細(xì)胞自噬與血腦屏障的關(guān)系研究進(jìn)展

王俁棋，徐鵬，范紅結(jié)，王小敏

遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州遵義 563000

自噬是一種高度保守的生物學(xué)現(xiàn)象，在大多數(shù)細(xì)胞中，基礎(chǔ)水平的自噬不斷發(fā)生。自噬能夠清除錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞器，這對(duì)于細(xì)胞在各類應(yīng)激狀態(tài)下的存活及保持自身完整性至關(guān)重要[1-2]。研究表明，自噬參與調(diào)節(jié)先天性免疫和獲得性免疫，與機(jī)體健康密切相關(guān)，自噬流受阻可能導(dǎo)致癌癥、亨廷頓病、帕金森病等疾病[3-4]。血腦屏障(blood brain barrier，BBB)在大腦與外周循環(huán)之間起保護(hù)作用，主要由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(cerebral microvascular endothelial cells，BMECs)、周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元組成，其中BMECs通過緊密連接(tight junction，TJ)蛋白連接[5-6]。TJ蛋白是BBB控制腦血管通透性的主要功能成分，BBB功能障礙通常與內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的破壞或過度通透有關(guān)，可導(dǎo)致各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。因此，維持BBB結(jié)構(gòu)的完整性和正常功能對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)和生理功能至關(guān)重要。最近研究表明，細(xì)胞自噬過程受一系列生物因子和化合物的調(diào)節(jié)，且可能對(duì)BBB的功能與結(jié)構(gòu)完整性產(chǎn)生重大影響。本文綜述目前關(guān)于細(xì)胞自噬在BBB完整性、防止病原體等有害物質(zhì)穿越BBB、加速藥物穿越BBB進(jìn)而發(fā)揮藥效等方面的研究進(jìn)展，旨在為進(jìn)一步探討自噬與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系奠定理論依據(jù)。

1 自噬與BBB相互影響

自噬對(duì)BBB有著雙重作用，在某些情況下，自噬對(duì)BBB的完整性起到保護(hù)作用，主要表現(xiàn)在缺血缺氧等應(yīng)激狀態(tài)下有助于維持BBB的完整性以及腦損傷后對(duì)BBB的修復(fù)作用。然而，有研究表明，自噬對(duì)BBB的完整性亦可起到損傷或破壞作用[7]。

1.1 細(xì)胞自噬對(duì)BBB的保護(hù)作用 大多數(shù)情況下，自噬具有保護(hù)細(xì)胞的作用，自噬對(duì)BBB的有益作用與自噬如何被誘導(dǎo)以及自噬發(fā)生在何種細(xì)胞內(nèi)相關(guān)。當(dāng)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)被剝奪或處于缺氧狀態(tài)下，自噬被激活并對(duì)緊密連接蛋白-5(claudin-5)進(jìn)行再分配，claudin-5是BBB形成緊密連接的關(guān)鍵分子，可以封閉細(xì)胞間隙并維持細(xì)胞旁屏障[8]，從而維持BBB正常的生理功能[9-10]。Engelhardt等[11]探究BBB相關(guān)細(xì)胞在缺血缺氧條件下的反應(yīng)差異時(shí)發(fā)現(xiàn)，周細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞可通過激活自噬途徑來調(diào)控其自身的存活，由此推測(cè)，自噬可能是周細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)缺血缺氧損傷的一種適應(yīng)性手段，其機(jī)制是通過分解現(xiàn)有的細(xì)胞質(zhì)前體促進(jìn)受損線粒體的清除和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的再生，但仍需深入研究其潛在機(jī)制。

一些化合物誘導(dǎo)的自噬對(duì)BBB具有保護(hù)和修復(fù)作用。例如，葡萄糖代謝過程中產(chǎn)生的反應(yīng)性代謝產(chǎn)物甲基乙二醛引起的自噬可保護(hù)BMECs免受損傷，有助于維持BBB的完整性[12]；黃芩苷是一種神經(jīng)保護(hù)劑，可減輕腦水腫，從而減輕BBB的破壞，其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制亦是通過激活自噬因子實(shí)現(xiàn)的[13]；富含橄欖油的特級(jí)初榨橄欖油(extra-virgin olive oil，EVOO)改善BBB的緊密性也是通過激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)途徑誘導(dǎo)自噬實(shí)現(xiàn)的[14]。

自噬可減輕腦損傷引起的BBB破壞。木犀草素是類黃酮家族的一員，被證實(shí)在創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)后可激活自噬，減少促炎因子IL-1β和TNF-α的mRNA和蛋白表達(dá)量，減輕神經(jīng)元變性，進(jìn)而減輕TBI引發(fā)的腦水腫和對(duì)BBB的破壞[15]。相反，一些對(duì)BBB有害的物質(zhì)通過抑制自噬而發(fā)揮損傷BBB的作用。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6通過抑制自噬和促進(jìn)氧化應(yīng)激而加重蛛網(wǎng)膜下腔出血，加重早期腦損傷程度，而早期腦損傷主要包括BBB損傷、神經(jīng)元死亡和腦水腫[16]。

1.2 細(xì)胞自噬對(duì)BBB的損傷作用 自噬也可損傷BBB相關(guān)細(xì)胞，在這種情況下，抑制自噬反而可保護(hù)BBB的完整性。最近研究證實(shí)，人類免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus-1，HIV-1)編碼的反式轉(zhuǎn)錄激活因子(transactivator of transcription，TAT)蛋白破壞BBB的緊密連接是通過誘導(dǎo)自噬實(shí)現(xiàn)的[17]。此外，血管基底膜外周細(xì)胞的存在對(duì)于維持BBB的完整性至關(guān)重要，而自噬是周細(xì)胞凋亡的上游過程。因此，通過sigma-1受體激動(dòng)劑抑制自噬可明顯提高周細(xì)胞存活率，維持BBB的完整性[18-22]。氧糖剝奪(oxygen–glucose deprivation，OGD)誘導(dǎo)的自噬可導(dǎo)致腦內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、BBB通透性增加[23]。Wu等[24]探討了線粒體分裂抑制劑1(Mdivi-1)在TBI后的自噬和線粒體自噬中的潛在作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)Mdivi-1可減緩TBI介導(dǎo)的BBB破壞和細(xì)胞死亡，且部分是通過抑制異常自噬和激活線粒體自噬實(shí)現(xiàn)的。

一氧化氮(NO)、小凹蛋白1(caveolin-1)與自噬體相互作用，在長(zhǎng)時(shí)間缺血條件下可誘導(dǎo)claudin-5降解，破壞BBB的完整性，其部分機(jī)制是NO作為一個(gè)觸發(fā)器，可促進(jìn)caveolin-1將claudin-5傳遞給自噬體，隨后被溶酶體降解[25]。研究發(fā)現(xiàn)，硫化氫供體(NaHS)可抑制自噬，保護(hù)神經(jīng)元免受凋亡，促進(jìn)髓鞘化和軸突修復(fù)，維持BBB的完整性[26]。同樣，dl-3-正丁基苯酞(dl-3n-butylphthalide，Dl-NBP)也可通過抑制自噬而阻斷TJ蛋白丟失和神經(jīng)元凋亡，發(fā)揮保護(hù)BBB的作用[27]。在體內(nèi)試驗(yàn)中，OGD誘導(dǎo)90 min后，再灌注16 mmol/L葡萄糖30 min，結(jié)果顯示高糖可顯著誘導(dǎo)自噬，加重BBB損傷；同樣，采用自噬激活劑雷帕霉素增強(qiáng)自噬可進(jìn)一步導(dǎo)致緊密連接蛋白1(zonula oc-cludens-1，ZO-1)表達(dá)降低或再分配，從而增加BBB的通透性[28]。3 xTg-A D 小鼠腦血管、胰島素受體-β(i n s u l i n receptor-beta，IR-β)和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-1(lipoprotein receptor-related protein-1，LRP-1)水平降低與自噬標(biāo)記微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(light chain 3，LC3)水平升高相關(guān)，但I(xiàn)R-β和LRP-1也在形成BBB的腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain capillary endothelial cells，BCEC)中表達(dá)，提示自噬可能參與破壞BBB[29]。

1.3 BBB誘導(dǎo)細(xì)胞自噬 一些病原菌或有害物質(zhì)損傷BBB時(shí)，BBB本身可能會(huì)通過某些途徑誘導(dǎo)自噬。B群鏈球菌(group BStreptococcus，GBS)感染期間，BBB內(nèi)皮細(xì)胞激活的自噬有助于限制內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)微生物的生長(zhǎng)和繁殖[30]。砷對(duì)于發(fā)育中的大腦具有神經(jīng)毒性，砷暴露可引起B(yǎng)BB通透性增加，Manthari等[31]在不同周齡小鼠的飲用水中加入不同劑量的三氧化二砷，發(fā)現(xiàn)TJ蛋白(Occludin、Claudin、ZO-1和ZO-2)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)及p62的mRNA表達(dá)水平明顯降低，Occludin蛋白表達(dá)水平明顯降低，Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5和Atg12的mRNA和蛋白表達(dá)水平升高；透射電鏡超微結(jié)構(gòu)分析顯示，在產(chǎn)后21 d和42 d，高劑量砷暴露小鼠的大腦皮質(zhì)和海馬出現(xiàn)自噬小體和空泡化軸突。以上結(jié)果表明，大腦皮質(zhì)和海馬中不完整的BBB可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路且以周齡依賴的方式促進(jìn)砷的轉(zhuǎn)移并誘導(dǎo)自噬。但BBB誘導(dǎo)的自噬是否有助于增強(qiáng)宿主細(xì)胞的防御作用尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。

2 缺血性腦損傷中自噬對(duì)BBB的作用

在缺血性腦損傷時(shí)發(fā)生的自噬對(duì)BBB發(fā)揮著雙重作用，包括保護(hù)作用和損傷作用，具體發(fā)揮哪種作用取決于自噬的發(fā)生情況、研究對(duì)象的患病情況以及對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行的基因編輯。

2.1 腦缺血再灌注損傷時(shí)誘導(dǎo)的BMECs自噬對(duì)BBB的保護(hù)作用 腦缺血再灌注(ischemia reperfusion，I/R)引起的BMECs損傷是BBB破壞的初始階段，可導(dǎo)致缺血性腦卒中患者預(yù)后不良。研究證實(shí)，缺血性腦卒中時(shí)的自噬BMECs具有保護(hù)作用[32]。例如，長(zhǎng)鏈非編碼RNA MALAT1可通過增強(qiáng)BMECs的自噬發(fā)揮保護(hù)BBB的作用，其機(jī)制是MALAT1直接與miR-26b結(jié)合，下調(diào)miR-26b的表達(dá)，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)miR-26b對(duì)BMECs自噬和存活的抑制作用，參與促進(jìn)miR-26b靶蛋白ULK2的表達(dá)[33]。Shi等[34]發(fā)現(xiàn)，沉默組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 9，HDAC9)基因可減輕腦卒中時(shí)的腦損傷，進(jìn)一步分析顯示，HDAC9可加重腦缺血再灌注損傷時(shí)的BMECs損傷。此外，研究人員進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，HDAC9能夠抑制自噬，且與內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙有關(guān)。上述結(jié)果表明，腦缺血再灌注損傷時(shí)沉默HDAC9基因可促進(jìn)自噬，這對(duì)BBB通透性具有保護(hù)作用。

2.2 缺血性腦損傷時(shí)自噬對(duì)BBB的損傷作用 自噬因氧和葡萄糖被剝奪而增強(qiáng)，BBB成分claudin-5被腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的自噬溶酶體降解，表明自噬能夠加重BBB損傷[15]。Wei等[35]基于自噬抑制功能恢復(fù)的觀察結(jié)果證實(shí)，糖尿病小鼠腦缺血期間自噬增強(qiáng)是導(dǎo)致BBB過度破壞的原因。在NF-JB p50基因敲除小鼠中觀察到自噬和BBB損傷增加，抑制自噬可逆轉(zhuǎn)這些現(xiàn)象，且自噬可調(diào)節(jié)核因子κB導(dǎo)致的缺血性神經(jīng)元和血管損傷[36]。

3 自噬在細(xì)菌感染BBB中的作用

3.1 自噬調(diào)節(jié)BBB細(xì)胞防御機(jī)制阻止GBS入侵和產(chǎn)毒 Cutting等[30]發(fā)現(xiàn)，GBS感染導(dǎo)致GFP-LC3點(diǎn)狀分布增加，內(nèi)源性LC3-Ⅱ和p62周轉(zhuǎn)水平增高，這是主動(dòng)自噬通量的兩個(gè)標(biāo)志性指標(biāo)，證實(shí)GBS感染可誘導(dǎo)自噬。感染GBS突變株實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GBS侵襲和GBS打孔β-溶血素/細(xì)胞溶素(β-hemolysin/cytolysin，β-h/c)能夠激活自噬，GBS腦膜炎小鼠模型進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)果，野生型GBS感染在腦組織中誘導(dǎo)的自噬水平高于β-h/c缺失突變體，使用ATG5敲除的成纖維細(xì)胞抑制自噬或siRNA介導(dǎo)的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human brain microvascular endothelial cells，hBMECs)自噬障礙都會(huì)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)GBS數(shù)量的恢復(fù)，然而，電鏡觀察結(jié)果顯示，盡管可見到GBS-LC3共定位，但在雙膜自噬結(jié)構(gòu)中僅能觀察到少量的GBS，表明雖然自噬可以調(diào)節(jié)BBB細(xì)胞防御阻止GBS入侵和產(chǎn)毒，但GBS能夠積極地阻止自噬途徑以促進(jìn)自身繁殖。

3.2 自噬在炭疽桿菌感染hBMECs中的作用 炭疽腦膜炎的發(fā)生是由于炭疽桿菌能夠穿越BBB，其感染主要取決于兩種炭疽毒素的表達(dá)，即致死毒素和水腫毒素。有研究發(fā)現(xiàn)，炭疽毒素的表達(dá)能夠誘導(dǎo)宿主hBMECs產(chǎn)生自噬，抑制炭疽桿菌在細(xì)胞內(nèi)的存活。因此，當(dāng)機(jī)體感染炭疽桿菌時(shí)，自噬在某種程度上起到免疫保護(hù)作用[37]。

3.3 自噬在大腸埃希菌K1感染hBMECs中的作用在大腸埃希菌K1侵襲hBMECs的過程中，hBMECs自噬水平增高可以降低細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的存活率。研究發(fā)現(xiàn)，煙草煙霧中的核心成分尼古丁可通過激活NF-κB和PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路來抑制大腸埃希菌K1感染誘導(dǎo)的hBMECs自噬，導(dǎo)致BBB受損，增高新生兒腦膜炎的發(fā)病率[38]。

4 自噬參與藥物、毒素穿越BBB而發(fā)揮作用

4.1 自噬參與藥物穿越BBB 細(xì)胞自噬是一種保守的依賴溶酶體的降解途徑，作為一種細(xì)胞保護(hù)機(jī)制，其在多種腫瘤細(xì)胞中可引起治療抗性[39-40]。研究發(fā)現(xiàn)，羥基氯喹可以抑制自噬過程中自噬體與溶酶體的結(jié)合，從而增強(qiáng)酪氨酸激酶抑制劑ZD6474的抗膠質(zhì)瘤作用。然而，ZD6474在體內(nèi)的非選擇性分布和羥基氯喹穿越BBB時(shí)的低穿透能力限制了其在膠質(zhì)瘤治療中的臨床應(yīng)用。研究人員將ZD6474和羥基氯喹共同包入R6dGR肽修飾的脂質(zhì)體(R6dGR peptide-modified liposomes，R6dGR-Lip)中，明顯提高了羥基氯喹穿越BBB的能力。因此，R6dGR-Lip負(fù)載羥基氯喹能夠更有效地阻斷膠質(zhì)瘤細(xì)胞的自噬通量，從而發(fā)揮ZD6474對(duì)膠質(zhì)瘤的治療作用[41]。紫外線吸收劑二苯甲酮-3(benzophenone-3，BP-3)是各種個(gè)人護(hù)理用品中使用最廣泛的化學(xué)物質(zhì)。研究表明，小鼠出生前暴露于BP-3(使用環(huán)境相關(guān)劑量)會(huì)損害自噬體和自噬相關(guān)因子，同時(shí)BP-3對(duì)BBB具有良好的滲透性，但是自噬在BP-3穿越BBB中的作用仍需要進(jìn)一步探討[42]。

4.2 自噬參與毒素穿越BBB T-2毒素是由多種真菌產(chǎn)生的單端孢霉烯族毒素之一，是食品和動(dòng)物飼料中常見的污染物，也存在于加工過的谷物產(chǎn)品中，具有神經(jīng)毒性作用。T-2毒素可在體內(nèi)通過BBB，引起腦損傷和垂體損傷。研究發(fā)現(xiàn)，在T-2毒素處理后，大鼠腦內(nèi)存在明顯的自噬現(xiàn)象，且垂體細(xì)胞凋亡明顯，表明T-2毒素的神經(jīng)毒性作用與其能夠穿越BBB以及自噬過程有關(guān)[43]。

5 自噬調(diào)節(jié)劑穿越BBB用于疾病的治療

5.1 自噬抑制劑穿越BBB用于疾病的治療 自噬是一種依賴于溶酶體降解和細(xì)胞存活的過程，由于其在DNA損傷中的作用而成為癌癥治療的新靶點(diǎn)[44]。研究表明，抑制自噬可以提高腫瘤細(xì)胞的放射敏感性[40,45-46]。目前，自噬抑制劑已被證實(shí)能夠提高放射性治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma，GBM)的療效[47]。然而由于BBB的存在，大多數(shù)自噬抑制劑并不能有效地使GBM患者受益。有研究發(fā)現(xiàn)，三氟拉嗪(trifluoperazine，TFP)能夠干擾溶酶體的酸化，抑制自噬。此外，TFP可抑制P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的表達(dá)，這可能有助于藥物進(jìn)入大腦和GBM中，從而發(fā)揮作用。此外，TFP治療削弱了放射治療后DNA損傷的修復(fù)，為TFP聯(lián)合放射治療GBM提供了理論依據(jù)[48-49]。

5.2 自噬誘導(dǎo)劑穿越BBB用于疾病的治療 研究人員設(shè)計(jì)并合成了Qu修飾的P-80穩(wěn)定AuPd核殼結(jié)構(gòu)(Qu@P-80@AuPd)，作為自噬誘導(dǎo)劑，其可加速清除細(xì)胞內(nèi)的β淀粉樣蛋白(amyloid-β，Aβ)，保護(hù)細(xì)胞免受Aβ誘導(dǎo)的損傷，并有效地通過BBB。因此，Qu@P-80@AuPd可能成為治療阿爾茲海默病的潛在自噬誘導(dǎo)劑[50]。此外，最近研究表明，自噬促進(jìn)劑雷帕霉素可作為治療阿爾茲海默病藥物的成分之一，能夠穿越BBB在病灶處發(fā)揮重要作用：可通過促進(jìn)細(xì)胞自噬加速Aβ和磷酸化Tau蛋白的降解，還可通過抑制NO的合成減輕阿爾茲海默病病灶的炎癥，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，在阿爾茲海默病的治療中發(fā)揮重要作用[51]。

6 總結(jié)與展望

自噬在BBB生理學(xué)和相關(guān)疾病中的重要作用逐漸受到關(guān)注，然而自噬在BBB中的確切生物學(xué)效應(yīng)和潛在機(jī)制尚未闡明，針對(duì)自噬對(duì)BBB受損后的修復(fù)治療策略仍然處于假設(shè)階段。近年來，細(xì)胞的自噬效應(yīng)引起了人們極大的興趣，越來越多的數(shù)據(jù)證實(shí)細(xì)胞自噬與BBB關(guān)系密切，兩者相互影響、相互作用。BBB可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，調(diào)節(jié)BBB相關(guān)細(xì)胞的損傷。腦缺血可導(dǎo)致細(xì)胞自噬的發(fā)生，細(xì)胞自噬適度激活有利于BBB相關(guān)細(xì)胞的修復(fù)，但是細(xì)胞自噬激活過度或不足亦可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，加重BBB損傷。同時(shí)，細(xì)胞自噬在防止病原體等有害物質(zhì)穿越BBB、加速藥物穿越BBB發(fā)揮作用等方面也起著重要作用。因此，合理利用自噬這把“雙刃劍”將有助于治療和預(yù)防BBB損傷相關(guān)的多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，并為腫瘤等疾病的治療提供新思路。