FAD通過(guò)激活SCAD抑制tBHP誘導(dǎo)的大鼠H9C2心肌細(xì)胞凋亡*

陳春雨，秦 學(xué)，馬智超，徐慶萍，彭 歡，周四桂△

（1廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床藥學(xué)重點(diǎn)?？?，廣東 廣州 510699）

心臟的主要收縮細(xì)胞是心肌細(xì)胞，占據(jù)心臟質(zhì)量的85%［1］。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在各種病理或者生理因素刺激下主動(dòng)結(jié)束細(xì)胞生命的一種特殊自主而有序的死亡方式，又稱程序性死亡，對(duì)維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要意義［2］。心肌細(xì)胞凋亡是心臟代償期向失代償期轉(zhuǎn)變的重要原因，在失代償期，由于心肌細(xì)胞的不斷丟失，而心肌細(xì)胞增殖能力有限，心肌細(xì)胞丟失所造成的影響不能通過(guò)細(xì)胞的有效增殖來(lái)彌補(bǔ)，導(dǎo)致心肌收縮功能受損，心收縮力下降，最終引起心力衰竭［3］。

線粒體氧化磷酸化和糖酵解是心臟產(chǎn)生ATP供能的兩個(gè)主要途徑［4］。在病理性心肌重塑期間，心肌能量代謝主要方式由脂肪酸β氧化轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒猓?］，從而維持心肌供能。短鏈?；o酶A脫氫酶（short-chain acyl-CoA dehydrogenase，SCAD）是脂肪酸β氧化的關(guān)鍵酶，在FAD的作用下可催化線粒體脂肪酸脫氫反應(yīng)［5］。我們的前期研究顯示，SCAD在慢性心力衰竭、急性心肌梗死后心力衰竭、心肌細(xì)胞凋亡模型中表達(dá)均顯著下調(diào)［6-8］。SCAD重組腺病毒對(duì)心力衰竭大鼠具有保護(hù)作用［9］。黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）作為SCAD的潛在穩(wěn)定劑，能夠增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性［10］。FAD作為SCAD的輔助因子，不僅參與氧化還原過(guò)程，還參與核苷酸形成，tRNA甲基化以及蛋白質(zhì)折疊［11］。我們的前期研究顯示，F(xiàn)AD能夠激活心臟SCAD表達(dá)，抑制自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚和纖維化［12］。然而，F(xiàn)AD是否能夠通過(guò)激活SCAD，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡，尚不清楚。本項(xiàng)工作采用叔丁基過(guò)氧化氫（tert-butyl hydroperoxide，tBHP）構(gòu)建心肌細(xì)胞凋亡模型，探究FAD對(duì)H9C2心肌細(xì)胞凋亡的影響。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

大鼠心肌細(xì)胞系H9C2購(gòu)于上海生命科學(xué)研究院。

2 主要試劑

BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于Thermo Fisher Scientific；SCAD酶活性試劑盒購(gòu)于上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；多克隆兔抗Bcl-2、Bax、SCAD、cleaved caspase-3、pro-caspase-3和單克隆鼠抗GAPDH購(gòu)于Proteintech；tBHP和FAD購(gòu)于Sigma；ATP試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司；游離脂肪酸試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

3 主要方法

3.1 tBHP處理H9C2心肌細(xì)胞迅速取出低溫保存的大鼠H9C2心肌細(xì)胞，置于37℃水浴鍋快速搖晃使其融化，將細(xì)胞液吸至含有9 mL完全培養(yǎng)液的離心管中，重懸后離心棄上清，加入3 mL含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液，吹散細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，細(xì)胞饑餓處理24 h，加入不同濃度的tBHP處理相同的時(shí)間或加入相同濃度的tBHP處理不同時(shí)間，以研究tBHP誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的量效和時(shí)效關(guān)系。

3.2 FAD預(yù)處理實(shí)驗(yàn)分組為：對(duì)照（control，Con）組、tBHP組、FAD組和tBHP+FAD組。H9C2細(xì)胞傳代隔天后，F(xiàn)AD組和tBHP+FAD組吸走含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液，PBS漂洗細(xì)胞后加入含有FAD（10 μmol/L）［12］的培養(yǎng)液，Con組和tBHP組同樣操作后加入等體積不含F(xiàn)BS的高糖DMEM，24 h后，tBHP組和tBHP+FAD組加入tBHP（200 μmol/L）溶液處理6 h。

3.3 心肌細(xì)胞活力測(cè)定用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，按照每孔1×104個(gè)細(xì)胞濃度，將90 μL細(xì)胞懸液種植于96孔板中，設(shè)置空白組，細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后給藥組給予相應(yīng)的藥物，作用終止后吸去原有培養(yǎng)液，PBS漂洗2次后每孔加入10 μL CCK-8稀釋液，37℃孵育4 h后，于450 nm下測(cè)量吸光度（A）。

3.4 SCAD酶活性檢測(cè)各組細(xì)胞給予相應(yīng)藥物處理后，加入RIPA裂解液后，收集心肌細(xì)胞并于冰上裂解15 min，離心后取少量上清液用BCA試劑盒在波長(zhǎng)570 nm處檢測(cè)樣品A值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞蛋白濃度。按照VReagentC∶VReagentD∶VReagentE∶VReagentF=78∶10∶5∶5的比例于遮光處配制反應(yīng)體系，以每孔100 μL加入酶活性板，置于酶標(biāo)儀孵育20 min后加入20 μL的樣品，于660 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)樣品A值，計(jì)算各組細(xì)胞SCAD酶活性。

3.5 細(xì)胞游離脂肪酸含量檢測(cè)參照文獻(xiàn)中的方法［13］，游離脂肪酸與銅離子結(jié)合形成的脂肪酸鹽溶于氯仿，其含量與銅離子含量成正比，通過(guò)檢測(cè)銅離子即可檢測(cè)游離脂肪酸含量。各組細(xì)胞給予相應(yīng)的藥物處理，作用終止后收集心肌細(xì)胞，測(cè)定蛋白濃度。在波長(zhǎng)440 nm下通過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)胞的A值。按照游離脂肪酸試劑盒說(shuō)明書公式計(jì)算出各組別游離脂肪酸含量。

3.6 ATP含量檢測(cè)嚴(yán)格按照ATP檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書把ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛忍荻?，按照VATP檢測(cè)試劑∶VATP檢測(cè)試劑稀釋液=1∶9的比例配制工作液，于不透光的96孔板中每孔加入100 μL的工作液，室溫下放置3～5 min后加入20 μL的標(biāo)準(zhǔn)品或者樣品，用連續(xù)波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的RLU值，并制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，把檢測(cè)到的樣品RLU值代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線中，檢測(cè)細(xì)胞蛋白濃度，計(jì)算出各組細(xì)胞ATP含量。

3.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡利用熒光探針annexin V-FITC識(shí)別凋亡細(xì)胞外翻的磷脂酰絲氨酸，而PI拒染活細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)原理，檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況。各組細(xì)胞給予相應(yīng)的藥物處理后用不含EDTA的胰酶消化收集H9C2心肌細(xì)胞，離心后倒掉上清液，用冷的PBS漂洗細(xì)胞以洗去殘余的胰酶，盡可能吸去PBS。加入400 μL annexin V結(jié)合液重懸細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度，轉(zhuǎn)移至流式管中，于流式管中加入5 μL annexin V-FITC染色液，混勻后冰上避光孵育15 min，再加入10 μL PI染色液，混勻后避光孵育5 min，上機(jī)檢測(cè)并統(tǒng)計(jì)心肌細(xì)胞凋亡百分比。

3.8 Western blot分析將H9C2細(xì)胞裂解收集于EP管中，離心后取部分上清用于檢測(cè)蛋白濃度。蛋白在100℃下煮5 min。配制12%和10%的SDSPAGE凝膠。上樣，按照濃縮膠70 V、30 min，分離膠120 V、90 min的條件電泳。電泳完后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，330 mA、38 min快速轉(zhuǎn)膜，配制5%的BSA溶液封閉PVDF膜1.5 h。封閉完后加入Ⅰ抗（SCAD抗體，1∶2 000；Bcl-2、pro-caspase-3和cleaved caspase-3抗體，1∶1 000；Bax抗體，1∶10 000；GAPDH抗體，1∶100 000），4℃孵育過(guò)夜。第二天將膜與Ⅱ抗室溫下孵育1 h。洗膜后與化學(xué)發(fā)光底物結(jié)合在化學(xué)發(fā)光成像儀下曝光顯影，檢測(cè)蛋白表達(dá)。

3.9 ROS檢測(cè)將H9C2細(xì)胞種植于6孔板，當(dāng)細(xì)胞量達(dá)到80%加入相應(yīng)的藥物。作用終止后吸去原有培養(yǎng)液，PBS漂洗2遍后每孔加入濃度為10 μmol/L不含血清的DCFH-DA稀釋液，在避光條件下置于細(xì)胞孵育箱孵育20 min，于黑暗處用不含F(xiàn)BS的高糖DMEM漂洗細(xì)胞以洗去未能與細(xì)胞充分結(jié)合的探針染料，用熒光顯微鏡于激發(fā)波長(zhǎng)488 nm下觀察熒光，并用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)熒光強(qiáng)度。

3.10 RT-qPCR檢測(cè)提取總RNA，測(cè)定RNA的濃度和純度，選擇純度在1.8～2.0之間的樣品進(jìn)行RTqPCR。采用逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒去除gDNA后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，凍存于-20℃。根據(jù)SYBR Green試劑盒配制反應(yīng)體系，進(jìn)行cDNA的擴(kuò)增和檢測(cè)，詳細(xì)引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Sequences of primers for RT-qPCR

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以上所得數(shù)據(jù)用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度及作用時(shí)間的tBHP對(duì)H9C2心肌細(xì)胞活力的影響

如圖1A所示，經(jīng)濃度分別為0、50、100、200、300和400 μmol/L的tBHP干預(yù)6 h，心肌細(xì)胞活力隨著tBHP濃度的增大而減小。如圖1B所示，心肌細(xì)胞在200 μmol/L的tBHP作用下，作用時(shí)間分別為0、1、4、6和8 h時(shí)，細(xì)胞活力隨著作用時(shí)間的增加而減小。tBHP濃度為200 μmol/L時(shí)干預(yù)心肌細(xì)胞6 h后，心肌細(xì)胞的活力降至50%左右，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用tBHP濃度為200 μmol/L干預(yù)6 h的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行研究。

2 不同濃度及作用時(shí)間的tBHP對(duì)H9C2心肌細(xì)胞SCAD蛋白和mRNA表達(dá)的影響

如圖2所示，Western blot結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞在tBHP的干預(yù)下，SCAD蛋白表達(dá)隨著tBHP濃度的增高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。RT-qPCR結(jié)果與Western blot結(jié)果趨勢(shì)一致，tBHP濃度為200 μmol/L干預(yù)6 h時(shí)，SCAD mRNA的表達(dá)下降最為顯著。該結(jié)果亦支持200 μmol/L的tBHP干預(yù)6 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件。

3 FAD對(duì)H9C2心肌細(xì)胞SCAD表達(dá)水平的影響

0、0.1、1、10和20 μmol/L FAD預(yù)處理心肌細(xì)胞24 h后，tBHP作用6 h的條件下，與Con組相比，給予tBHP后，SCAD蛋白表達(dá)均顯著下降（P＜0.01）；與tBHP組相比，不同濃度的FAD作用下，SCAD蛋白表達(dá)隨著FAD濃度的增高而增加，在濃度為10 μmol/L時(shí)，SCAD蛋白表達(dá)增加最為顯著（P＜0.01），因此后續(xù)采用10 μmol/L作為FAD的實(shí)驗(yàn)劑量，見(jiàn)圖3A。與Con組相比，tBHP誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡模型中SCAD的蛋白和mRNA表達(dá)顯著減少，SCAD酶活性顯著下降（P＜0.01），給予FAD干預(yù)后，SCAD的蛋白和mRNA表達(dá)顯著增加，SCAD酶活性顯著增強(qiáng)（P＜0.01），見(jiàn)圖3B～D。

4 FAD對(duì)H9C2心肌細(xì)胞凋亡率和活力的影響

與Con組比較，tBHP組心肌細(xì)胞大量凋亡，凋亡率顯著升高，給予FAD處理后心肌凋亡率顯著下降，見(jiàn)圖4A。與Con組比較，tBHP組心肌細(xì)胞活力顯著減弱（P＜0.01）；經(jīng)FAD干預(yù)后，與tBHP組相比，tBHP+FAD組心肌細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)（P＜0.01），顯示出與細(xì)胞凋亡率相同的趨勢(shì)，見(jiàn)圖4B。

Figure 1.The effect of tBHP on the viability of H9C2 cardiomyocytes.A：the viability of H9C2 cardiomyocytes treated with different concentrations of tBHP for 6 h；B：the viability of H9C2 cardiomyocytes treated with tBHP（200 μmol/L）for different time periods.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control（Con）group.圖1 tBHP對(duì)H9C2心肌細(xì)胞活力的影響

Figure 2.The effect of tBHP on the protein and mRNA expression of SCAD in H9C2 cardiomyocytes.A：the protein expression of SCAD in H9C2 cardiomyocytes treated with different concentrations of tBHP；B：the protein expression of SCAD in H9C2 cardiomyocytes treated with tBHP for different time periods；C：the mRNA expression of SCAD in H9C2 cardiomyocytes treated with different concentrations of tBHP；D：the mRNA expression of SCAD in H9C2 cardiomyocytes treated with tBHP for different time periods.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control（Con）group.圖2 tBHP對(duì)H9C2心肌細(xì)胞SCAD蛋白和mRNA表達(dá)的影響

Figure 3.The effect of FAD on SCAD protein and mRNA expression in H9C2 cardiomyocytes.A：the SCAD protein expression in H9C2 cardiomyocytes treated with different concentrations of FAD；B：the SCAD protein expression in H9C2 cardiomyocytes treated with 10 μmol/L FAD；C：the SCAD mRNA expression in H9C2 cardiomyocytes treated with 10 μmol/L FAD；D：SCAD enzyme activity in H9C2 cardiomyocytes treated with 10 μmol/L FAD.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control（Con）group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs tBHP group.圖3 FAD對(duì)H9C2心肌細(xì)胞SCAD蛋白和mRNA表達(dá)的影響

5 FAD對(duì)H9C2心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖5所示，與Con組相比，tBHP組心肌細(xì)胞促凋亡蛋白cleaved caspase-3表達(dá)顯著增加（P＜0.01），抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax比值顯著降低（P＜0.01）；經(jīng)FAD干預(yù)，心肌細(xì)胞內(nèi)cleaved caspase-3表達(dá)顯著減少（P＜0.01），Bcl-2/Bax比值顯著上升（P＜0.01）。

6 FAD對(duì)H9C2心肌細(xì)胞能量代謝的影響

與Con組相比，tBHP組心肌細(xì)胞ATP含量顯著減少（P＜0.01）；給予FAD干預(yù)后，與tBHP組相比，tBHP+FAD組心肌細(xì)胞ATP含量顯著增加（P＜0.01），見(jiàn)圖6A。與Con組相比，tBHP組心肌細(xì)胞游離脂肪酸含量顯著增加（P＜0.01）；給予FAD干預(yù)后，與tBHP組相比，tBHP+FAD組心肌細(xì)胞離脂肪酸含量顯著減少（P＜0.01），見(jiàn)圖6B。

7 FAD對(duì)H9C2心肌細(xì)胞ROS含量的影響

如圖7所示，與Con組相比，tBHP組ROS含量顯著增加（P＜0.01），心肌細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平顯著增強(qiáng)；與tBHP組相比，經(jīng)過(guò)FAD處理后，tBHP+FAD組心肌細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著減少（P＜0.01），心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平顯著下降。

討 論

SCAD是脂肪酸β氧化的限速酶，也是黃素蛋白之一，在心肌能量代謝中發(fā)揮重要作用。FAD是電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白泛醌氧化還原酶的輔助因子，構(gòu)成了許多線粒體黃素蛋白脫氫酶的電子傳遞途徑，參與脂肪酸和氨基酸代謝。生理濃度下的FAD能夠顯著提高?；o酶A脫氫酶的穩(wěn)定性，F(xiàn)AD的結(jié)合對(duì)于黃素蛋白的催化活性以及正確的折疊、組裝和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性非常重要［14］，F(xiàn)AD結(jié)合位點(diǎn)的不穩(wěn)定性可能損害電子傳遞系統(tǒng)從而引起多?；o酶A脫氫酶缺乏癥［15］。

Figure 4.The effect of FAD on the apoptosis（A）and viability（B）of H9C2 cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control（Con）group；##P＜0.01 vs tBHP group.圖4 FAD對(duì)H9C2心肌細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞活力的影響

Figure 5.The effect of FAD on the expression of apoptosis-related proteins in H9C2 cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control（Con）group；##P＜0.01 vs tBHP group.圖5 FAD對(duì)H9C2心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

我們前期研究證明，SCAD表達(dá)下調(diào)與原代乳鼠心肌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，敲低SCAD基因的原代乳鼠心肌細(xì)胞，其凋亡程度顯著增加［8］。FAD可抑制自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚和纖維化［12］；改善內(nèi)皮細(xì)胞功能，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受tBHP誘導(dǎo)的損傷［16］。tBHP與H2O2性質(zhì)相似，具有穩(wěn)定性高，不易降解的優(yōu)點(diǎn)，可誘導(dǎo)細(xì)胞體外凋亡［17］。因此，本研究進(jìn)一步采用tBHP構(gòu)建心肌細(xì)胞凋亡模型，探究FAD對(duì)tBHP誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞凋亡的影響及其可能的作用機(jī)制，為FAD用于臨床防治心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究中，在tBHP刺激下，H9C2心肌細(xì)胞凋亡率顯著增加，促凋亡蛋白表達(dá)增加，抗凋亡蛋白表達(dá)減少。經(jīng)FAD干預(yù)后，H9C2心肌細(xì)胞凋亡情況緩解，促凋亡蛋白表達(dá)顯著減少，抗凋亡蛋白表達(dá)顯著增多，表明FAD對(duì)H9C2心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。tBHP誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞，SCAD表達(dá)顯著下調(diào)；經(jīng)FAD干預(yù)后，SCAD酶活性增加，蛋白和mRNA表達(dá)增多，H9C2心肌細(xì)胞凋亡率顯著下降，表明FAD可能通過(guò)增加SCAD表達(dá)，進(jìn)而抑制H9C2心肌細(xì)胞凋亡。

Figure 6.The effect of FAD on energy metabolism in H9C2 cardiomyocytes.A：content of ATP in H9C2 cardiomyocytes；B：content of free fatty acid in H9C2 cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control（Con）group；##P＜0.01 vs tBHP group.圖6 FAD對(duì)H9C2心肌細(xì)胞能量代謝的影響

Figure 7.The effect of FAD on the content of ROS in H9C2 cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control（Con）group；##P＜0.01 vs tBHP group.圖7 FAD對(duì)H9C2心肌細(xì)胞ROS含量的影響

研究結(jié)果顯示，在tBHP刺激下，H9C2細(xì)胞ATP含量減少、游離脂肪酸含量增加，ROS蓄積增多，表明H9C2細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的能量代謝障礙。給予FAD干預(yù)后，H9C2細(xì)胞ATP含量增加、游離脂肪酸含量減少，ROS蓄積減輕，表明FAD能顯著改善H9C2細(xì)胞能量代謝障礙。心肌細(xì)胞能量的70%來(lái)源于脂肪酸β氧化［18］。在tBHP刺激下，H9C2細(xì)胞SCAD表達(dá)下調(diào)，引起脂肪酸β氧化減少，ATP含量減少，游離脂肪酸含量增多。細(xì)胞內(nèi)沉積的游離脂肪酸進(jìn)入線粒體，破壞線粒體功能，損壞磷酸復(fù)合物，影響線粒體呼吸鏈的電子傳遞，導(dǎo)致ROS蓄積［19-21］。表明FAD可能通過(guò)增加H9C2細(xì)胞SCAD表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸β氧化，改善細(xì)胞能量代謝障礙，降低細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，從而抑制細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑。

我們前期研究證實(shí)，在分子動(dòng)力學(xué)模擬中，與APO體系（無(wú)底物無(wú)FAD）相比，F(xiàn)AD-SCAD體系（無(wú)底物，有FAD）中SCAD蛋白結(jié)構(gòu)的均方根偏差與回轉(zhuǎn)半徑值更低，原子波動(dòng)幅度更小，二聚體的膨脹程度更低，具有更高的穩(wěn)定性和更緊密的分子結(jié)構(gòu)［12］。此外，與FAD-SCAD體系相比，APO體系的底物口袋塌陷，而FAD的存在可防止底物口袋塌陷，有利于底物順利進(jìn)入催化口袋完成催化反應(yīng)。FAD對(duì)SCAD蛋白結(jié)構(gòu)的緊密度以及催化口袋的穩(wěn)定至關(guān)重要，表明FAD是SCAD穩(wěn)定發(fā)揮催化反應(yīng)的前提。因此，增加FAD在SCAD中結(jié)合位點(diǎn)的飽和度，可能是FAD促進(jìn)脂肪酸β氧化，抑制心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

綜上所述，F(xiàn)AD可能通過(guò)結(jié)合SCAD口袋，穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)，提高SCAD酶活性，增加SCAD表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸β氧化，改善心肌細(xì)胞能量代謝，降低細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡。本研究從心肌細(xì)胞能量代謝視角闡明FAD在心肌細(xì)胞凋亡中的作用，為臨床上FAD用于防治心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而，F(xiàn)AD通過(guò)激活SCAD抑制心肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，尚需深入研究。