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    豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環(huán)病毒2型與弓形蟲(chóng)混合感染的診斷與預(yù)防

    2023-01-05 23:12:12吳曉曉萬(wàn)新軍俞進(jìn)段真真賈毅飛何宗霖
    飼料博覽 2022年4期
    關(guān)鍵詞:弓形蟲(chóng)圓環(huán)緩沖液

    吳曉曉,萬(wàn)新軍,俞進(jìn),段真真,賈毅飛,何宗霖

    (1.阿克蘇地區(qū)動(dòng)物疫病控制診斷中心,新疆 阿克蘇 843000;2.阿克蘇地區(qū)畜牧技術(shù)推廣中心,新疆 阿克蘇 843000)

    豬肉肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富,是日常生活中最為常見(jiàn)且重要的優(yōu)質(zhì)肉源。發(fā)展養(yǎng)豬業(yè)不僅能有效保障肉食品的供應(yīng),也可為農(nóng)民提供一條致富增收的途徑,從而推動(dòng)鄉(xiāng)村振興發(fā)展。目前,養(yǎng)豬業(yè)已成為了我國(guó)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的一大支柱產(chǎn)業(yè),也是我國(guó)農(nóng)業(yè)發(fā)展不可或缺的一部分。近些年,我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)由原來(lái)傳統(tǒng)的散養(yǎng)模式逐漸向規(guī)?;⒓s化的現(xiàn)代養(yǎng)殖模式轉(zhuǎn)變與發(fā)展,生豬的生產(chǎn)性能得到了快速的提高,但生豬疫病的種類及暴發(fā)頻率也逐漸增加,疫病混合感染已成為規(guī)?;i場(chǎng)疫病防控的一大難題。豬繁殖與呼吸綜合征是一種急性高接觸性傳染病,具有很高的發(fā)病率和死亡率,是生豬養(yǎng)殖中最為常見(jiàn)的疾病。豬圓環(huán)病毒病是一種免疫抑制性傳染病,主要損害生豬免疫系統(tǒng),造成其生產(chǎn)性能下降,易引發(fā)仔豬死亡,通常與豬呼吸與繁殖綜合征混合感染,兩種病原體在生豬體內(nèi)能相互促進(jìn)復(fù)制,從而降低了生豬的抗病能力,出現(xiàn)誘發(fā)繼發(fā)性感染,如感染弓形蟲(chóng)病、口蹄疫及豬流感等疫病,最終加大治愈難度和誘發(fā)更高的死亡率,給養(yǎng)豬場(chǎng)造成極大的危害。

    1 流行病學(xué)

    1.1 病原體

    豬繁殖與呼吸綜合征病毒屬于動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬,是一種單股正鏈RNA病毒,其基因組大小約為15 kb,有囊膜;病毒粒子呈圓形,直徑大小為50~60 nm;核衣殼的結(jié)構(gòu)為對(duì)稱的20面體,直徑為25~30 nm[1]。該病毒分為歐洲型和美洲型,兩種基因的同源性不超過(guò)60%,而氨基酸同源性78%~81%,在我國(guó)主要流行的是美洲型。該病毒對(duì)高溫較為敏感,56℃條件下加熱45 min便會(huì)完全失活,室溫及37℃以下均不能存活;該病毒最適生存pH值為5~7,其感染力最強(qiáng)[2]。另外,該病毒對(duì)常見(jiàn)的消毒劑敏感,低劑量的乙醚和氯仿便可將其殺死消滅。

    豬圓環(huán)病毒屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬,是一種是單股負(fù)鏈DNA病毒,基因組大小為1 758~2 001 bp,無(wú)囊膜;病毒粒子呈圓形,直徑為14~25 nm,核衣殼結(jié)構(gòu)為20面體,是已知的最小動(dòng)物病毒之一[3]。該病毒具有4種基因型,豬圓環(huán)病毒2型為其中致病性最強(qiáng)的類型,于19世紀(jì)90年代末在南美洲發(fā)現(xiàn)。該病毒可在豬腎細(xì)胞、豬睪丸細(xì)胞和豬肺泡巨噬細(xì)胞中增殖,損害生豬的免疫系統(tǒng),通常會(huì)引起仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬皮炎腎病綜合征、豬呼吸系統(tǒng)疾病綜合征及繁殖障礙性疾病[3]。該病毒對(duì)外界環(huán)境具有較強(qiáng)的抵抗力,對(duì)乙醚和氯仿的敏感性較低,常見(jiàn)的消毒劑不易將其殺死。

    弓形蟲(chóng)屬于球蟲(chóng)綱球蟲(chóng)目孢子蟲(chóng)科,體長(zhǎng)4~10 μm,是一種廣泛寄生在人和動(dòng)物體內(nèi)有核細(xì)胞內(nèi)的寄生性原蟲(chóng)。弓形蟲(chóng)的生殖包含有性生殖和無(wú)性生殖,其生活史包括5個(gè)階段,第一階段為滋養(yǎng)體期,滋養(yǎng)體在有核細(xì)胞內(nèi)快速分裂并占據(jù)宿主的細(xì)胞漿,形成假包囊;第二階段為緩殖子期,弓形蟲(chóng)在囊壁內(nèi)緩慢增殖形成包囊;第三階段為裂殖體期,緩殖子在動(dòng)物的小腸上皮細(xì)胞內(nèi)裂體增殖,形成裂殖子;第四階段為配子體期,配子受精形成合子,發(fā)育成卵囊;第五階段為子孢子期,卵囊內(nèi)的孢子體發(fā)育繁殖,形成2個(gè)孢子囊,每個(gè)孢子囊分化成4個(gè)子孢子。處于不同的發(fā)育階段,呈現(xiàn)不同的形態(tài),其滋養(yǎng)體和包囊均可使中間宿主和終末宿主感染發(fā)病[4]。

    1.2 傳播途徑

    豬繁殖與呼吸綜合征和豬圓環(huán)病毒病主要通過(guò)消化道和呼吸道進(jìn)行傳播。病豬和帶毒豬為直接傳染源,其排出的糞便、尿液及唾液等分泌物中含有大量的病毒,健康豬只通過(guò)接觸污染的飼料、飲用水、飼養(yǎng)工具、墊草及空氣均會(huì)感染。同時(shí),該病毒還可通過(guò)受精及胎盤進(jìn)行傳播。此外,該病毒還可以通過(guò)蚊蟲(chóng)、蒼蠅、蜱蟲(chóng)等進(jìn)行傳播。弓形蟲(chóng)病主要是由于生豬食入含有蟲(chóng)體的飼料或者飲用了含有生肉屑的泔水而發(fā)生感染。

    1.3 流行特點(diǎn)

    任何品種、任何年齡及任何性別的豬均可感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒,1月齡的仔豬及妊娠母豬感染率最高;該病呈地方流行性,往往急性發(fā)病,沒(méi)有明顯的季節(jié)性,但在蚊蠅滋生的季節(jié)發(fā)病率會(huì)更高。豬圓環(huán)病毒病各品種和各年齡的生豬均會(huì)感染,且6~12周齡的生豬最易感染;該病全年均會(huì)發(fā)生,但多發(fā)于夏季及秋季。豬弓形蟲(chóng)病任何品種和年齡的生豬均會(huì)感染,其中3~6周齡的仔豬和妊娠母豬發(fā)病率最高,而成年豬多呈隱形感染;該病主要發(fā)生在夏秋季節(jié)。通常情況下以上3種病原體均不易侵入生豬機(jī)體,但如果飼養(yǎng)管理不當(dāng)、環(huán)境衛(wèi)生較差、斷奶應(yīng)激或天氣驟變就會(huì)引發(fā)感染。

    2 臨床癥狀

    感染豬繁殖與呼吸綜合征的病豬主要表現(xiàn)為精神萎靡,食欲減退,發(fā)熱,咳嗽氣喘,呼吸困難。妊娠母豬出現(xiàn)體溫升高,食欲下降,精神不振,呼吸困難,流產(chǎn)、早產(chǎn)或產(chǎn)下死胎、弱胎,產(chǎn)后無(wú)乳,胎衣不下,以及產(chǎn)道分泌物增多,以后發(fā)情不正常,甚至出現(xiàn)繁殖障礙;產(chǎn)下的仔豬孱弱、發(fā)熱、呼吸困難、腹瀉嚴(yán)重,死亡率高達(dá)80%,而耐過(guò)仔豬多數(shù)會(huì)成為僵豬;種公豬配種能力下降,精子帶毒,且其數(shù)量減少、質(zhì)量下降,甚至出現(xiàn)畸形;育肥豬出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào),站立不穩(wěn),被毛粗亂,其耳部、尾部及腹部的皮膚發(fā)紺,有的會(huì)出現(xiàn)結(jié)膜炎。

    感染豬圓環(huán)病毒2型的病豬主要表現(xiàn)為食欲不振,精神萎靡,嗜睡,吻突干燥,流涕咳嗽,持續(xù)腹瀉,機(jī)體消瘦,四肢呈暗紅色,出現(xiàn)“接地紅”現(xiàn)象。

    感染弓形蟲(chóng)病的病豬主要表現(xiàn)為體溫升高至41℃以上,典型的腹式呼吸,呼吸急促,采食量下降,被毛雜亂無(wú)光澤,皮膚呈紫紅色的斑點(diǎn)或者紅色小點(diǎn),鼻腔流出泡沫樣鼻涕,排出帶血糞便,后軀無(wú)力,臥地不起。

    以上3種疫病混合感染后主要表現(xiàn)為精神不振,厭食至食欲廢絕,發(fā)熱,腹式呼吸且呼吸困難,咳嗽氣喘,嗜睡,被毛粗亂,四肢無(wú)力,站立不穩(wěn),流產(chǎn),早產(chǎn)或產(chǎn)死胎、弱胎,繁殖功能下降,耳部、尾部及四肢皮膚呈紫紅色發(fā)紺,腹部出現(xiàn)紅斑,混合感染會(huì)增加治療難度,死亡率可高達(dá)85%~100%。

    3 實(shí)驗(yàn)室診斷

    目前,豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環(huán)病毒2型病毒和弓形蟲(chóng)常采用血清學(xué)診斷方法和分子生物學(xué)診斷方法進(jìn)行確診,其中血清學(xué)診斷方法主要包括免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)、間接免疫熒光試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。

    免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)的原理是通過(guò)將抗原吸附在固相載體上,加入被檢樣品形成抗原抗體的復(fù)合物,然后再加入酶標(biāo)記的抗抗體,底物參與下顯色,并通過(guò)顯微鏡判斷結(jié)果。該方法的操作步驟如下:首先在無(wú)菌條件下采集病豬的血液,分離獲得血清,保證血清透明無(wú)污染不溶血,將血清依次按四倍比例稀釋,做好對(duì)照,然后分別取稀釋血清各50 μL加入固定診斷板中,封板,37℃孵育1 h后倒去板中液體,用洗板液清洗3次,每次清洗1~3 min,之后倒置吸附紙上吸干水分;隨后每孔加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗豬抗抗體50 μL,封板后37℃放置感作1 h;倒去板中液體,按上述的洗滌方法清洗3次,吸干水分;每孔再加入氨乙基咔唑50 μL,封板避光放置18~24℃條件下感作30 min,顯微鏡下觀察,若孔內(nèi)30%~50%的細(xì)胞間質(zhì)為深紅色,則說(shuō)明感染了豬繁殖與呼吸綜合征病毒。該方法存在一定的主觀性,有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)假陰性,不是特別適合大規(guī)模的檢測(cè)應(yīng)用。

    間接免疫熒光試驗(yàn)的原理是通過(guò)將抗原吸附在固相上,加入被檢細(xì)胞孵育結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物,再加入偶聯(lián)有熒光素分子的抗抗體,與細(xì)胞孵育結(jié)合后在熒光顯微鏡下觀察。具體操作步驟如下:無(wú)菌條件下采集病豬血液,分離血清,稀釋,加入固定板中,加入配好的固定液,室溫孵育10 min,棄液,用磷酸緩沖液清洗2次,每次5 min,再添加封閉液37℃靜置1 h;再用磷酸緩沖液清洗2次,每次5 min,用濾紙吸取多余的水分,隨后加入熒光標(biāo)記的兔抗豬抗體溶液,使其完全覆蓋樣本,放置搪瓷盒中37℃保溫處理30 min;再用磷酸緩沖液清洗2次,每次5 min,吸去多余水分,但樣本保持一定的濕度,滴入甘油,放置熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度,根據(jù)熒光強(qiáng)度判斷陽(yáng)性。該方法需要專業(yè)的檢測(cè)人員,且檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng),但具有較好的特異性和敏感性,目前在臨床上也較為常用。

    酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理是通過(guò)用特異性抗體包被于固相載體,經(jīng)洗滌后加入含有抗原的待測(cè)樣品,如待檢樣品中有相應(yīng)抗原存在即可與包被在固相載體上的特異性抗體結(jié)合,經(jīng)保溫孵育洗滌后,即可加入酶標(biāo)記特異性抗體,再經(jīng)孵育洗滌后,加底物顯色進(jìn)行測(cè)定,底物降解的量即為預(yù)測(cè)抗原的量。具體步驟如下:首先無(wú)菌條件下采集病豬血液,分離血清,4℃保存待檢;再用包被緩沖液稀釋特異性抗體球蛋白至最適濃度,每孔加入200 μL,4℃過(guò)夜;再用磷酸緩沖液洗滌3次,每次5 min,去除包被液,拋干;隨后取病豬血清,稀釋,加至孔中,37℃孵育1 h;再用含有吐溫的磷酸緩沖液洗滌3次,每次5 min,拋干;隨后加入200 μL酶標(biāo)抗體,37℃作用1~2 h(具體時(shí)間需要通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定);再用含有吐溫的磷酸緩沖液洗滌3次,每次5 min,拋干;加入200 μL底物溶液,室溫作用30 min,再加入2 mol·L-1檸檬酸50 μL以終止反應(yīng);最后用分光光度計(jì)測(cè)定OD值。該方法的靈敏性和特異性高,操作簡(jiǎn)單且快速,不要求特殊設(shè)備,成本較低,適合大范圍大批量的樣品檢測(cè),是目前使用最為廣泛的方法之一。

    分子生物學(xué)診斷方法是通過(guò)PCR手段進(jìn)行檢測(cè),主要包括RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)。RT-PCR具體操作步驟如下:首先根據(jù)Gen-Bank中公布的豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環(huán)病毒2型病毒和弓形蟲(chóng)的開(kāi)放閱讀框基因序列設(shè)計(jì)引物,然后根據(jù)相應(yīng)的DNA提取試劑盒提取總RNA,隨后構(gòu)建RT-PCR反應(yīng)體系,50℃逆轉(zhuǎn)錄30 min,94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,45℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min,再取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,擴(kuò)增目的片段,得到相應(yīng)片段說(shuō)明感染該病原體。qPCR是在RT-PCR的基礎(chǔ)上,通過(guò)增加熒光探針,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線可確定病毒感染量的大小。具體步驟如下:首先引物的設(shè)計(jì)和總RNA的提取過(guò)程和RT-PCR是一致的;然后根據(jù)相應(yīng)試劑盒構(gòu)建qPCR反應(yīng)體系,并構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線,反應(yīng)條件:42℃反轉(zhuǎn)錄5 min,95℃預(yù)變性10 s;95℃退火5 s,60℃延伸35 s,40個(gè)循環(huán)。以C值≤35并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線判定為陽(yáng)性。與其他方法比,該方法具有檢測(cè)組織多樣化、檢測(cè)速度快、靈敏度和特異性最高等特點(diǎn),同時(shí)還能區(qū)分高致病毒株和野生型毒株,也是目前使用最為廣泛的方法之一。

    此外,弓形蟲(chóng)的診斷還可以通過(guò)姬姆薩染色法。取病死豬肺部組織或淋巴結(jié)進(jìn)行涂片,通過(guò)姬姆薩染色,可觀察滋養(yǎng)體的形狀多樣,呈半月形、梨形或梭形,其一端略鈍,一端略尖,其核處于中央或者略微偏向鈍端,且被染成深藍(lán)色,則可確定感染弓形蟲(chóng)[4]。該方法操作簡(jiǎn)單,成本低廉,非常適合檢測(cè)急性弓形蟲(chóng)的感染;但該方法對(duì)檢測(cè)人員的專業(yè)要求較高,且發(fā)病豬如果采取了藥物治療,其體內(nèi)的弓形蟲(chóng)數(shù)量會(huì)減少,可能會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果具有一定的影響。

    4 預(yù)防措施

    第一,重視豬舍消毒及衛(wèi)生管理工作;及時(shí)清理欄舍糞污,定期對(duì)欄舍內(nèi)外和飼養(yǎng)工具進(jìn)行徹底的清洗及消毒,并做好防蟲(chóng)鼠、飛鳥(niǎo)措施,避免蟲(chóng)鼠滋生及隨意出入欄舍;同時(shí)欄舍需全封閉式管理,禁止外來(lái)人員及車輛進(jìn)出。第二,提供干燥、舒適的飼養(yǎng)環(huán)境;定期檢修水電氣設(shè)備,保障適宜的溫度、濕度,控制飼養(yǎng)密度,保證通風(fēng)效果良好。第三,均衡營(yíng)養(yǎng),合理飼喂;做好飼料管理,合理搭配飼料,定時(shí)定點(diǎn)飼喂,提供干凈、充足的飲水。第四,強(qiáng)化檢疫工作,及時(shí)進(jìn)行疫苗免疫;養(yǎng)殖過(guò)程中需實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)豬群健康動(dòng)態(tài)并做好記錄,根據(jù)當(dāng)?shù)匾卟×餍刑攸c(diǎn)及時(shí)制定并實(shí)施疫苗免疫,另外,對(duì)病豬及時(shí)隔離處理,必要時(shí)撲殺并無(wú)害化處理。

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