共價有機框架材料TpBD-（NH2）2-D-（-）-α-苯甘氨酸用作高效液相色譜手性固定相的研究

賴亞琳，禹紫云，秦該照，袁黎明

（云南師范大學 化學化工學院，云南 昆明 650500）

高效液相色譜法（HPLC）是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的分離分析方法，具有柱效性高、靈敏度高、選擇性多、解析速度快、使用范圍廣等優(yōu)點［1－3］，能夠用于分析分離大部分有機物，在定性定量分析的眾多領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用。手性固定相（CSP）能夠提供手性識別位點，對不同的對映體表現(xiàn)出立體定向的相互作用，直接影響手性識別和分離的效果，在HPLC手性分離中，CSP的選擇具有至關(guān)重要的作用［4］。共價有機框架材料（COFs）是一類由C、N、H等簡單原子構(gòu)成，具有高度共價孔隙率和周期性的二維或三維有機多孔聚合物［5－7］。與其他聚合物不同，COFs的顯著特征是其結(jié)構(gòu)可預(yù)先設(shè)計且長程有序，并具有比表面積大、超低密度、孔道均一可調(diào)、結(jié)構(gòu)易于調(diào)控和化學穩(wěn)定性高等特點［8－10］。

手性是自然界的基本屬性之一，也廣泛存在于化學領(lǐng)域。手性化合物的對映異構(gòu)體具有不同的生化和藥理活性，在進入生命體后，一種對映體能夠顯示出活性，而另一種對映體往往活性較低甚至會產(chǎn)生生理毒性從而危害生命健康。因此，有關(guān)手性的檢測和分離成為人類生命健康的重要課題。隨著手性科學的不斷發(fā)展，手性共價有機框架化合物（CCOFs）材料由于其優(yōu)異的性質(zhì)得到了研究人員的廣泛關(guān)注，也使其在手性識別［11］、手性分離［12］、生物醫(yī)學［13］和不對稱催化［14］等領(lǐng)域得以迅速發(fā)展。然而，在CCOFs的合成過程中仍然存在一個主要挑戰(zhàn)：平衡手性單體的不對稱性和材料結(jié)晶度。因此，精確控制手性、功能性和結(jié)晶性是一項關(guān)鍵任務(wù)［15］。2018年，崔勇課題組［16］首次將CCOFs材料CCOF－6用于HPLC，實現(xiàn)了1-苯基-1-戊醇、1-苯基-1-丙醇、1-苯基-2-丙醇、1-（4-溴苯）-乙醇的基線分離。2022年，本課題組與崔勇課題組［17］合作將CCOFs材料CCOF－17和CCOF－18用于HPLC和氣相色譜（GC），證明兩種CCOFs材料在溫和及苛刻的色譜條件下均能分離大量外消旋分子和藥物，且手性柱的選擇性和耐用性與相關(guān)的商用手性柱相當，通用性優(yōu)于相關(guān)的商用手性柱，是一種極具潛力的新型手性柱。由此可見，CCOFs材料在手性分離領(lǐng)域具有廣闊前景。

本文采用溶劑熱法合成了非手性COFs（TpBD-（NO2）2），再將TpBD-（NO2）2還原為TpBD-（NH2）2，然后用D-（-）-α-苯甘氨酸對其進行手性修飾，最終得到了具有高孔隙率和結(jié)晶度以及熱穩(wěn)定性高的CCOFs材料TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸。對上述3種COFs材料進行表征，采用“網(wǎng)包法”制備TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸手性固定相，用于高效液相色譜柱的制備，并采用TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱成功拆分了13種手性化合物和5種苯系位置異構(gòu)體，且該色譜柱具有良好的重現(xiàn)性。以上結(jié)果表明CCOFs材料作為固定相在高效液相色譜領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

手性化合物（99%）購于美國Sigma－Aldrich有限公司；苯系位置異構(gòu)體、六亞甲基四胺（99.5%）、無水間苯三酚（99%）、三氟乙酸（TFA，99.5%）、1，4-二氧六環(huán)（99%）、無水氯化亞錫（98%）、苯甲醚（99%）、1，3，5-苯三甲酰氯（98%）均購于阿拉丁試劑（上海）有限公司；四氫呋喃（THF，99%）、甲醇（99.5%）均購于成都科隆化學品有限公司；無水硫酸鈉（99%）、乙酸（99.5%）、二氯甲烷（DCM，99.5%）、異丙醇（99.7%）、正己烷（98%）均購于天津市風船化學試劑科技有限公司；丙酮（99.5%）、鹽酸（HCl，36.0%～38.0%）均購于云南楊林工業(yè)開發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司；1，3，5-三甲苯（99%）、三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸鹽（PyBrOP，98%）、哌嗪（99%）均購于Adamas試劑有限公司；D-（－）-α-苯甘氨酸（99%）、3，3′-二硝基對二氨基聯(lián)苯（DNB，96%）均購于北京伊諾凱科技有限公司；4-二甲氨基吡啶（DMAP，99%）購于美侖生物。

采用配有EC 2006型色譜工作站的230Ⅱ高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）進行色譜分離實驗；高壓勻漿裝柱機（深圳市正大流體機電設(shè)備有限公司）；SHZ－D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華有限責任公司）；利用D-max-3B X射線粉末衍射儀（PXRD，日本Rigaku公司）、Nicolet iS 10傅里葉紅外光譜儀（FT－IR，美國賽默飛世爾科技公司）、AVANCEIIIHD 400核磁共振波譜儀（德國Bruker公司）、Nova NanoSEM 450掃描電子顯微鏡（SEM，美國FEI公司）、Chirascan圓二色譜儀（CD，英國Applied Photophysics公司）對合成材料進行表征。

1.2 1，3，5-三甲醛間苯三酚（Tp）的制備

根據(jù)文獻合成Tp［18］。分別稱取6.014 g（49 mmol）無水間苯三酚（C6H6O3）、15.098 g（108 mmol）六亞甲基四胺（C6H12N4），將兩者充分混勻后加入到500 mL的三頸圓底燒瓶中，在N2保護下加入90 mL TFA，于100℃下回流加熱反應(yīng)3.5 h，直至溶液由黃色變?yōu)榧t褐色；隨后加入150 mL（0.3 mol/L）HCl反應(yīng)3 h，用適量DCM進行少量多次萃取，加入適量無水Na2SO4除水，旋干；最后用適量甲醇多次洗滌，干燥后得到粉紅色粉末產(chǎn)品。

1.3 TpBD-（NO2）2的制備

根據(jù) 文 獻［19］合成TpBD-（NO2）2。分別 稱取31.5 mg（0.3 mmol）Tp、61.7 mg（0.45 mmol）DNB、0.25 mL 1，3，5-三甲苯、0.25 mL 1，4-二氧六環(huán)和0.25 mL（3 mol/L）的乙酸水溶液于耐熱玻璃管中，混合超聲處理30 min后，將耐熱玻璃管在77 K液態(tài)N2浴中迅速冷凍，并連續(xù)3次通過冷凍－泵－解凍循環(huán)脫氣，將耐熱玻璃管密封，隨后將其在120℃溫度條件下加熱3 d。將得到的混合物過濾，收集得到暗紅色沉淀，以適量的丙酮、THF、DCM依次洗滌3次后，于180℃下真空干燥12 h，獲得TpBD-（NO2）2。

1.4 TpBD-（NO2）2還原為TpBD-（NH2）2

實驗前先將THF溶液除水。根據(jù)文獻［20］將稱取的2.52 g無水氯化亞錫置于5 mL THF中使其充分溶解，隨后加入150 mg TpBD-（NO2）2，并將三者的混合物于50℃下回流加熱攪拌3 h。反應(yīng)期間配制1 mol/L的HCl溶液備用，待反應(yīng)結(jié)束后將得到的產(chǎn)物離心并懸浮在10 mL配制好的HCl中。依次用70 mL HCl洗滌10次，一定量的去離子水洗滌3次，100 mL丙酮洗滌1次。將得到的紅棕色粉末重新懸浮于5 mL苯甲醚中后將其置于25 mL三頸圓底燒瓶中，將懸浮液在120℃下加熱24 h。最后，用100 mL丙酮洗滌、過濾，得到產(chǎn)物TpBD-（NH2）2。

1.5 TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸的制備

實驗前先將DCM除水。再分別稱取91 mgD-（－）-α-苯甘氨酸、300 mg PyBrOP，并量取5 mL DCM，將三者混合超聲2 min，混合均勻后在室溫下反應(yīng)約2 h，再加入50 mg TpBD-（NH2）2和156 mg DMAP反應(yīng)4 d。將得到的產(chǎn)物用100 mL水離心，洗去多余的D-（－）-α-苯甘氨酸后得到TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸手性產(chǎn)物。其合成路線如圖1所示。

圖1 TpBD-（NH2）2-D－（－）-α-苯甘氨酸的合成路線圖Fig.1 TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-phenylglycine synthesis roadmap

1.6 “網(wǎng)包法”制備高效液相色譜TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸固定相［21］

由于合成的TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸的粒徑過大且不均勻，不適合直接用來制備填充柱。故先將TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸粉末置于研缽中研磨14 d左右，再借助溶劑使其懸浮獲得較為合適的粒徑。實驗前備好除過水的三乙胺、正己烷、異丙醇3種溶液，稱取4.0 g硅膠并浸入含有100 mg TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸的50 mL（0.05 mol/L）1，3，5-苯三甲酰氯的正己烷溶液中，將混合物攪拌30 min，再除去過量的正己烷溶液。5 min后，將50 mL（0.46 mol/L）哌嗪的異丙醇水溶液（滴加2 mL無水三乙胺）輕輕倒在硅膠上，靜置30 min后排出水溶液，再將其置于110℃烘箱中熱處理15 min，得到TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸固定相。

1.7 TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸液相色譜柱的制備

準確稱取4.0 g已過篩（250目）的TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸于50 mL燒杯中，將其分散于40 mL正己烷－異丙醇（體積比9∶1）的混合液中，待懸浮均勻后快速倒入勻漿罐中，且以正己烷－異丙醇（體積比9∶1）混合液為頂替液，在35 MPa壓力下將懸浮液填充至一個空的色譜柱（250 mm×4.6 mm）中保持5 min，然后將壓力調(diào)至25 MPa，保持30 min，緩慢減至常壓后將其取下，得到TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸液相色譜柱。

2 結(jié)果與討論

2.1 TpBD-（NO2）2、TpBD-（NH2）2及TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸的表征

采用核磁共振氫譜（1H NMR）對合成的單體Tp進行表征：1H NMR（500 MHz，CDCl3）：10.18（s，3H），14.15（s，3H）。

由圖2A可知，TpBD-（NO2）2在3.5°和26°處顯示出主要衍射峰，分別對應(yīng)于（100）面和（001）面，該結(jié)果與AA堆疊排列的理論預(yù)測一致［11］。對比TpBD-（NO2）2、TpBD-（NH2）2以及衍生后所得的TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸3個COFs材料的XRD圖發(fā)現(xiàn)，經(jīng)D-（－）-α-苯甘氨酸衍生后，CCOFs的衍射峰強度略有減弱（圖2A曲線c），原因可能是修飾上去的D-（－）-α-苯甘氨酸手性基團對該多孔材料產(chǎn)生了影響。

圖2 TpBD-（NO2）2（a）、TpBD-（NH2）2（b）及TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸（c）的XRD圖（A）和FT－IR圖（B）Fig.2 XRD patterns（A）and FT－IR spectra（B）of TpBD-（NO2）2（a），TpBD-（NH2）2（b）and TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-phenylglycine（c）

考察了TpBD-（NO2）2、TpBD-（NH2）2以及TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸的FT－IR圖譜。可以明顯看出TpBD（NO2）2還原為TpBD-（NH2）2后，其硝基（—NO2）在1 511 cm-1處的特征伸縮振動吸收峰減弱，并在1 295 cm-1處出現(xiàn)了對應(yīng)于伯胺的C—N伸縮振動吸收峰，證明硝基已被成功還原為氨基。通過圖2B曲線c可知，經(jīng)D-（－）-α-苯甘氨酸手性修飾后的COFs在770 cm-1處的苯環(huán)伸縮振動吸收峰顯著增強，表明TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸成功合成。

考察了TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸的熱穩(wěn)定性，將其從25℃勻速升溫至800℃，所得熱重曲線見圖3。從圖3中可以看出，該材料在約300℃時方開始大量分解，說明TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸的熱穩(wěn)定性較好。

圖3 TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸的熱重曲線圖Fig.3 Thermogravimetric curve of TpBD-（NH2）2-D-（－）-αphenylglycine

由圖4可知，TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸具有明顯的科頓（Cotton）效應(yīng)，說明該物質(zhì)具有手性。

圖4 TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸的CD圖Fig.4 CD diagram of TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-phenylglycine

此外，通過觀察硅膠和“網(wǎng)包法”制備的TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸固定相的SEM圖（圖5），發(fā)現(xiàn)TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸包裹在硅膠表面，表明TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸材料通過“網(wǎng)包法”成功固載在硅膠表面。

圖5 硅膠（A）和“網(wǎng)包法”制備的TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸固定相（B）的SEM圖Fig.5 SEM images of silica gel（A）and TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-phenylglycine stationary phase prepared by“net-wrap”method（B）

為了測試TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸的孔徑和比表面積大小，對其進行氮氣吸附測試（圖6），得到TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸的比表面積為270 m2/g，孔體積為1.423 cm3/g；通過BJH分析得到該材料的孔徑大小為1.88 nm。

圖6 TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸的N2吸附－解吸附等溫曲線（A）及BJH孔尺寸分布曲線（B）Fig.6 N2 adsorption-desorption isothermal curve（A）and BJH hole size distribution（B）of TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-phenylglycine

2.2 TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱拆分手性化合物

為了檢測TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱對手性化合物的拆分性能。首先以正己烷－異丙醇（體積比9∶1）為流動相，在流速0.6 mL/min，檢測波長230、210 nm，柱溫25℃的條件下，用TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱對手性化合物進行拆分，其在檢測波長為230 nm時拆分得到1-（9-蒽基）-2，2，2-三氟乙醇、反-1，2-二苯環(huán)氧乙烷、1-苯乙醇；在檢測波長為210 nm時拆分得到2-戊醇、3-丁炔-2-醇、γ-戊內(nèi)酯、2-氯丙酸、氧化苯乙烯、2-氯環(huán)己酮、異丙基縮水甘油醚。其次，以甲醇－水（體積比9∶1）為流動相，在流速0.6 mL/min，檢測波長205 nm，柱溫25℃條件下，用TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱對手性化合物進行拆分，得到DL-絲氨酸、DL-蘇氨酸、DL-纈氨酸。拆分結(jié)果如表1所示。

表1 TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱對13種手性化合物的拆分結(jié)果Table 1 Separation results of 13 chiral compounds on TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-phenylglycine column

從分離結(jié)果可以看出，TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱對1-（9-蒽基）-2，2，2-三氟乙醇、反-1，2-二苯環(huán)氧乙烷、1-苯乙醇、3-丁炔-2-醇、γ-戊內(nèi)酯、2-氯丙酸、DL-絲氨酸7種手性化合物達到了基線分離。而2-戊醇、氧化苯乙烯、2-氯環(huán)己酮、異丙基縮水甘油醚、DL-蘇氨酸、DL-纈氨酸6種手性化合物得到了不同程度的分離。圖7為TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱對上述13種手性化合物的拆分譜圖。

圖7 TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱對13種手性化合物的拆分譜圖Fig.7 HPLC chromatograms on TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-phenylglycine column for the separation of 13 chiral compounds A－M were the same as those in Table 1

TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸手性填充柱對手性化合物的拆分能力可能來自COFs材料中規(guī)整的手性通道［22］。由于每個COFs分子都是手性的，且有一個可通達的空腔，使得分析物可以進入空腔并進行主客體包合，這在手性分離中起著重要作用。此外，CSP和手性物質(zhì)之間的其他相互作用力也可能對分離過程產(chǎn)生一定的影響。

2.3 TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱拆分苯系位置異構(gòu)體

為了檢測TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱對苯系位置異構(gòu)體的拆分性能，以正己烷－異丙醇（體積比9∶1）為流動相，在流速0.6 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫為25℃的條件下，用TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱成功拆分了o，m，p-碘苯胺、o，m，p-氯苯胺、o，m，p-硝基苯酚、o，m，p-溴苯胺、o，m，p-溴硝基苯5種苯系位置異構(gòu)體。以上各苯系位置異構(gòu)體的拆分結(jié)果見表2，圖8為其拆分譜圖。

圖8 TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱對5種苯系位置異構(gòu)體的拆分譜圖Fig.8 HPLC chromatograms on TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-phenylglycine column for the separation of 5 benzene positional isomers

表2 TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱對5種苯系位置異構(gòu)體的拆分結(jié)果Table 2 Separation results of 5 benzene positional isomers on TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-phenylglycine column

TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱對苯系位置異構(gòu)體的拆分，可能是由于誘導(dǎo)力、色散力、偶極之間的相互作用，以及包結(jié)作用等的共同作用，而對于某一系列的位置異構(gòu)體拆分來說，起決定作用的可能是其中的某種作用力。此外，苯系位置異構(gòu)體由于各個基團所處的位置不同，且鄰位、間位和對位分子之間的體積與長寬比也不一樣，因此在TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸固定相上的受力有所差別，導(dǎo)致其在TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱上的保留時間各不相同，從而可得到一定程度的分離。

2.4 TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱的重復(fù)性評價

為探究TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱的重復(fù)性，以正己烷－異丙醇（體積比9∶1）為流動相，選用2-氯環(huán)己酮作為測試物，連續(xù)5次進樣，其保留時間的相對標準偏差（RSD）為0.53%，峰面積的RSD為1.1%。結(jié)果表明TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱具有較好的重復(fù)性。

3 結(jié)論

本文采用溶劑熱法合成了一種熱穩(wěn)定性較高的功能化CCOFs材料—TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸，并采用“網(wǎng)包法”制備了TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸手性固定相，將其用于制備HPLC手性柱，并對其手性拆分能力進行了考察。實驗結(jié)果表明，TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸色譜柱可拆分13種手性化合物和5種苯系位置異構(gòu)體，其中對反-1，2-二苯環(huán)氧乙烷、1-（9-蒽基）-2，2，2-三氟乙醇、1-苯乙醇、3-丁炔-2-醇、γ-戊內(nèi)酯、2-氯丙酸、DL-絲氨酸7種手性化合物達到了基線分離。因此，TpBD-（NH2）2-D-（－）-α-苯甘氨酸作為新型CSP具有較大的應(yīng)用潛力。