表2 雞配合飼料中11種蛋白同化激素的回收率及相對標準偏差（n=5）Table 2 Recoveries and relative standard deviations of 11 anabolic androgenic steroids in chicken compound feed（n=5）

表3 豬配合飼料中11種蛋白同化激素的回收率及相對標準偏差（n=5）Table 3 Recoveries and relative standard deviations of 11 anabolic androgenic steroids in pig compound feed（n=5）

2.4 實際樣品檢測

采用本方法對收集的30批配合飼料樣品進行測定。在8批雞配合飼料中檢出睪酮和勃地龍，含量分別為9.09～14.68 mg/kg和1.22～1.84 mg/kg（見表4）。

表4 陽性實際樣品的測定結果Table 4 Determination results of actual positive samples

3 結論

本研究建立了配合飼料中11種蛋白同化激素的HPLC－MS/MS檢測方法。本方法前處理簡便，采用內(nèi)標法定量，便于操作且易于推廣，可對飼料中蛋白同化激素進行較為全面的檢測，有助于飼料中違法濫用蛋白同化激素的監(jiān)管。