雞鏈球菌特異性產(chǎn)物與毒力基因的研究

趙洪君

（桓仁滿族自治縣農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 桓仁 117200）

雞鏈球菌病近年來已成為家禽養(yǎng)殖業(yè)面臨的重要禽傳染性疾病。研究表明，感染禽類的鏈球菌主要包括革蘭氏血清群C群獸疫鏈球菌、D群糞鏈球菌、類糞鏈球菌、堅忍鏈球菌和鳥鏈球菌。感染家禽往往出現(xiàn)以急性死亡、冠及肉髯蒼白、羽毛粗亂、腹瀉、癱瘓、產(chǎn)蛋率下降、蛋滯留等為主要臨床特征的疾病。剖檢主要表現(xiàn)為肝臟的病理變化，如肝臟腫大、變脆，表面出現(xiàn)出血點，同時可見脾臟腫大，腦膜出血，也有資料顯示會出現(xiàn)腹膜炎、輸卵管炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥和乳腺炎等病變。雞鏈球菌病在世界各地均有發(fā)生。

雞鏈球菌導(dǎo)致雞群發(fā)病，按照病情可分為急性型和慢性型。最近有研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)急性鏈球菌病臨床幾乎沒有前兆癥狀，會突然發(fā)生敗血癥而導(dǎo)致雛雞群病死率迅速升高，剖檢結(jié)果顯示嚴(yán)重的敗血癥病變，出現(xiàn)纖維素性心包炎、腦膜炎、脾多病灶性的纖維素樣壞死，肝炎、骨軟骨炎、肌炎、氣囊炎?；茧u出現(xiàn)水腫，主要存在于皮下、漿膜及肌肉，并且伴有黃色膠凍樣滲出物；心包及腹腔內(nèi)有滲出物，其呈現(xiàn)為漿液性、出血性或漿液纖維素性；肌肉有出血現(xiàn)象；肝臟呈暗紫色并且腫大，有時可見出血點、壞死點和肝周炎；脾臟呈圓球狀腫大，有時可見出血和壞死點；肺臟瘀血或水腫；氣管和支氣管表面有黏性分泌物，個別患雞喉頭有壞死灶，為干酪樣粟粒大小；腎臟腫大。也有患禽出現(xiàn)氣囊炎；產(chǎn)蛋雞出現(xiàn)卵黃性腹膜炎及卡他性腸炎，個別病例會出現(xiàn)腺胃黏膜出血，胃乳頭有膿性分泌物，肌胃角質(zhì)糜爛。慢性型主要發(fā)生關(guān)節(jié)炎、腱鞘炎，蛋雞輸卵管炎、卵黃性腹膜炎，以及心肌、肝臟、脾臟等實質(zhì)器官發(fā)生炎癥變性或梗死[1]。雞鏈球菌可以感染各種禽類及鳥類，通過糞便檢測發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖的火雞群中鏈球菌的檢出率達(dá)到100%，涉及到多個鏈球菌亞型，而且鏈球菌可以在家禽和鳥類間傳播[2]。

國內(nèi)禽類感染的鏈球菌主要是C群獸疫鏈球菌和D群糞鏈球菌。研究人員通過對河南省不同地區(qū)發(fā)病雞群13個鏈球菌分離株進(jìn)行生化分群試驗，發(fā)現(xiàn)雞鏈球菌病的病原主要是C群獸疫鏈球菌和D群糞鏈球菌[3]。

1 鏈球菌的特異性產(chǎn)物

1.1 黏附素

鏈球菌產(chǎn)生大量表面蛋白，能結(jié)合多種宿主胞外基質(zhì)蛋白（纖連蛋白、纖維蛋白原、膠原蛋白、玻連蛋白、層黏連蛋白、核心蛋白聚糖以及含有硫酸肝素的蛋白多糖），這些黏附素被稱為MSCRAMM（識別黏附基質(zhì)分子的微生物表面成分）。一些MSCRAMM，特別是結(jié)合纖維蛋白原的M蛋白，使鏈球菌細(xì)胞具有抗吞噬活性，其包被宿主蛋白以及可調(diào)理外源顆粒的血清蛋白識別（膠原樣凝集素）的蛋白，使鏈球菌細(xì)胞的補(bǔ)體活化位點被掩蓋（因此調(diào)理作用降低），從而使鏈球菌能避免被機(jī)體免疫系統(tǒng)識別吞噬。這類蛋白包括無乳鏈球菌的FbsA蛋白、G型類馬停乳鏈球菌亞種的FOG蛋白、馬鏈球菌獸疫亞種的Szp蛋白、化膿鏈球菌的透明質(zhì)酸莢膜、無乳鏈球菌的BibA蛋白等。

其他黏附素負(fù)責(zé)鏈球菌結(jié)合到宿主細(xì)胞。如F蛋白和其他蛋白質(zhì)（如Fnb和SFS）結(jié)合纖連蛋白，與細(xì)菌黏附和內(nèi)化相關(guān)。肺炎鏈球菌、馬鏈球菌馬亞種和馬鏈球菌獸疫亞種的PsaA（肺球菌表面黏附素）脂蛋白主要負(fù)責(zé)黏附上、下呼吸道內(nèi)壁的細(xì)胞。已經(jīng)有研究表明呼吸道內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)合蛋白E-cadherin是PsaA的一個受體。

1.2 莢膜

多糖莢膜是新生隱球菌最主要的毒性因子，與新生隱球菌逃避宿主免疫密切相關(guān)。某些鏈球菌產(chǎn)生莢膜，如常見感染雞的C群鏈球菌就產(chǎn)生莢膜。A群和C群鏈球菌莢膜具有相似性，均由透明質(zhì)酸組成，透明質(zhì)酸也是哺乳動物結(jié)締組織的構(gòu)成成分，抗原性差，不容易結(jié)合補(bǔ)體成分，可保護(hù)鏈球菌抵抗巨噬細(xì)胞的殺傷作用和補(bǔ)體介導(dǎo)的吞噬作用。敲除鏈球菌基因可導(dǎo)致菌體莢膜變小，最適生長溫度也發(fā)生了變化，可見雞鏈球菌莢膜與其致病性和毒性緊密相關(guān)。但B、E和G群鏈球菌的莢膜不是透明質(zhì)酸，而是多聚糖，但這類鏈球菌在雞鏈球菌中較少見。對于鏈球菌莢膜的研究多見于肺炎鏈球菌和豬鏈球菌，雞鏈球菌極少，需要進(jìn)一步深入研究。

1.3 細(xì)胞壁

雞鏈球菌為革蘭氏陽性菌，其細(xì)胞壁與其他革蘭氏陽性菌相似，也含有蛋白質(zhì)和多糖。研究發(fā)現(xiàn)革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域數(shù)量也不是很多，其中出現(xiàn)次數(shù)不小于2次的結(jié)構(gòu)域只有高度保守的N端親水性結(jié)構(gòu)域和調(diào)控鐵元素表面蛋白的特異性保守結(jié)構(gòu)域[4]。N端親水性結(jié)構(gòu)域?qū)Φ鞍踪|(zhì)的翻譯和定位起著重要作用。革蘭氏陽性細(xì)菌中攝取血紅素的最佳系統(tǒng)是lsd系統(tǒng)，在lsd系統(tǒng)中細(xì)胞壁作為受體將與血紅素結(jié)合，在細(xì)胞壁中發(fā)揮主要作用的就是調(diào)控鐵元素表面蛋白的特異性保守結(jié)構(gòu)域[5]。革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁的脂磷壁酸和肽聚糖與巨噬細(xì)胞相互作用，導(dǎo)致釋放促炎細(xì)胞因子。

1.4 化膿鏈球菌毒素超抗原

常見的超抗原同時結(jié)合MHCⅡ類分子和帶有特定V-β區(qū)的T細(xì)胞受體分子，這種結(jié)合導(dǎo)致抗原遞呈細(xì)胞和T細(xì)胞活化，隨之全系統(tǒng)釋放高水平的細(xì)胞因子。鏈球菌感染所引發(fā)的部分系統(tǒng)性癥狀來自毒素引發(fā)的大規(guī)模的T細(xì)胞的活化，最清楚的是化膿性鏈球菌（A群鏈球菌）產(chǎn)生的化膿鏈球菌毒素超抗原（Superantigen，SPE）引發(fā)的T細(xì)胞活化。化膿性鏈球菌產(chǎn)生若干種SPE：SPEA、SPEC、SPEG、SPEH、SPEI、SPEJ、SPEK、SPEL、SPEM、SSA和鏈球菌有絲分裂源外毒素Z（SMEZ），除了SMEZ、SPEG和SPEJ之外，其余的都位于可移動的DNA元件，化膿性鏈球菌各分離株通常均攜帶SMEZ、SPEG和SPEJ的基因，可與其他SPE基因發(fā)生多種組合。已表明馬鏈球菌馬亞種能產(chǎn)生SPE，包括SeeI、SeeL和SeeM，這些都可以刺激馬外周血單核細(xì)胞增殖。這些SPE是前噬菌體編碼的，在馬鏈球菌獸疫亞種中已經(jīng)鑒定出3種SPE：SzeF、SzeN和SzeP，已表明也能刺激馬外周血單核細(xì)胞增殖，產(chǎn)生α腫瘤壞死因子（TNF-α）和γ干擾素（IFN-γ）。

1.5 溶血毒素

鏈球菌產(chǎn)生大量潛在毒力因子蛋白，鏈球菌溶血毒素就是其中之一。鏈球菌溶血毒素是A群鏈球菌產(chǎn)生的一種外毒素，根據(jù)其在有氧條件下的穩(wěn)定性分為氧-不穩(wěn)定型（O）和氧-穩(wěn)定型（S）溶血素，它們還原細(xì)胞裂解素，可裂解嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血小板。溶血素S是導(dǎo)致β溶血綿羊血瓊脂平板大范圍β-溶血的原因。溶血素S溶細(xì)胞譜廣，包括紅細(xì)胞膜、白細(xì)胞膜、血小板、組織培養(yǎng)細(xì)胞和亞細(xì)胞器，如溶酶體和線粒體。而溶血素O包括氧不穩(wěn)定且硫醇激活的溶血素、鏈球菌溶血素O與豬鏈球菌溶血素O，溶血素O常結(jié)合靶細(xì)胞膜內(nèi)膽固醇，在靶細(xì)胞膜上或者膜內(nèi)發(fā)生寡聚作用，形成疏水性蛋白復(fù)合物，與親水性通道在膜內(nèi)整合，形成較大的孔徑（達(dá)到30 nm），從而破壞機(jī)體正常細(xì)胞。

1.6 鏈激酶

鏈激酶（Streptokinase，SK）是由A、C、G群鏈球菌中溶血性鏈球菌分泌的一種異質(zhì)性纖溶酶原（Plasminogen，Pg）激活蛋白，屬于胞外非酶蛋白質(zhì)，是由三個結(jié)構(gòu)域組成的毒力因子：SKα/SKβ/SKγ，其作用于宿主蛋白，包括纖維蛋白，能減少血栓。鏈激酶不能直接使纖溶酶原激活，而是和Pg形成等分子復(fù)合物，使纖溶酶原發(fā)生構(gòu)象改變，從而暴露出活性部位。該活性部位催化纖溶酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶（plasmin，Pm），從而溶解血栓。研究發(fā)現(xiàn)SK的1~59個氨基酸殘基通過非蛋白水解機(jī)制調(diào)節(jié)其在結(jié)合的Pg中誘導(dǎo)活性位點的能力，并以非纖維蛋白依賴性的方式激活底物Pg[6]。研究SK的a區(qū)域的作用時發(fā)現(xiàn)，SK的該區(qū)域能激活Pg中的谷氨酸（glutamic acid，Glu）、賴氨酸（lysine，Lys）及Pm的Lys熒光素標(biāo)記，進(jìn)一步揭示了SK的分子機(jī)制[7]。

2 毒力基因的調(diào)控

目前研究發(fā)現(xiàn)，至少有三個系統(tǒng)調(diào)節(jié)化膿性鏈球菌毒力相關(guān)基因的表達(dá)：第一個是未知的“生長階段相關(guān)信號”，但某些基因在靜止期上調(diào)（包括編碼鏈球菌溶血素S和DNA酶的基因），而其他基因，包括編碼莢膜、鏈激酶、鏈球菌溶血素O和A群鏈球菌的多基因調(diào)控子基因（Mga）在指數(shù)生長后期上調(diào)。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)的活化和抑制實現(xiàn)調(diào)節(jié)，主要調(diào)節(jié)蛋白包括：Mga，負(fù)責(zé)在指數(shù)生長期激活表達(dá)涉及黏附、內(nèi)化和免疫逃避的基因；RofA樣蛋白，包括ROFA和NRA，調(diào)節(jié)涉及持續(xù)感染的基因；FasA，涉及毒力基因在生長周期的表達(dá)；Rgg（RopB），激活胞外蛋白的表達(dá)，如SpeB半胱氨酸蛋白酶。Mga自身受生長周期及其他未知環(huán)境因素的影響。CovRS（毒力的控制）雙組分調(diào)控系統(tǒng)直接或間接調(diào)節(jié)15%的基因組。若干重要的毒力基因的表達(dá)直接受CovR應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)節(jié)，包括透明質(zhì)酸莢膜操縱子、鏈球菌溶血素S、鏈激酶編碼基因、speB和sda。

大多數(shù)與獸醫(yī)有關(guān)的鏈球菌共生于上呼吸道、消化道和下生殖道。鏈球菌通過呼吸、性和先天性傳播，以及接觸性傳播。鏈球菌主要引起皮膚、呼吸道、生殖道、臍部和乳腺的化膿性感染，原發(fā)感染后通過血行播散可能導(dǎo)致敗血癥。在臨床上，鏈球菌病通常以發(fā)熱、單獨或聯(lián)合敗血癥為特征[8]，常見繼發(fā)毒血癥和免疫介導(dǎo)性疾病?；静±磉^程類似于葡萄球菌感染，病灶有膿液排出，排膿受阻的地方形成膿腫，典型病灶為炎癥反應(yīng)性膿腫，在膿腫中存在宿主細(xì)胞碎片和活菌、死菌，鏡檢可見完整的白細(xì)胞和纖維蛋白絲圍繞著膿液，若不及時排膿會逐漸形成纖維素性囊。健康個體可能攜帶上述所有鏈球菌，許多感染可能是內(nèi)源性的，與應(yīng)激有關(guān)。針對雞鏈球菌的報道目前多集中在防治方面，病原分子生物學(xué)特性、致病機(jī)理等深入研究未見報道，可能和雞鏈球菌病涉及到的鏈球菌種類繁多有關(guān)，但這些鏈球菌有很多共性，而且常見感染雞并引起嚴(yán)重后果的多為C群獸疫鏈球菌和D群糞鏈球菌，針對性深入研究將有助于雞鏈球菌病的防控。