磁性側(cè)流層析技術(shù)在食品污染物快速檢測中的研究進(jìn)展

翟文磊，韓晨瑞，4，韋迪哲，肖志勇，孔 聰，王 蒙*

（1．北京市農(nóng)林科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京 100097；2．北京市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，北京 100029；3．中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；4．中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

側(cè)流層析法（Lateral flow assay，LFA）是一種基于層析原理建立的快速檢測技術(shù)。以條狀纖維為固相，借助毛細(xì)管作用使樣品在試紙條上移動，樣品中的目標(biāo)物與試紙條上一定區(qū)域的生物活性材料（抗原/抗體/核酸適配體等）特異性結(jié)合，依據(jù)信號的變化實(shí)現(xiàn)定性、定量檢測［1］。試紙條一般由樣品墊、結(jié)合墊、層析膜、吸水墊和輔助結(jié)構(gòu)組成，層析膜上固定兩條或多條不同的生物活性材料構(gòu)成檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線）。LFA克服了傳統(tǒng)檢測技術(shù)步驟繁瑣、耗時(shí)長、成本高、依賴大型儀器等問題，具有操作簡單、快速實(shí)時(shí)、成本低等優(yōu)點(diǎn)，適用于對特定目標(biāo)物的現(xiàn)場快速篩查［2］。

磁性納米材料經(jīng)化學(xué)修飾后具有良好的水分散性和穩(wěn)定性，已被廣泛應(yīng)用于多種物質(zhì)的磁分離濃縮和檢測［3］。將具有強(qiáng)磁性和單分散性的磁性納米材料與LFA試紙條相結(jié)合，能顯著提高檢測方法的靈敏度、穩(wěn)定性和重復(fù)性。近年來，磁性側(cè)流層析法（Magnetic lateral flow assay，MLFA）的開發(fā)逐漸成為LFA領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，在食品安全領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景［4］。圖1是在Web of Science數(shù)據(jù)庫上以“Magnetic lateral flow assay”為主題詞的檢索結(jié)果，可以看出，該方向論文的發(fā)表量呈逐年遞增的趨勢，表明相關(guān)研究已受到越來越多的關(guān)注。本文重點(diǎn)介紹近五年MLFA技術(shù)在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)展，根據(jù)檢測對象種類，分別從食源性致病微生物和小分子危害物質(zhì)殘留的檢測兩個(gè)方面進(jìn)行總結(jié)，并從技術(shù)原理、檢測性能、材料特點(diǎn)等方面展開討論，為相關(guān)領(lǐng)域的科研單位、市場監(jiān)管部門和生產(chǎn)企業(yè)提供參考。

圖1 Web of Science數(shù)據(jù)庫上以“magnetic lateral flow assay”為主題詞檢索相關(guān)文獻(xiàn)按出版時(shí)間的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)時(shí)間截止至2022年6月Fig.1 The data of new publications of MLFA in each year obtained by searching terms“magnetic lateral flow assay”in Web of Science database，the date was until June，2022

1 磁性納米材料

1.1 Fe3O4免疫磁珠

磁性納米顆粒（Magnetic nanoparticles，MNPs）是尺寸為納米級別的磁性材料，以Fe3O4納米顆粒為代表。經(jīng)表面功能化修飾后的MNPs在外磁場作用下可實(shí)現(xiàn)快速分離和富集，高效簡便，適用于樣品檢測中的前處理［5－6］。

目前研究大多采用碳化二亞胺（EDC－NHS）接枝法將抗體修飾在MNPs表面，得到免疫磁珠用于目標(biāo)物的快速分離與富集［7］。結(jié)合了待測物的免疫磁珠經(jīng)試紙條層析后，根據(jù)試紙條上T線和C線的顏色對比進(jìn)行定性檢測。通過建立目標(biāo)物濃度與T線和C線上光密度或磁信號強(qiáng)度的關(guān)系，實(shí)現(xiàn)定量檢測。

1.2 多功能磁性納米復(fù)合物

單一的Fe3O4免疫磁珠雖然應(yīng)用廣泛，但信號輸出方式單一。通過將MNPs與貴金屬、量子點(diǎn)等納米材料進(jìn)行復(fù)合，可制備出兼具磁分離富集和信號輸出雙功能的納米探針，更好地滿足MLFA應(yīng)用的需求。

將MNPs與金納米顆粒（AuNPs）結(jié)合的金磁納米復(fù)合物，既部分保留其超順磁性，又能增強(qiáng)其穩(wěn)定性、電導(dǎo)率、光學(xué)性能和表面生物相容性。應(yīng)用于試紙條中的金磁納米顆粒通常為“金包磁”核殼結(jié)構(gòu)［8］，通過自組裝或種子生長法將AuNPs包裹在MNPs表面，再修飾抗體得到功能化金磁納米顆粒。利用AuNPs的光學(xué)特性，通過比較試紙條T線和C線上的顏色變化可實(shí)現(xiàn)可視化檢測。此外，還可利用AuNPs本身的表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）活性，在其上修飾探針分子進(jìn)行SERS檢測，提高靈敏度。另一方面，近期也有少量研究通過構(gòu)建“磁包金”核殼結(jié)構(gòu)［9］，獲得兼具超順磁性和等離子體活性的復(fù)合納米材料用于血清等復(fù)雜生物樣品中特定物質(zhì)的MLFA分析。

另一類可與MNPs復(fù)合的納米材料是量子點(diǎn)（QDs），通過靜電組裝等方法在MNPs上包裹QDs，得到磁性和熒光雙功能納米球［10－11］。利用該材料可在MLFA試紙條上實(shí)現(xiàn)熒光定量分析，且標(biāo)記不同發(fā)射波長的QDs可實(shí)現(xiàn)對數(shù)個(gè)目標(biāo)物的同步檢測，在多靶標(biāo)檢測中具備優(yōu)勢［12］。值得注意的是，除了AuNPs和QDs，近期也有將納米酶等材料與MNPs復(fù)合用于MLFA的研究報(bào)道［13］，利用特有的類酶催化活性可實(shí)現(xiàn)更靈敏的分析，也為MLFA的發(fā)展提供了更多樣化的檢測模式。

2 MLFA用于食源性病原菌檢測

食源性病原菌是影響食品安全的重要風(fēng)險(xiǎn)因子之一，常見的食源性病原菌包括大腸桿菌O157∶H7（E.coliO157∶H7）、腸炎沙門氏菌（S.enteritidis）、傷寒沙門氏菌（S.typhi）、單增李斯特菌（L.monocytogenes）、霍亂弧菌（V.cholerae）、致病性副溶血性弧菌（V.parahaemolyticus）等［14］。這些細(xì)菌一般具有多抗原位點(diǎn)，MLFA中一般采取雙抗體夾心法，即結(jié)合墊或預(yù)處理時(shí)加入經(jīng)標(biāo)記的待測物的單抗1，T線固定識別待測物不同抗原位點(diǎn)的單抗2或多抗，C線固定抗種屬特異性的二抗，利用T線和C線特定信號強(qiáng)度的變化實(shí)現(xiàn)定量檢測。

2.1 E.coli O157∶H7

E.coliO157∶H7是腸出血性大腸桿菌的代表菌株，是引起出血性結(jié)腸炎的主要致病菌，很少量菌數(shù)的E.coliO157∶H7即可引發(fā)感染［15］。由于其嚴(yán)重危害，針對食品中E.coliO157∶H7的檢測顯得尤為重要。傳統(tǒng)的檢測方法包括增菌培養(yǎng)、LFA、酶聯(lián)免疫分析、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）等［16］。由于在樣品前處理和檢測靈敏度上的優(yōu)勢，MLFA近幾年也被用于E.coliO157∶H7的快速檢測。

Dou等［13］提出了一種非標(biāo)記和雙信號輸出的病原菌檢測方法。如圖2A所示，通過制備聚多巴胺包裹的磁珠，并在其表面修飾鉑納米酶，得到Fe3O4@PDA@Pt復(fù)合納米材料。通過聚多巴胺與細(xì)菌細(xì)胞壁的粘附作用，該納米材料可附著在細(xì)菌表面（見圖2B）。當(dāng)被標(biāo)記的細(xì)菌通過試紙條上修飾了抗體的T線時(shí)，待測細(xì)菌被抗體特異性捕獲，通過納米材料在T線上的聚集變色實(shí)現(xiàn)可視化分析。此外，復(fù)合納米材料表面的鉑納米酶具有類似過氧化物酶的催化活性，可催化顯色反應(yīng)，進(jìn)一步提高檢測靈敏度（見圖2C）。該方法在目測和顯色模式下對E.coliO157∶H7的檢出限（LOD）分別為102和10 CFU/mL，實(shí)現(xiàn)了飲用水和雞肉樣品的快速靈敏檢測。

圖2 多功能Fe3O4@PDA@Pt納米復(fù)合物的制備（A）；基于納米復(fù)合物和E.coli O157∶H7互作的非標(biāo)記策略（B）；利用多功能納米復(fù)合物和側(cè)流免疫層析試紙條實(shí)現(xiàn)E.coli O157∶H7雙模式檢測的原理示意圖（C）［13］Fig.2 Preparation process of the Fe3O4@PDA@Pt nanocomposite（A）；label-free strategy based on the interaction of nanocomposite and E.coli O157∶H7（B）；schematic illustration of the multifunctional nanocomposite mediated dual-readout LFA strip for E.coli O157∶H7 detection（C）［13］

Huang等［17］開發(fā)了基于免疫磁珠的MLFA方法用于E.coliO157∶H7的檢測。首先制備了抗體修飾的Fe3O4@SiO2@QDs核殼結(jié)構(gòu)熒光磁珠，該材料在待測溶液中可選擇性結(jié)合E.coliO157∶H7，經(jīng)外加磁場富集后，在免疫層析試紙條上進(jìn)行檢測。Ilhan等［18］利用免疫磁珠對待測溶液中的E.coliO157∶H7進(jìn)行富集和純化，同時(shí)制備抗體修飾的SERS探針并預(yù)先包埋在試紙條的結(jié)合墊上，當(dāng)純化后的樣品溶液經(jīng)過時(shí)，E.coliO157∶H7被SERS探針標(biāo)記，根據(jù)T線和C線上SERS信號的強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)定量檢測。

2.2 沙門氏菌

近幾年，因沙門氏菌感染引發(fā)的食物中毒事件時(shí)有發(fā)生。該病原菌不僅能感染禽畜導(dǎo)致發(fā)病死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，且人食用被污染的禽畜產(chǎn)品后，會導(dǎo)致急性腸胃炎等病癥［19］。為有效防范因其造成的食品安全事件，相關(guān)部門開展了大量沙門氏菌快檢方法的研究。

Hu等［20］報(bào)道了一種基于MLFA的病原菌快速靈敏檢測方法，實(shí)現(xiàn)了可視化、熒光和磁信號三種不同模式的信號輸出。如圖3所示，首先，利用抗體標(biāo)記的Fe3O4@QDs磁珠對傷寒沙門氏菌進(jìn)行分離和富集，然后滴加在樣品墊上，通過免疫層析試紙條進(jìn)行分析。磁分離的引入提高了該方法的抗干擾能力和靈敏度，通過可視化和磁信號兩種模式，對該病原菌的檢測靈敏度分別為1.88×104和3.75×103CFU/mL。此外，通過熒光和磁信號兩種模式，可在1.88×104～1.88×107CFU/mL范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)定量檢測。以自來水、牛奶、胎牛血清和全血作為基質(zhì)，證實(shí)了該方法可滿足復(fù)雜基質(zhì)中傷寒沙門氏菌的快檢需求。

圖3 基于比色－熒光－磁性多功能納米球和側(cè)流免疫層析法的傷寒沙門氏菌多模式檢測原理示意圖［20］Fig.3 Illustration of multi-signal readout detection of S.typhi by colorimetric－fluorescent－magnetic nanospheres based LFA［20］

Wang等［21］提出了一種非標(biāo)記的側(cè)流免疫層析法用于腸炎沙門氏菌的現(xiàn)場檢測。以類石墨相氮化碳（g－C3N4）為原料，經(jīng)煅燒和蝕刻得到表面帶正電荷的富含氮的碳點(diǎn)。該碳點(diǎn)可通過靜電作用吸附在病原菌上，通過在T線上包埋特異性抗體，可將被標(biāo)記的腸炎沙門氏菌捕獲，導(dǎo)致T線顏色逐漸加深，實(shí)現(xiàn)了對低至102CFU/mL目標(biāo)病原菌的可視化檢測，且在不同的蔬菜沙拉和果汁加標(biāo)樣品中均得到較好的回收率。此外，該課題組還開發(fā)了一種雙識別策略的MLFA技術(shù)，用于腸炎沙門氏菌的快速檢測［22］。分別選用抗生素和抗體作為目標(biāo)病原菌的識別元件，首先制備了氨芐西林包裹的磁珠，該材料對細(xì)菌有很好的結(jié)合、分離和富集能力。在此基礎(chǔ)上，將T線上的抗體作為特異性識別元件，從待測溶液中選擇性捕獲腸炎沙門氏菌，可達(dá)到102～103CFU/mL的可視化檢測靈敏度。相比于傳統(tǒng)的雙抗體夾心法，該方法具有低成本、易制備、靈敏高效的優(yōu)勢。

以上工作均基于免疫層析技術(shù)的原理開發(fā)。相比于抗體，核酸適配體具有篩選成本低、制備簡單、易進(jìn)行化學(xué)修飾等優(yōu)點(diǎn)，此外，通過引入核酸傳感中的信號放大策略，能顯著提高檢測靈敏度。因此，以核酸適配體作為識別元件應(yīng)用于LFA受到越來越多的關(guān)注［23－24］。例如，Gao等［25］近期報(bào)道了一種基于適配體和磁分離的MLFA方法，實(shí)現(xiàn)了對傷寒沙門氏菌的靈敏檢測。如圖4A所示，修飾了適配體的磁珠與目標(biāo)細(xì)菌結(jié)合后，釋放出單鏈DNA1，該核酸片段被修飾了互補(bǔ)DNA2的AuNPs捕獲，利用核酸側(cè)流層析試紙條檢測捕獲探針，可實(shí)現(xiàn)定量分析。此外，利用核酸雜交引起的AuNPs交聯(lián)，可將AuNPs聚集引起的顏色變化進(jìn)一步放大，提高可視化檢測的靈敏度（見圖4B、C）。通過該方法對培養(yǎng)基中傷寒沙門氏菌的LOD低至8.6 CFU/mL，在牛奶實(shí)際樣品中也可達(dá)到4.1×102CFU/mL，可作為一種潛在的技術(shù)手段用于牛奶中傷寒沙門氏菌的靈敏檢測。

圖4 通過AuNPs聚集體信號增強(qiáng)和磁富集實(shí)現(xiàn)高靈敏檢測傷寒沙門氏菌的側(cè)流層析示意圖（A）；當(dāng)樣品中分別含（左）和不含（右）傷寒沙門氏菌時(shí)，AuNPs聚集體與T線的結(jié)合狀態(tài)（B）；未經(jīng)AuNPs聚集體信號增強(qiáng)的傳統(tǒng)檢測模式（C）［25］Fig.4 Schematic illustration for the detection of S.typhi using AuNPs aggregates enhanced LFA（A），multifold AuNPs on T line in the presence（left）and absence（right）of S.typhi（B），and single-dose AuNPs on T line in the unenhanced LFA（C）［25］

2.3 其他食源性病原菌

除E.coliO157∶H7和腸炎沙門氏菌以外，還有單增李斯特菌［26］、霍亂弧菌［27］等多種食源性病原菌可引發(fā)傳染性疾病，危害人類健康。針對這些病原菌的分析方法開發(fā)也是MLFA研究關(guān)注的熱點(diǎn)。例如，Li等［28］將免疫磁珠與核酸側(cè)流層析試紙條相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對單增李斯特菌的可視化檢測。首先利用生物素修飾的抗體識別目標(biāo)細(xì)菌，然后加入親和素修飾的磁珠，利用生物素與親和素之間的特異性相互作用與細(xì)菌結(jié)合，再通過磁分離進(jìn)行富集。所得產(chǎn)物先用疊氮溴化丙錠處理，以避免死細(xì)菌引起的假陽性，最后經(jīng)DNA提取和PCR擴(kuò)增，通過核酸側(cè)流層析試紙條對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，可在6 h內(nèi)完成，對生菜樣品中單增李斯特菌的LOD為3.5×104CFU/g。

在另一項(xiàng)研究中，F(xiàn)ang等［29］針對食源性霍亂弧菌開發(fā)了快速靈敏的側(cè)流層析試紙條檢測方法。以霍亂弧菌ctxA基因?yàn)榘袠?biāo)設(shè)計(jì)引物，并修飾生物素和熒光素。利用重組酶介導(dǎo)的擴(kuò)增技術(shù)對靶標(biāo)基因進(jìn)行快速擴(kuò)增，所得產(chǎn)物分別與熒光素抗體和親和素修飾的磁珠結(jié)合，形成的復(fù)合物被試紙條T線上的二抗捕獲，通過檢測磁信號強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)細(xì)菌的檢測。在50 min內(nèi)對蝦仁中霍亂弧菌可視化和磁信號的LOD分別達(dá)到100 CFU/mL和46 CFU/mL，有望應(yīng)用于食品中該致病菌的快速靈敏檢測。

除霍亂弧菌外，副溶血性弧菌是另一種在海鮮產(chǎn)品中較為常見的食源性病原菌。Ying等［30］開發(fā)了一種基于核酸適配體的MLFA檢測方法，以適配體為識別元件，通過生物素－親和素結(jié)合磁珠進(jìn)行富集，利用雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)放大信號，通過核酸側(cè)流層析試紙條進(jìn)行可視化檢測。該方法不依賴PCR儀和檢測設(shè)備，可在67 min內(nèi)完成對副溶血性弧菌的特異性檢測。

以上研究表明，MLFA試紙條在多種食源性病原菌的快速檢測中具有很好的應(yīng)用前景。此類方法結(jié)合了免疫磁珠快速分離和富集的特點(diǎn)，以及LFA技術(shù)操作簡便、結(jié)果可視化等優(yōu)勢，特別適用于食品生產(chǎn)加工企業(yè)和市場監(jiān)管部門的現(xiàn)場監(jiān)測和抽檢。從識別原理來看，目前針對食源性病原菌的MLFA主要以抗體作為識別元件，也有少量研究利用核酸適配體對目標(biāo)物的識別作用實(shí)現(xiàn)特異性檢測。而信號輸出方式較為多樣化，包括可視化、熒光、磁信號、SERS、納米酶催化顯色等，且雙信號和多信號輸出模式的策略在近幾年被越來越多的報(bào)道，為提升靈敏度和定量能力提供了新的思路。表1列出了部分MLFA用于食源性病原菌檢測的信號輸出模式、檢出限及線性范圍。

表1 MLFA用于食源性病原菌檢測的信號輸出模式、檢出限及線性范圍Table 1 MLFA detection of various foodborne pathogens with different signal readouts，LODs and linear ranges

3 MLFA用于食品中小分子污染物檢測

除食源性病原菌外，有毒有害的小分子污染物也是食品安全中重點(diǎn)關(guān)注的對象［31］，包括真菌毒素［32］、農(nóng)獸藥［33］、非法添加劑［34］等。這些小分子作為簡單半抗原，不具有免疫原性，與抗體的結(jié)合價(jià)為單價(jià)，難以通過類似病原菌的雙抗體夾心法進(jìn)行檢測。因而，針對小分子靶標(biāo)的LFA一般采用競爭法的檢測原理。在結(jié)合墊上固定或預(yù)處理時(shí)加入帶有標(biāo)記物的能識別待測分子的單抗/多抗，T線上固定待測分子的完全抗原，C線上為抗種屬特異性IgG的二抗。當(dāng)樣品中不含待測分子時(shí)，帶標(biāo)記的抗體與T線上的抗原結(jié)合，可在T線處觀察到強(qiáng)信號；當(dāng)含有待測分子時(shí)，其與T線上的抗原競爭結(jié)合抗體，T線信號強(qiáng)度隨之減弱，因此可以根據(jù)信號強(qiáng)度的變化與待測物濃度的關(guān)系實(shí)現(xiàn)對待測分子的定量檢測。

3.1 真菌毒素

真菌毒素是真菌侵染農(nóng)作物產(chǎn)生的有毒次級代謝小分子化合物。常見的真菌毒素包括黃曲霉毒素B1（AFB1）和赭曲霉毒素A（OTA）等，具有致癌、致畸、致突變效應(yīng)，嚴(yán)重威脅人類健康［35］。目前市場上主流的真菌毒素快檢產(chǎn)品多基于免疫層析技術(shù)開發(fā)。通過與磁性納米材料相結(jié)合，可從相對復(fù)雜的樣品基質(zhì)中分離和富集目標(biāo)毒素［36］，進(jìn)一步提高檢測方法的靈敏度和抗干擾能力。

Guo等［37］將QDs和MNPs包裹在核殼結(jié)構(gòu)的聚合物微球中，制備出抗體標(biāo)記的磁性和熒光雙功能納米材料，從醬油中純化和富集AFB1后直接用于免疫層析試紙條的分析，對醬油及其提取物中AFB1的LOD分別為51、3 pg/mL，遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的熒光免疫層析試紙條產(chǎn)品。此外，該課題組還利用同樣方法制備了OTA抗體標(biāo)記的核殼結(jié)構(gòu)金磁納米復(fù)合物［38］（見圖5A），并作為預(yù)處理材料對葡萄汁樣品中的OTA進(jìn)行磁分離富集，重懸后滴加在試紙條上，通過納米復(fù)合物與T線上半抗原的競爭結(jié)合，讀取光密度值進(jìn)行檢測（見圖5B）。與HPLC－MS標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行比對，驗(yàn)證了實(shí)際樣品中OTA靈敏快速檢測的可靠性。

AFB1作為毒性最強(qiáng)的真菌毒素而受到食品和飼料安全領(lǐng)域的重點(diǎn)關(guān)注，牲畜在食用了被污染的飼料后，AFB1在其體內(nèi)被轉(zhuǎn)化成AFM1，有可能進(jìn)入到乳制品中，進(jìn)一步危害人類健康［39］。Liu等［40］針對牛奶中AFM1的快檢需求開發(fā)了MLFA試紙條，通過對免疫磁珠上抗體載量和磁珠尺寸的優(yōu)化，在無需額外預(yù)處理的條件下對牛奶中AFM1含量的判定值為0.02 μg/L，符合歐盟規(guī)定的奶制品中AFM1殘留的最大限量要求。在使用同樣抗體的前提下，該方法的靈敏度比傳統(tǒng)的膠體金免疫層析試紙條提高近50倍。

除AFB1、OTA等霉菌毒素外，以玉米赤霉烯酮（ZEN）和伏馬毒素B1（FB1）為代表的鐮刀菌毒素也是污染農(nóng)作物的常見真菌毒素。Hua等［41］報(bào)道了一種用于谷物中ZEN殘留快檢的磁性免疫層析技術(shù)，利用免疫磁珠先對樣品中的ZEN進(jìn)行富集，再通過基于競爭法的免疫層析試紙條實(shí)現(xiàn)可視化檢測，并在智能手機(jī)上實(shí)現(xiàn)定量結(jié)果的直接讀取。所開發(fā)的試紙條對玉米和小麥中ZEN的判定值為2.5 μg/kg，產(chǎn)品可穩(wěn)定保存6個(gè)月。

以上研究表明MLFA技術(shù)可用于農(nóng)產(chǎn)品和食品中真菌毒素的快速檢測。然而，這些方法均針對單一目標(biāo)物開發(fā)。近期，Zheng等［42］報(bào)道了可同步測定AFB1、OTA和FB1 3種真菌毒素的MLFA技術(shù)。通過分別制備不同抗體修飾的磁性QDs納米珠，得到集靶標(biāo)捕獲和檢測雙功能于一體的免疫探針。分別在試紙條的三條T線上修飾AFB1、OTA和FB1的半抗原，根據(jù)免疫競爭原理可以實(shí)現(xiàn)3種毒素的熒光分析，并在大米、花生、玉米和果汁基質(zhì)中進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)現(xiàn)了多種毒素的同步快速檢測，顯著提高了檢測效率。

3.2 獸藥殘留

隨著人們生活水平的提高，對乳制品和肉制品的需求量也在不斷上升?？股氐全F藥在養(yǎng)殖業(yè)中過量使用，導(dǎo)致獸藥殘留超標(biāo)的問題時(shí)有發(fā)生［43－44］。此外，瘦肉精等禁用藥物在牲畜養(yǎng)殖過程中的非法使用屢禁不止，給相關(guān)行業(yè)的日常監(jiān)管帶來了嚴(yán)峻考驗(yàn)［45］。

針對瘦肉精的快檢技術(shù)需求，Huang等［46］將免疫磁分離和熒光免疫層析技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)了可用于豬尿液中克侖特羅的快速檢測新方法，相比于傳統(tǒng)的膠體金免疫層析試紙條，靈敏度提高了4倍，實(shí)際樣品中的LOD為0.22 ng/mL，加標(biāo)回收率為79.1%～108.9%。此外，Wu等［47］通過乙烯基聚合反應(yīng)將MNPs包裹在表面含磺酸基團(tuán)的聚合物納米球中，該材料對克侖特羅和其他10種β-腎上腺素受體激動劑均有很高的吸附率，可在30 s內(nèi)從0.5 g豬肉中提取出克侖特羅，與膠體金免疫層析技術(shù)相結(jié)合，對豬肉中克侖特羅殘留的LOD為0.1 ng/g。以上方法和材料開發(fā)為更有效監(jiān)測瘦肉精在養(yǎng)殖業(yè)中的非法使用提供了新的技術(shù)手段。

除瘦肉精等違禁藥物外，抗生素類獸藥在乳制品中的殘留問題也日漸突出。針對這一問題，Liu等［48］構(gòu)建了氟喹諾酮的免疫磁珠，并結(jié)合免疫層析試紙條實(shí)現(xiàn)了牛奶中10種氟喹諾酮類抗生素的檢測，檢出限為2～20 ng/mL。在另一項(xiàng)研究中，Yan等［49］建立了一種牛奶中呋喃唑酮的磁性免疫層析快速檢測方法，將MNPs分別標(biāo)記單抗和羊抗鼠IgG二抗，通過形成帶有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)復(fù)合物，只需要標(biāo)記少量單抗即可達(dá)到較好的顯色效果，從而達(dá)到信號放大的目的［29］。

相比于病原菌，針對食品中真菌毒素、獸藥等小分子污染物的MLFA技術(shù)研究較少。然而，與傳統(tǒng)的膠體金免疫層析法相比，通過引入免疫磁珠，可顯著提高分析方法的靈敏度［50］，并能滿足醬油、果汁、牛奶、肉類等復(fù)雜基質(zhì)中微量化合物殘留的檢測需求，因而在對復(fù)雜樣品的現(xiàn)場快檢應(yīng)用中具備一定優(yōu)勢。表2列出了部分MLFA用于食品中小分子污染物檢測的信號輸出模式、檢出限及線性范圍。

表2 MLFA用于食品中小分子污染物檢測的信號輸出模式、檢出限及線性范圍Table 2 MLFA detection of small molecule contaminants in food with different signal readouts，LODs and linear ranges

4 總結(jié)與展望

LFA試紙條作為一種簡單快速的分析載體，在食品安全的多個(gè)方面均有廣泛成熟的應(yīng)用。然而，社會的快速發(fā)展給食品安全領(lǐng)域不斷帶來新的挑戰(zhàn)，也對快檢技術(shù)提出了更高的要求。如何在現(xiàn)有基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提高LFA檢測的性能，拓展其應(yīng)用范圍，已成為重點(diǎn)關(guān)注的問題之一。近年來，將磁性納米材料和LFA試紙條相結(jié)合的研究受到越來越多的關(guān)注。已報(bào)道的MLFA檢測技術(shù)可分為兩大類，一是利用免疫磁珠分離富集目標(biāo)物后再通過試紙條進(jìn)行檢測；二是制備多功能磁性納米材料，使其既可用于樣品前處理，同時(shí)又能作為標(biāo)簽用于信號輸出。

目前MLFA技術(shù)已被成功應(yīng)用于食品中致病菌、真菌毒素和農(nóng)獸藥殘留等有毒有害物質(zhì)的快速檢測，結(jié)果表明該技術(shù)能夠滿足復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)物的分離富集與靈敏檢測，展現(xiàn)出一定的商品化前景。現(xiàn)階段該方向的研究熱點(diǎn)主要集中在新型磁性納米材料的制備，以及針對新目標(biāo)物的檢測方法開發(fā)。然而，為實(shí)現(xiàn)MLFA技術(shù)的大規(guī)模應(yīng)用仍需解決一些關(guān)鍵問題。首先需要提高磁性納米材料的穩(wěn)定性，由于多功能納米材料結(jié)構(gòu)復(fù)雜，用于MLFA檢測時(shí)信號的穩(wěn)定性尚不理想，因此制備性質(zhì)穩(wěn)定、重現(xiàn)性好的磁性納米材料仍然是現(xiàn)階段的研究重點(diǎn)。其次，目前大多數(shù)MLFA均使用抗體作為識別元件，而采用適配體代替抗體在靈敏度和檢測成本等方面具有一定優(yōu)勢［51］，值得在后續(xù)研究中進(jìn)一步關(guān)注。此外，相比于傳統(tǒng)的LFA，該技術(shù)如何在靈敏度、準(zhǔn)確性、成本和易操作性上取得最佳平衡，也是需要進(jìn)一步思考和探索的問題。例如，以智能手機(jī)作為檢測工具，可以充分發(fā)揮試紙條快速、低成本、易操作的優(yōu)勢，在實(shí)際應(yīng)用中取得更好的效果。同時(shí)，針對傳統(tǒng)LFA難以應(yīng)對的復(fù)雜樣品開發(fā)檢測方案，可以發(fā)揮磁性納米材料在樣品前處理上的優(yōu)勢，從而與LFA形成有機(jī)互補(bǔ)。最后，試紙條的信號讀取方式可以更加多樣化，例如利用SERS技術(shù)，既可提高靈敏度，又能實(shí)現(xiàn)多個(gè)目標(biāo)物的同步檢測［52］?？梢灶A(yù)期，隨著相關(guān)研究的不斷深入，MLFA技術(shù)在未來的食品安全快檢中勢必發(fā)揮更重要的作用。