骨形態(tài)發(fā)生蛋白15調控卵泡發(fā)育及與生殖內分泌疾病的關系

陳明麗，趙曉麗，馮偉華，夏天

卵泡的發(fā)育是涉及神經、內分泌等多種因素的高度協調過程，其發(fā)育異常參與了多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）、早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）等生殖內分泌疾病的發(fā)生[1-2]。近年來卵巢局部產生的細胞因子對卵巢功能的調節(jié)作用逐漸受到關注，這些細胞因子通過自分泌和（或）旁分泌的形式介導卵泡微環(huán)境中顆粒細胞與卵母細胞之間的交流對話，促進卵泡發(fā)育、顆粒細胞增殖分化，尤其在卵泡生長早期起著重要的作用。骨形態(tài)發(fā)生蛋白15（bone morphogenetic protein 15，BMP15）作為卵母細胞分泌因子（oocytesecreted factor，OSF）以旁分泌的形式廣泛參與卵泡發(fā)育、顆粒細胞增殖與凋亡、類固醇生成、排卵以及黃體化等過程[3-4]。BMP15可促進卵母細胞發(fā)育成熟，促進顆粒細胞增殖和分化，調控卵泡閉鎖，并參與多種生殖內分泌疾病的發(fā)生。因此，現對BMP15調節(jié)卵泡發(fā)育的機制及與相關生殖內分泌疾病的最新研究進展進行綜述。

1 BMP15的結構與表達

BMP15又稱為生長分化因子9B（growth differentiation factor 9B，GDF9B），屬于BMP家族（BMPs）的一員。BMP15基因（OMIM 300247）定位于人X染色體的Xp11.2，由2個編碼蛋白的外顯子和1個非編碼的內含子構成，被認為是首個卵巢決定基因。BMP15蛋白以前肽前體的方式合成，隨后以同源或異源二聚體的形式加工和分泌。BMP15先被翻譯為包含1個氨基（N）端信號肽，1個前結構域和1個羧基（C）端成熟結構域的前體蛋白，在去除信號肽后，前體蛋白發(fā)生二聚化并在保守的蛋白酶水解位點（RXXR）被前轉化酶進一步切割，最終形成成熟的二聚化功能蛋白并分泌至卵泡液中。由于缺乏共價鍵連接的半胱氨酸殘基，BMP15主要以同二聚體或異二聚體的形式發(fā)揮作用。研究表明，BMP15與其高度同源的GDF9以非共價鍵連接的形式形成異二聚體“cumulin”，在調控顆粒細胞功能與改善卵母細胞質量方面發(fā)揮重要作用[5]。

BMP15高表達于生長期的卵母細胞，其表達量有物種和時空差異。在人類，BMP15在胚胎時期的始基卵泡階段即開始表達，并一直持續(xù)到排卵前。此外，BMP還表達于顆粒細胞和間質細胞[6]。

2 BMP15參與的信號通路

BMP15主要依賴于經典的Smad信號通路發(fā)揮功能。BMP15以成熟的二聚體形式首先在顆粒細胞膜表面與2種特定組合的跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結合，即Ⅱ型受體骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體2（bone morphogenetic protein receptor type Ⅱ，BMPR2）與Ⅰ型受體激活素受體樣激酶6（activin receptor-like kinase 6，ALK6），隨即磷酸化細胞內轉錄因子Smad1/5/8，并最終與Smad4形成一個三聚體復合物易位至細胞核，通過與特定轉錄因子相互作用共同活化或抑制下游基因的表達。除了經典的Smad信號通路，許多非Smad依賴性通路也參與BMP15信號的活化。如絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）通路，主要涉及細胞外信號調節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、Jun氨基末端激酶（Jun N-terminal kinase，JNK）和p38/MAPK等信號分子，不同信號通路之間的串擾共同形成一個BMPs信號網絡，共同調節(jié)卵泡的發(fā)育與閉鎖。

3 BMP15的生理功能

3.1 促進卵母細胞發(fā)育BMP15促進卵母細胞的發(fā)育、成熟，并改善后續(xù)胚胎發(fā)育。研究表明，在牛卵母細胞體外成熟（in vitro maturation，IVM）期間，添加BMP15可顯著提高卵母細胞發(fā)育潛能，增加成熟卵母細胞的數量，并能提高后續(xù)卵裂率及囊胚質量，促進胚胎發(fā)育[7-9]。Dey等[10]認為BMP15協同GDF9不僅能促進卵母細胞核與細胞質成熟，還能防止透明帶硬化，促進正常受精并改善胚胎發(fā)育。

BMP15通過協同雙調蛋白（amphiregulin）、上調卵丘擴張相關基因的表達，促進卵母細胞代謝及營養(yǎng)供應，提高卵母細胞發(fā)育潛能。雙調蛋白作為表皮生長因子樣肽的一種，能夠促進卵母細胞減數分裂恢復，促進卵母細胞成熟。卵母細胞的發(fā)育離不開擴張卵丘細胞的營養(yǎng)供應，卵丘細胞由顆粒細胞分化而來，其包繞在卵母細胞周圍并與卵母細胞緊密接觸，調控卵母細胞的生長發(fā)育。研究表明，BMP15與雙調蛋白相互作用，可促進代謝物從卵丘細胞的間隙連接轉移到卵母細胞，從而增強卵母細胞的發(fā)育潛能[11]。此外，BMP15還可通過上調透明質酸酶2（hyaluronan synthase 2，HAS2）、腫瘤壞死因子α誘導蛋白6（tumor necrosis factor alpha-induced protein 6，TNFAIP6）與前列腺素合成酶2（prostaglandinendoperoxide synthase 2，PTGS2）等基因的表達促進卵丘細胞擴張，擴張的卵丘細胞通過增強卵母細胞所需的營養(yǎng)供應，促進卵母細胞減數分裂成熟，提高卵母細胞質量[12]。此外，BMP15可作為預測卵母細胞成熟的指標[13]。

3.2 促進顆粒細胞增殖分化體外實驗已證實BMP15可促進顆粒細胞的增殖分化，具有促有絲分裂的作用[14]。BMP15可通過Smad和非Smad途徑上調卵泡刺激素受體（follicle -stimulating hormone receptor，FSHR）的表達，增加顆粒細胞對卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）的敏感性，從而促進顆粒細胞的增殖分化。一方面，BMP15通過磷酸化Smad1/5/8，增加FSHR啟動子區(qū)域的組蛋白乙?；{控其染色質結構，使其更易被轉錄因子上游刺激因子1/2（upstream stimulatory factors 1 and 2，USF1/2）結合；另一方面，BMP15還可通過激活非經典的p38/MAPK通路直接上調FSHR的關鍵轉錄因子USF1/2[15]。

此外，BMP15可通過Kit配體及其受體（Kit ligand receptor，c-kit）信號介導卵母細胞與顆粒細胞之間的交流，促進顆粒細胞增殖。BMP15可直接刺激顆粒細胞中Kit配體的表達，同時與卵母細胞表達的c-kit信號相互作用，通過促進顆粒細胞的有絲分裂促進顆粒細胞增殖。顆粒細胞表達的Kit配體可與卵母細胞表面的c-kit結合，以抑制卵母細胞中BMP15的分泌。因此BMP15與Kit配體的負反饋系統可介導卵母細胞與顆粒細胞之間的交流，并能夠促進顆粒細胞增殖分化，在卵泡發(fā)生早期起著重要的作用[16]。

3.3 抑制卵泡凋亡卵泡凋亡是卵泡閉鎖的內在機制，卵泡閉鎖在卵泡發(fā)育的任何階段均可發(fā)生，是卵泡的一種退化過程，對維持和調控卵泡內環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要的作用。在哺乳動物中，絕大部分的卵泡均會發(fā)生閉鎖，只有不到1%的卵泡發(fā)育為優(yōu)勢卵泡并最終排卵。一般認為，卵泡閉鎖始于顆粒細胞凋亡，促凋亡因子與促生存因子之間的微妙平衡決定著卵泡最終的命運。

體外實驗證明，BMP15具有抗卵丘細胞凋亡的作用[17]。卵丘細胞是一種特殊的顆粒細胞，其圍繞在卵母細胞周圍并向其輸送生存所需營養(yǎng)物質及代謝物，卵丘細胞凋亡導致卵母細胞代謝受損、發(fā)育停滯和卵泡閉鎖。BMP15可以通過上調抗凋亡因子B細胞淋巴瘤2（B cell lymphoma 2，Bcl-2）、下調促凋亡因子B細胞淋巴瘤2相關X蛋白（Bax）的表達，抑制卵丘細胞凋亡，促進顆粒細胞生存[17]。自殺相關因子（factor associated suicide，Fas）/Fas配體（Fas ligand，FasL）是介導顆粒細胞凋亡的主要信號通路，BMP15能通過趨化因子配體2（chemokine ligand 2，CCL2）介導的Fas/FasL通路抑制豬卵丘細胞的凋亡，其還可通過抑制凋亡相關基因原纖維蛋白1（fibrillin1，FBN1）的表達促進卵丘細胞增殖[18]。叉頭框蛋白O1（forkhead box O1，FOXO1）作為顆粒細胞凋亡效應物，在氧化應激條件下可顯著增強顆粒細胞凋亡率。研究表明，BMP15可能通過下游Smad4信號抑制顆粒細胞中FOXO1的表達，從而起到抗顆粒細胞凋亡的作用[19]。

3.4 調節(jié)類固醇激素生成BMP15可抑制孕酮的過早產生，預防卵泡過早黃體化。過早黃體化是輔助生殖領域中的熱點問題。臨床上為了實現多卵泡發(fā)育，高劑量FSH的使用可通過刺激相關酶的活性，如3β-羥基類固醇脫氫酶（3 β-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD/HSD3B1），促進孕烯醇酮轉化為孕酮，造成孕酮的過早升高[20]，導致過早黃體化的發(fā)生。BMP15可通過下調FSHR，阻礙相關FSH依賴性基因，如P450側鏈裂解酶（P450 side chain cleavage enzyme，P450scc/CYP11A1）、3β-HSD/HSD3B1 和LH受體（luteinizing hormone receptor，LHR）的表達，從而抑制FSH誘導的孕酮過早產生[21]，有利于防止種植窗前移，保證胚胎發(fā)育與子宮內膜容受性的同步，促進胚胎植入和妊娠維持。類固醇生成急性調節(jié)蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，StAR）作為膽固醇轉化為孕烯醇酮的關鍵酶，是黃體化的重要標志。Chang等[22]認為BMP15可以通過ALK3介導的Smad1/5/8通路下調StAR的表達，降低孕酮的產生，在卵泡發(fā)育的晚期階段抑制卵泡過早黃體化。

此外，BMP15還參與雌激素的調節(jié)。BMP15可通過下游Smad4信號，促進FSH誘導的類固醇生成關鍵調節(jié)因子CYP11A1的表達，從而誘導雌二醇（estradiol，E2）的產生[23]。CYP19A1是將雄烯二酮轉化為E2的關鍵芳香化酶，是E2合成中關鍵的類固醇調節(jié)因子，參與FSH誘導的卵泡中E2的產生。Shimizu等[15]研究表明，BMP15可通過增加FSHR上調CYP19A1的表達，從而提高E2的水平。

4 BMP15與生殖內分泌疾病的關系

4.1 PCOSPCOS是一種涉及生殖、內分泌和代謝的終身性疾病，影響多達17%的育齡期女性，是無排卵性不孕的主要原因[24]。近年研究表明PCOS患者卵泡液中BMP15的表達降低，可能通過誘導顆粒細胞凋亡導致PCOS患者的卵泡發(fā)育不良，推測PCOS的發(fā)病與遺傳和環(huán)境因素關系密切，卵泡微環(huán)境異?？赡苡绊懧雅莅l(fā)育[1]。

卵泡異常閉鎖尤其是早卵泡期卵泡的發(fā)育停滯是PCOS患者卵泡發(fā)育的典型特征[25]。Wei等[26]采用免疫組織化學方法分析PCOS女性與正常排卵女性卵巢組織中BMP15蛋白表達的差異，發(fā)現與正常排卵女性相比，PCOS女性卵巢組織中始基卵泡、初級卵泡和次級卵泡的顆粒細胞與卵母細胞的BMP15含量顯著降低，而排卵前卵泡的BMP15含量卻與正常排卵女性相當，鑒于BMP15具有調節(jié)早卵泡期卵泡發(fā)育及閉鎖的作用，認為BMP15表達下降可能參與介導PCOS患者早卵泡期卵泡發(fā)育不良。上調BMP15的表達可通過增加促生存因子Bcl-2、降低促凋亡因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的表達，防止卵泡過度凋亡，從而對PCOS患者具有潛在治療作用[1]。

已有研究表明，BMP15的基因突變參與PCOS發(fā)病。Liu等[27]對216例中國PCOS患者進行BMP15的編碼區(qū)突變分析發(fā)現，與200例生育力正常的健康對照組女性相比，PCOS患者的BMP15中顯示了5個新的錯義突變（c.34C＞G、c.109G＞C、c.169C＞G、c.288G＞C和c.598C＞T）。Mehdizadeh等[28]對70例伊朗PCOS患者的BMP15基因進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR），基因測序發(fā)現PCOS患者BMP15基因的外顯子1存在2種突變體（BMP15基因5′非編碼區(qū)啟動子區(qū)域中的c.-9C＞G和BMP15基因外顯子編碼區(qū)中的c.A308G）。因此認為BMP15與PCOS的發(fā)病密切相關，其表達下降可能通過影響早卵泡期的卵泡發(fā)育參與PCOS的發(fā)生。

4.2 POIPOI是一種女性在40歲之前出現的卵巢功能減退現象，影響1%～2%的女性。POI患者卵巢中卵子的質量與數量顯著降低，臨床多表現為月經稀發(fā)或閉經，伴隨FSH升高和雌激素不足。POI病因復雜，可歸因于自身免疫、病毒感染、遺傳和醫(yī)源性因素等，遺傳變異在POI的發(fā)病中起關鍵作用[29]。BMP15作為卵泡微環(huán)境中重要的生長因子，其突變與POI的發(fā)生密切相關，其可通過調節(jié)卵泡凋亡及始基卵泡的激活改善女性卵巢儲備力。

BMP15的基因突變介導POI的發(fā)生。母豬基因敲除實驗表明，敲低BMP15基因可導致卵巢大小及卵泡數量顯著減少，導致卵巢功能減退[30]。Di Pasquale等[31]運用PCR技術對患有卵巢功能衰竭的兩姐妹進行候選基因篩查，首次報道了BMP15基因（p.Y235C）的雜合錯義突變可能介導POI的發(fā)生。這種位于BMP15第2個外顯子上的基因突變可導致前體蛋白的異常加工，并可能通過損害BMP15對顆粒細胞的促有絲分裂作用，導致顆粒細胞增殖減退，介導POI的發(fā)病。Rossetti等[32]認為BMP15基因前區(qū)和成熟肽中的雜合錯義突變可能干擾BMP15與GDF9形成的異二聚體“cumulin”的活性，導致卵泡耗竭率增加，從而誘發(fā)POI。Afkhami等[33]采用直接測序法對24例伊朗POI婦女進行BMP15基因檢測，篩選發(fā)現了新的p.N103K 和p.M184T突變，這2種突變均編碼BMP15的前結構域，與繼發(fā)性閉經、FSH升高和卵巢萎縮等表現密切相關。此外，還有研究揭示了POI與BMP15基因突變的相關性。Ferrarini等[34]在1例POI女性中篩選出了BMP15基因的新雜合突變c.406G＞C（V136L）。Santos等[35]發(fā)現BMP15:c.852C＞T中變異的基因型CT和TT可能是POI發(fā)生的危險因素。

卵子發(fā)生障礙、凋亡加速和始基卵泡的加速耗竭是POI發(fā)生的根本原因。顆粒細胞凋亡可導致卵母細胞賴以生存的生長因子、營養(yǎng)及代謝物質減少，阻滯卵母細胞發(fā)育，誘導卵母細胞凋亡。BMP15可通過抑制顆粒細胞凋亡，促進卵子發(fā)育成熟，調控卵巢儲備。在哺乳動物中，始基卵泡的數量決定卵巢儲備力，始基卵泡的過度激活或加速丟失可能加快原始卵泡池的耗竭，導致卵巢儲備功能下降。BMP15可通過調節(jié)始基卵泡激活所需的磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）信號調控卵巢儲備功能。此外，Park等[36]的研究表明，卵巢內BMP15的表達與女性年齡呈負相關，是預測卵巢儲備功能和生殖衰老的潛在分子。因此基于BMP15與POI的相關性，BMP15有望作為臨床上診治POI的相關生物靶點。

5 結語

BMP15對卵母細胞發(fā)育成熟、顆粒細胞增殖分化、卵泡閉鎖以及類固醇激素的調節(jié)具有重要的作用。BMP15的表達降低或基因突變與PCOS、POI等多種生殖內分泌疾病密切相關。然而PCOS、POI等均為多基因影響的疾病，單一靶點突變尚不能充分解釋所有的臨床病理改變，因此未來可采用全外顯子測序等方法，以篩選BMP15與相關其他基因突變共同介導疾病發(fā)生的可能性。此外，現有的針對BMP15基因突變的臨床研究存在樣本量小、缺乏可重復性及通用性的問題。未來可進一步開展大樣本量及多中心的隨機對照研究，以明確BMP15在相關生殖疾病中的確切作用機制?？傊?，了解BMP15在卵泡發(fā)生過程中的作用及參與相關生殖內分泌疾病的發(fā)生機制不僅有利于促進其成為相關診療靶點，還能為臨床上一些高危人群的遺傳咨詢以及生育力保存提供重要理論依據。