Pim1調(diào)控巨噬細(xì)胞M1型極化介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥在ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化中的作用*

鐘耕瑞，付萌萌，王小波，王漢琴△

（1湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，湖北 十堰 442000；2湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬隨州醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，湖北 隨州 441300）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種常見的血管慢性炎癥疾病，其發(fā)病機(jī)制與內(nèi)皮細(xì)胞損傷和巨噬細(xì)胞的浸潤等因素有關(guān)［1-2］。研究表明，巨噬細(xì)胞作為斑塊中炎癥因子的主要來源，受不同環(huán)境因子刺激可分化為具有不同功能和細(xì)胞表面標(biāo)記的亞型，主要為經(jīng)典活化M1型和選擇活化M2型，其功能表型影響AS進(jìn)展及轉(zhuǎn)歸，其中，M1型巨噬細(xì)胞通過產(chǎn)生和分泌促炎因子，與內(nèi)皮細(xì)胞之間相互作用，損傷內(nèi)皮引發(fā)或加重炎癥反應(yīng)［3］。

Pim1屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Pim家族成員［4］。研究表明，Pim1可通過磷酸化多種炎癥蛋白底物在炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起作用，參與多種炎癥性疾病的發(fā)生［5-6］。新近的研究發(fā)現(xiàn)，抑制Pim1可以抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞上清液中炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生［7-8］，但是，Pim1是否對巨噬細(xì)胞極化有調(diào)控作用？目前尚不清楚。

本研究用LPS誘導(dǎo)小鼠Raw264.7細(xì)胞建立M1型巨噬細(xì)胞模型，用其上清作為條件培養(yǎng)液孵育人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），體外模擬內(nèi)皮細(xì)胞在AS中的炎癥環(huán)境。在動物水平，用ApoE-/-小鼠頸動脈局部結(jié)扎術(shù)建立小鼠頸動脈AS斑塊模型。檢測Pim1對M1巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)，及對內(nèi)皮細(xì)胞血管內(nèi)皮鈣黏蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-cadherin）、細(xì)胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule 1，ICAM1）和血管細(xì)胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM1）表達(dá)的影響。本研究通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，旨在觀察Pim1是否通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞M1型極化介導(dǎo)內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，并初步探討Pim1在ApoE-/-小鼠AS發(fā)生中的作用，以期為AS發(fā)生機(jī)制研究提供參考。

材料和方法

1 細(xì)胞及試劑

小鼠來源的巨噬細(xì)胞Raw264.7購自中科院上海細(xì)胞所；Trizol和Lipofectamine?3000購于Invitrogen；K1621逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Thermo；iTaqTMUniversal SYBR Green Supermix購自Bio-Rad；M199和DMEM培養(yǎng)液購自Gibco；血清購自天杭生物科技公司；酸性成纖維細(xì)胞生長因子購自Sigma；LPS和SMI-4a購自上海陶術(shù)生物科技有限公司；VE-cadherin抗體購自Abcam；Pim1抗體購自Novus；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、ICAM1和VCAM1抗體購自Immunoway；β-tubulin抗體和辣根酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠Ⅱ抗購自武漢安特捷生物技術(shù)有限公司；ApoE-/-小鼠由湖北醫(yī)藥學(xué)院胚胎干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室郭興榮教授課題組惠贈。

2 方法

2.1 HUVECs的培養(yǎng)及鑒定取新鮮臍帶（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬隨州醫(yī)院產(chǎn)科提供，標(biāo)本采集經(jīng)過患者家屬知情同意及醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)），37℃的PBS沖洗臍靜脈3次，0.125%胰酶注入臍靜脈消化內(nèi)皮細(xì)胞10 min，含血清的M199終止消化離心重懸，接種到多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，加入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液（500 mL的M199全細(xì)胞培養(yǎng)液中含有100 mmol/L HEPES、10 nmol/L胸苷、2 mmol/L谷氨酰胺、4 g/L酸性成纖維細(xì)胞生長因子、5 000 U/L肝素和100 mL血清），置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置12 h，待細(xì)胞完全貼壁后更換新的培養(yǎng)液；5～7 d細(xì)胞至融合狀態(tài)消化傳代，血管內(nèi)皮標(biāo)志物Ⅷ因子免疫熒光鑒定，取第3～5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 小鼠頸動脈AS模型的建立SPF級6周齡雄性ApoE-/-小鼠27只，體質(zhì)量（25±1）g，許可證號為SCXK（蘇）2016-0004，經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物委員會批準(zhǔn)。參考文獻(xiàn)［9］行左側(cè)頸動脈（left carotid artery，LCA）部分結(jié)扎術(shù)建模。5%水合氯醛（50 mg/kg）麻醉小鼠，仰臥位固定于無菌操作臺，頸前正中線切開皮膚，小心分離其頸前腺體，左側(cè)下頜處鈍性分離頸動脈4分支，7-0絲線結(jié)扎左頸內(nèi)、頸外和枕后動脈，只保留甲狀腺上動脈，縫合頸前腺體和皮膚，尾靜脈注射抗生素預(yù)防感染。建模成功后的小鼠隨機(jī)分為兩組，每組9只，SMI-4a干預(yù)組每周尾靜脈注射75 mg/kg的SMI-4a，模型（model）組每周尾靜脈注射等體積DMSO；兩組小鼠8周齡改高脂飲食飼養(yǎng)，2個(gè)月后小鼠安樂死，收獲左右側(cè)頸動脈，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 siRNA干擾實(shí)驗(yàn)搜索GenBank中小鼠Pim1基因全長cDNA序列，委托廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成特異性siPim1序列及陰性對照（negative control，siNC）RNA序列，Pim1正義鏈5′-GTGTCAGC ACCTTATTAAA-3′，反義鏈5′-TTTAATAAGGTGCTGACAC-3′。待6孔 板 中Raw264.7細(xì) 胞 融 合 度 達(dá)50%，更換為OptiMEM培養(yǎng)液，Lipofectamine?3000轉(zhuǎn)染siRNA，實(shí)驗(yàn)操作按照說明書進(jìn)行。

2.4 巨噬細(xì)胞分組與干預(yù)（1）M1型巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)極化：使用終濃度20 nmol/L的LPS誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞，作用時(shí)間為24 h，使細(xì)胞向M1表型極化，為M1型巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（LPS）組；用DMSO孵育的Raw264.7細(xì)胞為M0巨噬細(xì)胞對照（control）組。（2）巨噬細(xì)胞干預(yù)實(shí)驗(yàn)：用終濃度50 nmol/L的Pim1抑制劑SMI-4a孵育Raw264.7細(xì)胞后，再用LPS誘導(dǎo)24 h，為LPS+SMI-4a組；Raw264.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染siPim1和siNC后，再用LPS誘導(dǎo)24 h，為LPS+siPim1組和LPS+siNC組。

2.5 巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)液（conditioned medium，CM）的制備M1型、M0型、SMI-4a組、siNC組和siPim1組巨噬細(xì)胞經(jīng)PBS洗2次，更換新的含10%血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集培養(yǎng)液上清作為CM，即CMM1、CMM0、CMSMI-4a、CMsiNC和CMsiPim1，用于孵育HUVECs。

2.6 油紅O染色左右頸動脈組織或者冰凍切片4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗兩次，60%異丙醇分化90 s，油紅O染色20～60 min，60%異丙醇洗掉背景色，拍照記錄。

2.7 免疫熒光染色-80℃取出實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠頸動脈，冰凍切片，-20℃保存；HUVECs消化重懸接種于多聚賴氨酸包備的玻片，加入CM孵育24 h，吸干培養(yǎng)液，PBS洗2次。切片或細(xì)胞爬片4%多聚甲醛固定20 min，0.3% Triton X-100通透10 min，使用免疫組化筆畫圈，5%牛血清白蛋白37℃封閉30 min。Ⅰ抗（1∶100）37℃孵育90 min，熒光Ⅱ抗（1∶250）孵育30 min，DAPI染色15 s，滴加抗熒光淬滅劑封片，倒置熒光顯微鏡觀察采集圖像。

2.8 Western blot實(shí)驗(yàn)用含有蛋白酶抑制劑的全細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，血管組織從-80℃冰箱取出用液氮研磨后加入全細(xì)胞裂解液，5 000×g離心，蛋白定量后加入5×上樣緩沖液，100℃煮10 min。取5 μg蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE分離后，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜（300 mA、100 min），5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，Ⅰ抗（1∶1 000）4℃搖床過夜，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育2 h，ECL顯色后采用ChemiDocTMXRS成像系統(tǒng)（Bio-Rad）成像，Image Lab凝膠分析軟件分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均為至少3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間均數(shù)比較采用Student′st檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 LPS上調(diào)Raw264.7巨噬細(xì)胞iNOS和Pim1表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，LPS（20 nmol/L）干預(yù)Raw264.7細(xì)胞24 h后，M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS表達(dá)顯著增多（P＜0.01），Pim1表達(dá)也顯著增多（P＜0.05），見圖1。

2 抑制或敲減Pim1對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M1型極化的影響

用不同濃度（0、10、20、30、50和100 nmol/L）的Pim1抑制劑SMI-4a孵育Raw264.7細(xì)胞，結(jié)果顯示，50和100 nmol/L的SMI-4a均可顯著抑制Pim1蛋白表達(dá)（P＜0.05），見圖2A。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇用SMI-4a濃度為50 nmol/L。Western blot結(jié)果顯示，與LPS組比較，用SMI-4a預(yù)處理Raw264.7細(xì)胞，再經(jīng)LPS誘導(dǎo)，Raw264.7細(xì)胞中Pim1表達(dá)和M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS表達(dá)均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），見圖2B。轉(zhuǎn)染siPim1和siNC后，與LPS+siNC組比較，LPS+siPim1組在抑制Pim1表達(dá)同時(shí)，M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS表達(dá)也顯著下調(diào)（P＜0.05），見圖2C。

Figure 1.LPS induced M1 macrophage polarization and increased Pim1 expression.Raw264.7 cells were incubated with LPS for 24 h.The protein levels of iNOS and Pim1 in Raw264.7 cells were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖1 LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型極化及上調(diào)Pim1表達(dá)

Figure2.Pim1 inhibitor SMI-4a or knockdown of Pim1 attenuated LPS-induced polarization of macrophages to M1 phenotype.A：Raw264.7 cells were incubated with Pim1 inhibitor SMI-4a at the concentration range of 0～100 nmol/L，and Pim1 expression was detected by Western blot；B and C：Raw264.7 cells were treated with 50 nmol/L SMI-4a（B）or siPim1 transfection（C）followed by LPS induction for 24 h，and the protein levels of iNOS and Pim1 were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.△P＜0.05 vs 0 nmol/L；*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS group；&P＜0.05 vs LPS+siNC group.圖2 SMI-4a和敲減Pim1抑制了LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M1型極化

3 M1型 巨噬 細(xì) 胞CM上調(diào)HUVEC中VCAM1和ICAM1的表達(dá)

免疫熒光結(jié)果（圖3A）可見，與CMM0組相比，用CMM1孵育HUVECs 24 h，CMM1組ICAM1和VCAM1的紅色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)；Western blot結(jié)果（圖3B）顯示，CMM1顯 著 上 調(diào) 了HUVECs中ICAM1（P＜0.01）和VCAM1（P＜0.05）蛋白表達(dá)。

Figure 3.Conditioned medium（CM）of M1 macrophages up-regulated ICAM1 and VCAM1 expression in HUVECs.The HUVECs were incubated with M0 and M1 macrophage CM（CMM0 and CMM1）for 24 h.A：immunofluorescence image of HUVECs（blue is the nucleus，and red is ICAM1 and VCAM1；scale bar=50 μm）；B：the protein levels of ICAM1 and VCAM1 were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs CMM0 group.圖3 M1型巨噬細(xì)胞CM上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞VCAM1和ICAM1表達(dá)

4 抑制或敲減Pim1對CMM1誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞VCAM1和ICAM1表達(dá)的影響

免疫熒光結(jié)果（圖4A）可見，CMSMI-4a和CMsiPim1組HUVECs中ICAM1和VCAM1熒光強(qiáng)度顯著減弱。與免疫熒光結(jié)果一致，Western blot結(jié)果（圖4B、C）顯示，CMSMI-4a和CMsiPim1顯著下 調(diào)了HUVECs的ICAM1和VCAM1蛋白表達(dá)（P＜0.01）。

5 ApoE-/-小鼠頸動脈結(jié)扎后Pim1、iNOS、VE-cadherin、VCAM1和ICAM1的表達(dá)變化

Figure 4.SMI-4a or knockdown of Pim1 inhibited M1 macrophage conditioned medium（CM）-induced expression of VCAM1 and ICAM1 in HUVECs.The Raw264.7 cells were treated with SMI-4a or siPim1 transfection，and then the CM of each group was used to incubate HUVECs for 24 h.A：immunofluorescence image of HUVECs（blue is the nucleus，and red is ICAM1 or VCAM1；scale bar=50 μm）；B and C：the protein levels of ICAM1 and VCAM1 in HUVECs were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs CMM1 group；##P＜0.01 vs CMsiNC group.圖4 SMI-4a和敲減Pim1抑制了M1型巨噬細(xì)胞CM誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞VCAM1和ICAM1表達(dá)

如圖5A，結(jié)扎小鼠左頸內(nèi)、頸外和枕后動脈建立AS模型，選取模型組ApoE-/-小鼠兩側(cè)頸動脈，血管壁油紅O染色結(jié)果顯示，左側(cè)頸動脈（LCA）較右側(cè)頸動脈（RCA）脂質(zhì)顯著蓄積，右側(cè)未結(jié)扎側(cè)無AS病變，而左側(cè)結(jié)扎側(cè)有明顯的AS病變。免疫熒光染色（圖5B）可觀察到，與未結(jié)扎側(cè)比較，結(jié)扎側(cè)血管壁M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志分子iNOS紅色熒光亮度顯著增強(qiáng)，而血管內(nèi)皮標(biāo)志分子VE-cadherin綠色熒光強(qiáng)度減弱。Western blot結(jié)果（圖5C）顯示，結(jié)扎側(cè)血管壁Pim1、iNOS、ICAM1和VCAM1蛋白水平均顯著高于未結(jié)扎側(cè)（P＜0.05或P＜0.01），而VE-cadherin表達(dá)則顯著低于未結(jié)扎測（P＜0.05）。

6 SMI-4a對ApoE-/-小鼠頸動脈斑塊及M1型巨噬細(xì)胞極化和黏附分子表達(dá)的影響

Figure 5.The expression of Pim1，iNOS，VE-cadherin，VCAM1 and ICAM1 in the carotid artery of ApoE-/-mice.A：the diagram of AS model constructed by carotid artery partial ligation in ApoE-/-mice（left），and the AS plaques in the carotid artery detected by oil red O staining（right）；B：immunofluorescence staining of VE-cadherin（green）and iNOS（red）in the carotid artery（blue is the nucleus；scale bar=100 μm）；C：Western blot was used to detect the protein levels of iNOS，VE-cadherin，Pim1，ICAM1 and VCAM1 in the carotid artery.Mean±SD.n=9.*P＜0.05，**P＜0.01 vs RCA group.圖5 ApoE-/-小鼠AS模型頸動脈Pim1、iNOS、VE-cadherin、VCAM1和ICAM1的表達(dá)變化

建模后用SMI-4a干預(yù)，油紅O染色可見，SMI-4a組LCA脂質(zhì)沉積明顯被抑制（圖6A），斑塊面積顯著減小（圖6B）。免疫熒光結(jié)果顯示，與模型組相比，SMI-4a組iNOS紅色熒光明顯減弱，VE-cadherin綠色熒光增強(qiáng)（圖6C）。Western blot結(jié)果（圖6D）顯示，SMI-4a組血管壁Pim1、iNOS、ICAM1和VCAM1蛋白表達(dá)均顯著低于模型組（P＜0.05或P＜0.01），而VEcadherin表達(dá)則顯著高于模型組（P＜0.05）。

討 論

AS特征是斑塊形成，也是缺血性心臟病和外周動脈疾病等多種疾病的病理基礎(chǔ)。有多種細(xì)胞參與AS進(jìn)展，斑塊中巨噬細(xì)胞的主要來源是外周血單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞極化后釋放的炎癥因子可能是導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷、加快AS進(jìn)展的重要原因［1］。本研究結(jié)果可見，AS進(jìn)展中，M1型巨噬細(xì)胞極化增多，伴隨Pim1表達(dá)顯著上調(diào)，內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子ICAM1和VCAM1的表達(dá)升高。

我們課題組前期研究觀察到，體外給予內(nèi)皮細(xì)胞切應(yīng)力刺激，與靜止組相比，15 dyn/cm2層流切應(yīng)力可以顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞Pim1蛋白水平，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮生成［10］。本研究用小鼠頸動脈部分結(jié)扎建立的是低切應(yīng)力斑塊模型［9］，即未行結(jié)扎側(cè)（右側(cè)頸動脈）為層流切應(yīng)力，結(jié)扎側(cè)左側(cè)頸動脈為低切應(yīng)力，結(jié)果顯示低切應(yīng)力側(cè)血管壁中有斑塊形成同時(shí)Pim1蛋白水平的異常升高，與體外結(jié)果比較，我們推測在斑塊中可能還有其他細(xì)胞的Pim1表達(dá)上調(diào)，才導(dǎo)致血管壁Pim1蛋白水平升高。因此我們用小鼠Raw264.7巨噬細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，檢測到Raw264.7細(xì)胞在LPS誘導(dǎo)下向M1型巨噬細(xì)胞極化增多，并伴隨Pim1表達(dá)上調(diào)，提示是否是Pim1調(diào)節(jié)了巨噬細(xì)胞M1型極化，進(jìn)而在AS形成中發(fā)揮了作用？

Figure 6.Effects of SMI-4a on the expression of Pim1，VE-cadherin，iNOS，VCAM1 and ICAM1 in the carotid artery of ApoE-/-mice.SMI-4a was injected into the tail vein of AS model ApoE-/-mice.A：oil red O staining of mouse carotid artery；B：AS plaque detected by oil red O staining in left carotid artery at cross section（scale bar=100 μm）；C：immunofluorescence staining of VE-cadherin（green）and iNOS（red）in left carotid artery（scale bar=100 μm）；D：Western blot was used to detect the protein levels of iNOS，VE-cadherin，Pim1，ICAM1 and VCAM1 in left carotid artery.Mean±SD.n=9.*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.圖6 SMI-4a對ApoE-/-小鼠頸動脈Pim1、VE-cadherin、iNOS、VCAM1和ICAM1表達(dá)的影響

Pim1蛋白在結(jié)構(gòu)上缺乏調(diào)節(jié)亞基，Pim1功能被認(rèn)為與其表達(dá)量一致［11］。用LPS誘導(dǎo)的Raw264.7細(xì)胞上清液去孵育內(nèi)皮細(xì)胞，觀察到內(nèi)皮黏附分子ICAM1和VCAM1的表達(dá)升高，是不是巨噬細(xì)胞M1型極化促進(jìn)了內(nèi)皮炎癥反應(yīng)？為了驗(yàn)證我們的假設(shè)，用Pim1抑制劑SMI-4a和siPim1敲 減Raw264.7細(xì)胞Pim1，結(jié)果顯示，伴隨Pim1表達(dá)的降低，M1巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS表達(dá)也下降，其上清誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)同時(shí)降低，說明Pim1調(diào)節(jié)了巨噬細(xì)胞M1型極化，抑制了內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。在動物實(shí)驗(yàn)中，向ApoE-/-小鼠尾靜脈注射SMI-4a，Pim1在體內(nèi)受到整體抑制之后，iNOS紅色熒光染色減少，內(nèi)皮標(biāo)志物的綠色熒光染色連續(xù)性增加，顯示內(nèi)皮損傷減少。考慮到抑制Pim1并不是特異性抑制巨噬細(xì)胞Pim1表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)所用濃度SMI-4a在血液中有殺傷單核細(xì)胞的作用［12］，也就是說可能是通過減少單核細(xì)胞在內(nèi)皮上的黏附數(shù)量，導(dǎo)致M1巨噬細(xì)胞數(shù)量的減少。體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)，我們得出初步結(jié)論，Pim1參與巨噬細(xì)胞M1表型極化，M1型巨噬細(xì)胞可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，造成內(nèi)皮損傷。

研究表明，巨噬細(xì)胞M1型極化后釋放的IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎因子是重要的炎性外泌蛋白，是導(dǎo)致包括AS在內(nèi)的等多種炎癥性疾病發(fā)生的因素［13-15］。本研究只觀察了Pim1可以調(diào)控M1型巨噬細(xì)胞的極化，未檢測上清中IL-6、IL-1β和TNF-α等的作用，雖然有文獻(xiàn)證實(shí)，抑制Pim1可以抑制LPS誘導(dǎo)的Raw264.7細(xì)胞上清液中炎癥因子的產(chǎn)生［7-8］。但Pim1是否通過調(diào)節(jié)這些炎癥因子表達(dá)，從而影響內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的合成，以及哪些信號分子參與了這個(gè)過程，有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，Pim1參與AS進(jìn)展中M1型巨噬細(xì)胞極化，M1型巨噬細(xì)胞高表達(dá)Pim1促進(jìn)了內(nèi)皮黏附分子ICAM1和VCAM1的表達(dá)。但是Pim1作為絲氨酸/蘇氨酸激酶，與M1巨噬細(xì)胞極化有關(guān)的NF-κB等信號之間的關(guān)系，還需要我們接下來進(jìn)一步的探索。同時(shí)，在AS進(jìn)展中我們采用高脂飲食飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)中也觀察到Pim1參與了脂代謝的過程，但是內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞都參與了脂質(zhì)代謝，Pim1在脂代謝中的作用我們也會在以后的研究中加以闡述。