益氣活血方對(duì)腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬突觸可塑性的影響*

李佩佩，時(shí) 瀟，王 瑞，王又聞，王麗娜，胡建鵬△

（1安徽中醫(yī)藥大學(xué)新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安微 合肥 230012；2安徽中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，安微 合肥 230012；3上海中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，上海 201203）

缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）是致死率、致殘率極高的腦血管疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)，有接近65%左右幸存的患者伴有不同程度的神經(jīng)功能障礙，嚴(yán)重影響到患者的生存質(zhì)量［1-3］。目前，最有效的治療方法是快速恢復(fù)血液供應(yīng)，但血管再通引起的腦缺血再灌注損傷（reperfusion injury，RI）可進(jìn)一步加重腦損傷和神經(jīng)功能障礙［4］。研究證實(shí)［5］，腦缺血后引起學(xué)習(xí)和記憶等神經(jīng)功能障礙與神經(jīng)元丟失、突觸數(shù)量及結(jié)構(gòu)完整性密切相關(guān)，如何激活并誘導(dǎo)神經(jīng)元突觸可塑性的修復(fù)機(jī)制，是當(dāng)前神經(jīng)功能恢復(fù)研究的重點(diǎn)問(wèn)題。

中醫(yī)藥對(duì)于腦卒中有良好的治療和預(yù)防作用，可通過(guò)改善神經(jīng)元微環(huán)境，誘導(dǎo)突觸的結(jié)構(gòu)和功能再建，發(fā)揮神經(jīng)功能保護(hù)的作用［6-7］。益氣活血方（Yiqi-Huoxue decoction，YQHXD；腦絡(luò)欣通）是基于“氣血-腦髓”相關(guān)理論對(duì)缺血性中風(fēng)進(jìn)行辨證施治的特色方劑，我們的前期研究證實(shí)該方具有抗炎、抗氧化、保護(hù)血腦屏障和促進(jìn)血管新生等多種藥理作用［8-11］，但對(duì)改善學(xué)習(xí)記憶功能以及突觸可塑性變化的研究較少。突觸可塑性相關(guān)蛋白是突觸可塑性的物質(zhì)基礎(chǔ)［12］，突觸小泡蛋白（synaptophysin，SYN）和突觸后致密物95（postsynaptic density 95，PSD95）分別參與了突觸前和突觸后的重塑、傳遞過(guò)程，是突觸重建的重要標(biāo)志物［13］。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brainderived neurotrophic factor，BDNF）是神經(jīng)系統(tǒng)中分布最多的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，可通過(guò)調(diào)節(jié)下游不同信號(hào)級(jí)聯(lián)分子調(diào)控大腦不同區(qū)域的突觸結(jié)構(gòu)和功能，并認(rèn)為與學(xué)習(xí)和記憶有關(guān)，對(duì)腦缺血損傷組織發(fā)揮著內(nèi)源性保護(hù)作用［14］。本研究通過(guò)益氣活血方干預(yù)大腦中動(dòng)脈阻塞再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）模型大鼠，觀察海馬區(qū)突觸數(shù)目、形態(tài)結(jié)構(gòu)和突觸可塑性相關(guān)蛋白BDNF、SYN和PSD95的變化，旨在探討益氣活血方對(duì)腦缺血RI大鼠學(xué)習(xí)記憶功能和突觸可塑性的影響，以期為臨床益氣活血方治療IS提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，9～10周齡，體質(zhì)量280～320 g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（皖）2017-001。飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，康為IR60獨(dú)立送風(fēng)隔離飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度（22±1）℃、相對(duì)濕度（45±5）%，光暗周期12 h。大鼠分籠喂養(yǎng)，自由攝食飲水。實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)均嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)定及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理規(guī)范（動(dòng)物倫理編號(hào)：AHUCM-rats-2022028）。

1.2 藥物腦絡(luò)欣通濃縮液由黃芪、川芎、三七、當(dāng)歸、紅花、天麻和蜈蚣組成，飲片購(gòu)自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)專家鑒定。煎煮方式［15］：將所有藥材放入砂罐中，量筒量取8倍純凈水（640 mL），浸泡約30 min；然后加熱煮沸10 min，轉(zhuǎn)小火熬煮1 h，過(guò)濾得到藥渣與煎出液；繼續(xù)向砂罐中加入6.4倍純凈水（512 mL），加熱煮沸后保持小火微沸1 h，過(guò)濾合并兩次煎煮液，經(jīng)布氏漏斗過(guò)濾，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮至1 mL（含生藥1.08 g），于4℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器主要試劑：戊巴比妥鈉鹽（Sigma）；戊二醛（Ted Pella）；環(huán)氧丙烷（上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司）；抗PSD95、SYN和BDNF抗體（Affinity）；GAPDH抗體（杭州賢至生物有限公司）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗（武漢博士德生物工程有限公司）；RIPA裂解液和BCA試劑盒（碧云天生物科技有限公司）。主要儀器：激光多普勒儀（PeriFlux5001）；Morris水迷宮和圖像自動(dòng)采集分析系統(tǒng)（Videomot2，TSE systems GmbH Bad Homburg）；BT100-2J型蠕動(dòng)泵驅(qū)動(dòng)器（保定蘭格恒流泵有限公司）；TB-718生物組織自動(dòng)包埋機(jī)（泰維電子設(shè)備有限 公 司）；CM1900超薄切片機(jī)（Leica）；JEM-1400Flash透射電鏡（日本電子株式會(huì)社）；BX-51光學(xué)顯微鏡（Olympus）。

2 方法

2.1 大鼠MCAO/R模型的制備及判定大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后禁食12 h，自由飲水。0.3%戊巴比妥鈉溶液（10 mL/kg）腹腔注射麻醉動(dòng)物，參照Longa法［16］并加以改良制備大鼠右側(cè)MCAO/R模型。手術(shù)過(guò)程中全程采用激光多普勒儀監(jiān)測(cè)大鼠缺血區(qū)（顱骨冠狀線后方1 mm，矢狀線右側(cè)5 mm交匯處）血流量，見(jiàn)圖1。插入線栓后血流量下降約70%以上，阻斷2 h后，緩慢拔出線栓約5 mm，恢復(fù)至初始血流量的60%～70%，視為模型制備成功［17］。假手術(shù)組大鼠僅分離血管，不插入線栓。術(shù)中室溫保持在24～25℃，并用保溫墊保持大鼠體溫恒定在37℃。

Figure 1.The regional cerebral blood flow（rCBF）traces were recorded by laser Doppler flowmetry during the MCAO/R procedure.圖1大鼠手術(shù)過(guò)程激光多普勒儀監(jiān)測(cè)缺血側(cè)血流量

2.2 動(dòng)物分組及給藥實(shí)驗(yàn)大鼠編號(hào)、稱重、隨機(jī)分為假手術(shù)（sham）組、缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）組和YQHXD低、中、高劑量組（low-，medium-and high-dose YQHXD，YQHXD-low，-medium and-high）組，每組12只。YQHXD生藥共80 g，參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》［18］中人與大鼠體表面積折算值計(jì)算等效劑量，低、中、高劑量分別為4.2、8.4和16.8 g·kg-1·d-1，分別于造模后每天上午9：00及下午4：00各灌胃1次。sham組和I/R組以等體積生理鹽水采用相同方法、時(shí)間灌胃，治療持續(xù)14 d。

2.3 神經(jīng)功能缺損評(píng)分參照Z(yǔ)ea Longa標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分法［16］對(duì)術(shù)后3、7和14 d模型大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，具體內(nèi)容：0分：無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)功能缺失癥狀；1分：不能完全伸展對(duì)側(cè)前肢；2分：爬行時(shí)向損傷對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：爬行時(shí)身體向損傷對(duì)側(cè)傾倒；4分：意識(shí)喪失，不能自主行走者。得分越高，神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

2.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)治療結(jié)束后采用Morris水迷宮評(píng)估大鼠學(xué)習(xí)與記憶功能，整個(gè)實(shí)驗(yàn)分為定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。（1）定位航行實(shí)驗(yàn)：進(jìn)行連續(xù)5 d的訓(xùn)練，每天于同一時(shí)間接受4次訓(xùn)練，每次訓(xùn)練間隔15 min。由工作人員將大鼠依次順時(shí)針從水池4個(gè)象限面向池壁輕輕放入水中，測(cè)試時(shí)間設(shè)為60 s，觀察并記錄大鼠在測(cè)試規(guī)定時(shí)間內(nèi)找到目標(biāo)平臺(tái)所需的時(shí)間，即逃避潛伏期（escape latency）。訓(xùn)練過(guò)程中，若大鼠在60 s內(nèi)未能找到平臺(tái)，則用棒將其牽引至目標(biāo)平臺(tái)，使其停留15 s，則將此次潛伏期記錄為60 s，再進(jìn)行下一次實(shí)驗(yàn)。大鼠學(xué)習(xí)能力用第5天大鼠4次潛伏期均值判定。（2）空間探索實(shí)驗(yàn)：空間探索實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)最后1 d進(jìn)行。撤除安全平臺(tái)，將平臺(tái)對(duì)角象限設(shè)為入水點(diǎn)，通過(guò)自由攝像系統(tǒng)記錄大鼠60 s內(nèi)游泳軌跡以及大鼠在60 s內(nèi)穿越原平臺(tái)所在區(qū)域的次數(shù)等作為測(cè)定大鼠空間定位能力的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行雙盲操作。

2.5 HE染色及光鏡觀察灌胃兩周結(jié)束后各組隨機(jī)取4只大鼠，0.3%戊巴比妥鈉溶液麻醉后，剪開(kāi)大鼠胸腔暴露心臟，將灌注針經(jīng)心臟左心室插入主動(dòng)脈并固定，快速注入0.9%生理鹽水，同時(shí)用眼科剪剪破右心耳，待右心房流出清亮液體，換成預(yù)冷的4%多聚甲醛溶液緩緩灌注200～250 mL，直至肝臟和肺臟均變?yōu)榘咨_(kāi)顱取腦組織用甲醛固定液浸泡2～3 d后進(jìn)行包埋、切片、脫臘，常規(guī)HE染色，封片后置于光學(xué)顯微鏡下觀察缺血側(cè)海馬CA1區(qū)及齒狀回（dentate gyrus，DG）病理改變。

2.6 電鏡觀察突觸超微結(jié)構(gòu)的變化治療結(jié)束后，各組隨機(jī)選取5只大鼠進(jìn)行心臟灌注，步驟方法2.5，灌注結(jié)束后取大鼠腦缺血區(qū)海馬組織約1 mm×1 mm×1 mm放入2.5%戊二醛進(jìn)行固定，再經(jīng)PBS清洗、鋨酸固定、梯度脫水、包埋、加熱聚合、切片、醋酸鈾及硝酸鉛染色等過(guò)程制得樣本，用透射電鏡觀察照相，每張銅網(wǎng)由左上角至右下角斜線上下移動(dòng)，連續(xù)拍攝10張圖片，底片放大5萬(wàn)倍印相。參照Bertoni-Freddari等［19］方格點(diǎn)計(jì)數(shù)法、Güldner等［20］多點(diǎn)平均法以及Nano Measurer圖片分析軟件計(jì)算突觸的數(shù)密度（numerical density）和突觸后致密物（postsynaptic density，PSD）厚度（nm）。

2.7 Western blot檢測(cè)SYN、PSD95和BDNF的蛋白表達(dá)治療結(jié)束后，各組剩余大鼠行深度麻醉后迅速于冰上斷頭取腦，立即剝離出病灶側(cè)海馬組織置于2 mL EP管中裂解并進(jìn)行蛋白濃度定量，水浴蛋白變性后制備12%分離膠及5%濃縮膠，取等量20 μg（10 μL）蛋白上樣，先后采用恒壓80 V、120 V進(jìn)行電泳，此過(guò)程需1.5 h，電泳分離后PVDF轉(zhuǎn)膜（200 mA穩(wěn)流轉(zhuǎn)移2 h）；5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉2 h，然后分別與Ⅰ抗［SYN（1∶1 000），PSD95（1∶1 000），BDNF（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000）］在4℃下孵育過(guò)夜；次日TBST充分洗膜后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶50 000），室溫?fù)u床孵育2 h；用ECL化學(xué)發(fā)光液顯影后觀察，用IPP軟件定量分析膠片灰度值，以與GAPDH灰度值比值作為蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差不齊采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較

與sham組比較，I/R組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著升高（P＜0.01），YQHXD各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分均較I/R組大鼠降低，以YQHXD-medium組在給藥3和14 d后改善神經(jīng)功能最為顯著（P＜0.05），其他組無(wú)顯著差異；給藥3、7和14 d各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分逐漸降低，且不同劑量組用藥14 d行為學(xué)評(píng)分均顯著優(yōu)于3 d（P＜0.05），但用藥7 d與14 d的差異無(wú)顯著性，見(jiàn)表1。

表1 YQHXD對(duì)各組大鼠不同時(shí)間神經(jīng)功能缺損的影響Table 1.Effects of YQHXD on neurological deficits in different groups of rats at different time points（Mean±SD.n=12）

2 水迷宮測(cè)試結(jié)果

2.1 各組大鼠逃避潛伏期結(jié)果由圖2B可知，隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長(zhǎng)，每組大鼠的逃避潛伏期時(shí)間均縮短，提示各組大鼠均有一定的學(xué)習(xí)能力。由表2可知，第5天時(shí)，與sham組相比，I/R組的平均潛伏期顯著延長(zhǎng)（P＜0.01）；與I/R組相比，YQHXD不同劑量組的平均潛伏期時(shí)間均顯著降低（P＜0.01），但各劑量組之間差異不顯著（P＞0.05），結(jié)果未呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。

2.2 各組大鼠定位巡航實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表2可知，與sham組比較，I/R組穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少（P＜0.05）；與I/R組比較，YQHXD不同劑量組的穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加，其中YQHXD-high和YQHXD-medium組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），各劑量組之間差異不顯著。

表2 YQHXD對(duì)各組大鼠水迷宮行為學(xué)的影響Table 2.Effects of YQHXD on the behavior of water maze of rats in each group（Mean±SD.n=5）

3 各組大鼠缺血側(cè)海馬組織病理學(xué)改變

如圖3可見(jiàn)各組大鼠腦組織海馬CA1區(qū)及DG區(qū)病理情況改變，結(jié)果顯示sham組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層及DG區(qū)顆粒細(xì)胞層結(jié)構(gòu)致密，排列整齊，細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞數(shù)量多，染色正常，分布均勻，未見(jiàn)明顯壞死或變性的神經(jīng)元；I/R組CA1區(qū)及DG區(qū)可見(jiàn)明顯壞死部分，細(xì)胞形態(tài)異常，細(xì)胞體積縮小，結(jié)構(gòu)疏松、排列紊亂，同時(shí)存在細(xì)胞核固縮深染；與I/R組相比，YQHXD-low組大鼠海馬病理?yè)p傷有所改善，以CA1區(qū)改善較為明顯，但DG區(qū)細(xì)胞排列較紊亂、部分細(xì)胞核仍存在固縮深染；與I/R組及YQHXD-low組相比，YQHXD-medium和YQHXD-high組可見(jiàn)缺血區(qū)海馬組織CA1區(qū)及DG區(qū)病理程度明顯減輕，細(xì)胞形態(tài)明顯改善，結(jié)構(gòu)排列較為整齊，細(xì)胞深染和皺縮情況也較少。

4 各組大鼠缺血側(cè)海馬突觸超微結(jié)構(gòu)變化

Figure 2.YQHXD attenuated the cognitive learning dysfunction induced by I/R in rats.A：rat swimming track map in water maze；B：escape latency of all rats for 5 consecutive days.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs I/R group.圖2各組大鼠水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)電鏡觀察可見(jiàn)sham組突觸數(shù)量較多，突觸前后膜結(jié)構(gòu)清晰、輪廓完整，突觸前區(qū)可見(jiàn)分布均勻圓形大小的突觸小泡、數(shù)目較多，突觸后膜致密帶豐富，在突觸前后區(qū)可見(jiàn)豐富的線粒體；與sham組相比，I/R組突觸前后膜模糊不清，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)散亂，前膜小泡分布散亂稀疏，線粒體腫脹、嵴變短、部分崩解，伴有巨大空泡樣，突觸數(shù)密度顯著減少（P＜0.01），PSD厚度也顯著變?。≒＜0.01）；與I/R組相比，YQHXD-medium和YQHXD-high組治療14 d后，突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)改善明顯，突觸間隙變寬、前后膜結(jié)構(gòu)較清晰完整，前膜內(nèi)囊泡數(shù)量增多，突觸數(shù)密度顯著增多（P＜0.05或P＜0.01），PSD厚度顯著增厚（P＜0.05或P＜0.01）；YQHXD-low組突觸超微結(jié)構(gòu)較I/R組有所改善，突觸數(shù)密度增多，PSD厚度增厚，但與I/R組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；與sham組相比，治療組仍伴有少量突觸結(jié)構(gòu)不清晰和少量空泡樣。見(jiàn)圖4、5。

5 YQHXD對(duì)大鼠缺血側(cè)海馬組織SYN、PSD95和BDNF蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果見(jiàn)圖6。與sham組比較，I/R組大鼠海馬組織中SYN、PSD95和BDNF蛋白的表達(dá)量均顯著下降（P＜0.01）；與I/R組比較，給藥14 d后，YQHXD-high組海馬中SYN和PSD95蛋白表達(dá)量顯著上升（P＜0.01），BDNF蛋白表達(dá)量升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；YQHXD-low和YQHXD-medium組各蛋白表達(dá)量上升，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

討 論

隨著世界老齡化進(jìn)程的不斷加快，缺血性腦卒中的發(fā)病率越來(lái)越高，已成為人們致死致殘的主要因素，并常伴發(fā)不同程度的學(xué)習(xí)和記憶等神經(jīng)功能障礙，給患者帶來(lái)巨大的痛苦。目前認(rèn)為，腦缺血引起皮層、海馬和紋狀體等缺血敏感區(qū)域的神經(jīng)元變性壞死，影響到神經(jīng)環(huán)路之間的信息傳遞，是腦缺血大鼠記憶和學(xué)習(xí)等能力下降的主要原因［21］。突觸是神經(jīng)元與效應(yīng)細(xì)胞之間接觸并傳導(dǎo)信息的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，突觸數(shù)量及結(jié)構(gòu)的完整性對(duì)保證神經(jīng)元獲得、加工、貯存及傳遞信息起著關(guān)鍵的作用［22］。在環(huán)境受損時(shí)，突觸具有發(fā)生形態(tài)結(jié)構(gòu)與傳遞效能變化的能力，即突觸可塑性，是學(xué)習(xí)記憶的生物學(xué)基礎(chǔ)。研究證實(shí)，增強(qiáng)腦缺血大鼠神經(jīng)元的突觸可塑性可以促進(jìn)神經(jīng)功能重建，減輕學(xué)習(xí)記憶障礙及肢體運(yùn)動(dòng)障礙［23-24］。

中醫(yī)認(rèn)為腦為髓海、為元神之府，氣血是腦髓充足、腦神充養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)；中風(fēng)誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡以及神經(jīng)回路破壞，導(dǎo)致感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)或高級(jí)腦功能受損，出現(xiàn)一系列神機(jī)失用的病理變化，其修復(fù)依賴于氣血的充足。基于“腦髓-氣血”理論創(chuàng)制的益氣活血方（腦絡(luò)欣通）在臨床廣泛應(yīng)用于中風(fēng)的辨治，方中黃芪功專補(bǔ)氣，使氣旺活血生血；當(dāng)歸補(bǔ)血活血，使祛瘀而不傷正；川芎、三七、紅花共奏行氣活血通絡(luò)之功；天麻、蜈蚣熄風(fēng)通經(jīng)活絡(luò)，使血行脈通則藥達(dá)腦髓。前期研究結(jié)果表明，YQHXD對(duì)缺血性腦損傷的恢復(fù)起著積極的作用，對(duì)減輕神經(jīng)功能缺損也有良好的療效［25-26］。在本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果中，模型大鼠均呈現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損和學(xué)習(xí)記憶功能障礙，經(jīng)過(guò)不同劑量YQHXD的治療后，MCAO/R大鼠神經(jīng)功能缺損情況得到改善，模型大鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期顯著縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)增加，證實(shí)了YQHXD對(duì)腦缺血/IR大鼠神經(jīng)功能損傷的治療作用，亦能提高模型大鼠的空間記憶與學(xué)習(xí)能力。

Figure 3.The changes of hippocampal structure in rats on day 14 after MCAO/R.A：CA1 area；B：DG area.The scale bar=100 μm.圖3 HE染色比較各組大鼠海馬組織CA1區(qū)和DG區(qū)病理形態(tài)

Figure 4.Transmission electron microscopy results of rat hippocampal synapse morphology and structure in each group 14 d after MCAO/R.The scale bars=200 nm.圖4各組突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)電鏡結(jié)果

Figure 5.The results of quantitative analysis of synapses in the hippocampus of rats in each group.A：numerical density of synapses in rats cerebral ischemic hippocampus area in different groups；B：the thickness of postsynaptic density（PSD）in the rats of each group.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs I/R group.圖5各組大鼠海馬突觸數(shù)密度及突觸后致密物厚度分析結(jié)果

Figure 6.Relative protein levels of SYN，PSD95 and BDNF in the hippocampus of rats 14 d after MCAO/R.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs I/R group.圖6各組大鼠海馬組織SYN、PSD95和BDNF蛋白水平

海馬是參與學(xué)習(xí)記憶等神經(jīng)活動(dòng)的重要腦區(qū)，缺血損傷大鼠海馬區(qū)會(huì)發(fā)生神經(jīng)元遲發(fā)型變性壞死、數(shù)量減少和胞體萎縮等病理改變，以及突觸結(jié)構(gòu)完整性破壞與數(shù)量密度減少等反應(yīng)［27-29］。我們?cè)贖E染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到缺血后海馬CA1區(qū)及DG區(qū)均出現(xiàn)不同程度的病理?yè)p傷，包括錐體細(xì)胞及顆粒細(xì)胞數(shù)量減少、結(jié)構(gòu)排列紊亂、水腫及細(xì)胞核固縮深染等；YQHXD不同劑量治療14 d后，海馬CA1區(qū)及DG區(qū)細(xì)胞排列逐漸整齊，核皺縮深染等組織病理改變有所減輕，提示YQHXD可以減輕海馬區(qū)病理改變，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)的可塑性是功能可塑性的物質(zhì)基礎(chǔ)，其表現(xiàn)包括新突觸形成，突觸前后膜、PSD厚度及突觸囊泡的變化等［13］。突觸數(shù)密度表示單位體積內(nèi)突觸的數(shù)量，單位體積內(nèi)數(shù)密度越大，突觸數(shù)量越多；PSD是突觸后膜胞質(zhì)面的一層均勻致密物，包含有多種蛋白質(zhì)，二者均是突觸可塑性形態(tài)學(xué)定量資料的可靠參數(shù)［30］。電鏡結(jié)果顯示，與sham組相比，I/R組突觸結(jié)構(gòu)破壞，前后膜模糊不清，突觸小泡數(shù)量稀疏，突觸數(shù)密度和PSD厚度顯著減少；用藥14 d后，YQHXD-medium、high組明顯改善突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)，突觸前后膜結(jié)構(gòu)較清晰完整，前膜內(nèi)囊泡分布較密集均勻，突觸數(shù)密度和PSD厚度也顯著增多；YQHXD-low組突觸超微結(jié)構(gòu)有所改善，突觸數(shù)密度增多，PSD厚度增厚，但與I/R組及YQHXD-medium、high組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此結(jié)果說(shuō)明YQHXD可修復(fù)腦組織海馬區(qū)突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)，增加突觸數(shù)目和PSD厚度，從而提高大腦神經(jīng)元的突觸可塑性。

SYN是分布在突觸前囊泡膜上主要的鈣結(jié)合酸性糖蛋白，與神經(jīng)遞質(zhì)的包裝、儲(chǔ)存、調(diào)節(jié)及釋放密切聯(lián)系，其密度和分布可間接反映突觸數(shù)量和分布情況；PSD95是PSD上的腳手架蛋白，可以通過(guò)不同結(jié)構(gòu)域募集NMDA受體及其下游多種特異的信號(hào)分子維系突觸的連接狀態(tài)，同時(shí)對(duì)突觸后興奮性信號(hào)進(jìn)行整合，與突觸重塑密切相關(guān)［13］。大量研究發(fā)現(xiàn)［31-32］，腦缺血導(dǎo)致SYN和PSD95蛋白表達(dá)顯著下降，通過(guò)藥物及針刺等干預(yù)，可上調(diào)SYN和PSD95水平，促進(jìn)腦缺血后突觸可塑性。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可以調(diào)控學(xué)習(xí)記憶以及神經(jīng)元生存的相關(guān)蛋白表達(dá)，參與到中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸可塑性的調(diào)節(jié)［33］。有實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明BDNF-/-小鼠海馬CA1區(qū)突觸數(shù)量大量減少，對(duì)學(xué)習(xí)和記憶功能產(chǎn)生影響［34-35］。此外，還有研究表明海馬BDNF的水平提高可以促進(jìn)SYN和PSD95表達(dá)，從而調(diào)節(jié)突觸可塑性。我們的研究結(jié)果顯示，I/R組大鼠缺血缺氧再灌注14 d后BDNF、SYN和PSD95蛋白表達(dá)較sham組顯著降低；經(jīng)YQHXD不同劑量組治療后，BDNF、SYN和PSD95蛋白水平呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；與I/R組相比，YQHXD-high組海馬中SYN和PSD95蛋白表達(dá)量顯著增多；BDNF蛋白表達(dá)量升高，無(wú)顯著差異。同時(shí)，突觸相關(guān)蛋白SYN和PSD95的表達(dá)與BDNF保持一致的變化，結(jié)合既往研究結(jié)果推測(cè)YQHXD可能通過(guò)上調(diào)BDNF的表達(dá)，促進(jìn)SYN和PSD95的表達(dá)。雖然研究結(jié)果表明YQHXD-medium和YQHXD-high組BDNF蛋 白 水平高于低劑量組，但三組均低于sham組，說(shuō)明YQHXD干預(yù)14 d能增加模型大鼠內(nèi)源性營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)，但恢復(fù)不到正常水平。

綜上所述，益氣活血方可提高M(jìn)CAO/R模型大鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力，減輕海馬區(qū)神經(jīng)元病理?yè)p傷，修復(fù)突觸超微結(jié)構(gòu)，提高突觸數(shù)密度和PSD厚度，降低神經(jīng)功能缺損評(píng)分，其機(jī)制可能與促進(jìn)海馬區(qū)BDNF、SYN和PSD95突觸蛋白表達(dá)、提高神經(jīng)元突觸可塑性有關(guān)。本研究通過(guò)動(dòng)物模型為YQHXD從內(nèi)源性保護(hù)途徑治療IS提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，未來(lái)可從神經(jīng)可塑性調(diào)控通路方面做進(jìn)一步探索。