單個核細胞在生殖系統(tǒng)疾病治療中的應(yīng)用

高景悅，于璇，臧朝雯，鄧曉惠

單個核細胞（mononuclear cells，MNCs）是指血液中具有單個圓形核的細胞群，可通過Ficoll-Paque密度梯度離心法去除多核細胞和紅細胞等不同密度的細胞組分獲得。既往通常將收集MNCs作為研究單核細胞、淋巴細胞、自然殺傷（natural killer，NK）細胞及樹突狀細胞等免疫細胞特性的前提步驟[1]，隨著細胞療法的發(fā)展，MNCs中豐富的免疫細胞種類、干細胞特性、多細胞群間的協(xié)同作用以及相對容易的收集方法使其在治療炎癥相關(guān)疾病及損傷性疾病方面展現(xiàn)了獨特的優(yōu)勢和廣闊的應(yīng)用空間。根據(jù)來源不同，MNCs主要分為臍帶血單個核細胞（umbilical cord blood mononuclear cells，UCBMNCs）、骨髓單個核細胞（bone marrow mononuclear cells，BMMNCs）和外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMNCs）。在生殖系統(tǒng)領(lǐng)域，MNCs在治療卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）、宮腔粘連以及反復(fù)種植失?。╮epeated implantation failure，RIF）方面已開展了相關(guān)研究。現(xiàn)就MNCs在女性生殖系統(tǒng)疾病治療中的應(yīng)用進展進行綜述。

1 MNCs臨床應(yīng)用特點

1.1 UCBMNCsUCBMNCs是不成熟的免疫細胞、造血干細胞/祖細胞、間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）和內(nèi)皮祖細胞等組成的細胞群體，其來源廣泛，提取分離過程無創(chuàng)且安全，不存在倫理問題。與BMMNCs相比，UCBMNCs中不成熟的免疫細胞抗原提呈能力及反應(yīng)性低，具有低免疫原性。移植同種異體臍帶血移植物抗宿主?。╣raft-versushost disease，GVHD）的發(fā)生率低，具有良好的臨床安全性[2]。UCBMNCs在心肌缺血、皮膚損傷、腎損傷及神經(jīng)系統(tǒng)疾病中均展現(xiàn)了良好的組織修復(fù)和功能恢復(fù)作用。

1.2 BMMNCsBMMNCs 富含造血干細胞和MSCs，還有組織特異性祖細胞和基質(zhì)細胞等，可分泌多種促進損傷組織修復(fù)的生長因子，在治療疾病方面較單一種類干細胞能夠發(fā)揮更好的協(xié)同作用[3]。在臨床研究中，用于移植的BMMNCs多來源于受試者自身，獲取方便，可有效避免GVHD的發(fā)生。盡管自體BMMNCs移植在心肌缺血損傷、肢體缺血、股骨頭壞死及神經(jīng)系統(tǒng)病變等疾病中均顯示出良好的治療效果，但有研究表明，供體年齡增加可通過影響自噬對BMMNCs的旁分泌作用產(chǎn)生負面效果，從而限制了損傷組織的修復(fù)[4]，提示BMMNCs的治療效果可能因供體年齡增加而降低。此外，BMMNCs采集步驟較為復(fù)雜，操作對供者創(chuàng)傷較大，限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。

1.3 PBMNCsPBMNCs富含淋巴細胞、單核細胞和巨噬細胞，還有少量造血干細胞、內(nèi)皮祖細胞及MSCs等干細胞群體，但干細胞比例小于0.1%。經(jīng)重組人粒細胞集落刺激因子（granulocyte colonystimulating factor，G-CSF）動員的PBMNCs中干細胞比例明顯增加，且具備成體干細胞的特點。與BMMNCs相比，PBMNCs的收集方法操作較簡便，對供者創(chuàng)傷小且更安全[5]。獲取的便利性也便于PBMNCs的重復(fù)收集，增加細胞數(shù)量，以利于臨床應(yīng)用。

2 MNCs作用機制

在生殖系統(tǒng)疾病中，MNCs治療作用的發(fā)揮可能與抑制細胞凋亡、促進損傷組織的干細胞分化和增殖、促進新生血管形成和調(diào)節(jié)局部免疫微環(huán)境有關(guān)[6-8]。而細胞歸巢和分泌與旁分泌作用可能是其發(fā)揮以上作用的基礎(chǔ)。

2.1 歸巢作用MNCs在發(fā)揮作用前需要先歸巢至受損區(qū)域。趨化因子基質(zhì)細胞衍生因子1（stromal cell derived factor 1，SDF1）及其受體CXCR4在歸巢過程中起到了關(guān)鍵作用。體內(nèi)出現(xiàn)缺血或炎癥部位后，組織損傷處缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor-1 alpha，HIF-1α）生成增加，誘導(dǎo)SDF1的表達，SDF1釋放入血后，表達CXCR4的MNCs在SDF1濃度梯度誘導(dǎo)下歸巢至組織損傷區(qū)域[9]，從而發(fā)揮作用。在早衰的卵巢組織中可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)靜脈移植的MNCs[10]，可能歸因于MNCs的歸巢作用。體外實驗表明，放線菌素相關(guān)抗菌肽可增強MNCs對SDF1的趨化反應(yīng)。Klyachkin等[11]將經(jīng)放線菌素相關(guān)抗菌肽預(yù)處理后的MNCs注射至小鼠梗死心肌組織周圍發(fā)現(xiàn)，與移植未經(jīng)處理的MNCs的小鼠相比，移植預(yù)處理MNCs小鼠的心肌組織微血管形成數(shù)量更多，梗死組織瘢痕更少，心臟功能得到了更好地改善。提示經(jīng)放線菌素相關(guān)抗菌肽預(yù)處理后的MNCs從病灶周圍向梗死灶歸巢的能力增強，從而更好地發(fā)揮組織損傷修復(fù)作用。MNCs移植途徑主要包括損傷部位局部注射移植（即原位移植）、靜脈移植和動脈移植，不同移植途徑可影響其在受損組織的歸巢。在濃度相同的前提下，MNCs卵巢原位移植較靜脈移植對POF小鼠性激素水平的改善效果更好[10]。提示促進MNCs的歸巢更有利于其發(fā)揮治療作用。

2.2 分泌與旁分泌Leal等[12]研究發(fā)現(xiàn)，MNCs移植到腦組織7 d后幾乎無法在受損組織中檢測到MNCs的存在，但損傷組織的恢復(fù)并未隨MNCs的消失而停止。而血清中抗炎因子水平的升高則提示MNCs可能通過分泌細胞因子參與局部組織損傷修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)BMMNCs裂解物與BMMNCs對神經(jīng)的保護作用相似，提示BMMNCs可能通過可溶性細胞因子的釋放發(fā)揮作用。生物微膠囊可以為移植細胞提供與受體免疫系統(tǒng)的物理分離和保護作用，同時允許低分子質(zhì)量營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣自由穿過半透膜，是研究旁分泌效應(yīng)的良好工具。Kieling等[13]將BMMNCs包裹在微膠囊中移植入急性肝損傷大鼠腹膜腔內(nèi)，發(fā)現(xiàn)大鼠存活率提高，提示BMMNCs可能通過分泌細胞因子誘導(dǎo)受損肝組織的修復(fù)。對UCBMNCs進行體外培養(yǎng)，可于培養(yǎng)液中檢測到抗炎因子、促血管生成因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子及具有趨化活性的蛋白質(zhì)[14]，表明UCBMNCs能夠分泌具有生物活性的細胞因子。PBMNCs體外可分泌多種細胞因子，且在人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，hCG）刺激下子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)細胞因子白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）和白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）分泌增加，經(jīng)hCG激活的PBMNCs可促進胚胎植入[15]。以上研究均提示，分泌與旁分泌作用可能是MNCs發(fā)揮修復(fù)損傷和參與局部免疫調(diào)節(jié)作用的主要機制。

3 MNCs在生殖系統(tǒng)疾病治療中的進展

3.1 POFPOF指育齡期女性因卵巢功能減退導(dǎo)致以不孕及絕經(jīng)前綜合征為主要表現(xiàn)的疾病，目前治療方式多為激素替代治療以改善相關(guān)癥狀，尚無有效方法恢復(fù)卵巢功能。近年來細胞療法成為治療POF的研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)，注射UCBMNCs至POF大鼠卵巢50 d后血清雌二醇（estradiol，E2）水平升高，卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）和黃體生成激素（luteinizing hormone，LH）水平降低，卵巢中未閉鎖卵泡數(shù)量增加，并且大鼠紊亂的動情周期得到改善[16]。王毅峰等[10]對比相同濃度的UCBMNCs原位和靜脈移植2種途徑的效果，發(fā)現(xiàn)2種途徑均可提高POF小鼠血清中E2、抑制素B和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）水平，降低FSH和LH水平，減少卵巢組織內(nèi)細胞凋亡。且靜脈移植30 d后在卵巢中依然能發(fā)現(xiàn)UCBMNCs的分布，提示經(jīng)靜脈移植的UCBMNCs同樣可以到達疾病部位。與原位移植相比，靜脈移植對激素水平的改善作用較弱，提示在相同細胞濃度的情況下，不同移植途徑對卵巢功能的改善效果存在差異。損傷部位有效細胞濃度的降低可能是靜脈移植治療效果較原位移植差的原因之一。與原位移植相比，靜脈移植更易被患者接受，其成本低、創(chuàng)傷小且操作方便，臨床應(yīng)用中可能更具優(yōu)勢。但在目前POF的細胞療法研究中，原位移植仍是首選。超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道后穹窿穿刺或腹腔鏡手術(shù)將MSCs原位注射至卵巢中，POF患者血清FSH水平下降，圍絕經(jīng)期主觀癥狀改善，且隨訪期內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯不良反應(yīng)[17-18]。若考慮靜脈移植，MNCs在其他器官的滯留及影響、對損傷組織的恢復(fù)效果及安全性需要進一步研究驗證。

除UCBMNCs外，有研究發(fā)現(xiàn)PBMNCs也能促進早衰卵巢功能的恢復(fù)。El Andaloussi等[19]將PBMNCs通過尾靜脈注射至POF小鼠中，觀察到PBMNCs可促進小鼠動情周期的恢復(fù)，甚至是生育力的恢復(fù)；卵巢干細胞相關(guān)標(biāo)志物VEGF、集落刺激因子1、Notch4和抑制素B表達水平增加，提示PBMNCs可能激活卵巢中的干細胞。Huang等[6]將來源于雄性大鼠且經(jīng)GCSF動員的PBMNCs聯(lián)合富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）原位移植至POF大鼠雙側(cè)卵巢中，在移植后5 d、10 d 及20 d 均發(fā)現(xiàn)了血管生成標(biāo)志物CD34、抗苗勒管激素及VEGF水平顯著升高，卵巢新生血管及原始卵泡數(shù)增加，大鼠發(fā)情周期得到恢復(fù)，并通過檢測Y染色體性別決定區(qū)（sex determining region of Y，Sry）基因確認了PBMNCs存在于卵巢。這可能是通過促進促凋亡基因B細胞淋巴瘤2相關(guān)X蛋白（B cell lymphoma 2 associated X protein，Bax）表達下調(diào)和抗凋亡基因B細胞淋巴瘤2（B cell lymphoma 2，Bcl-2）表達上調(diào)，減少顆粒細胞凋亡，從而改善了卵巢功能。研究顯示聯(lián)合治療比PRP或PBMNCs單獨治療效果更佳，提示臨床或可采用PBMNCs聯(lián)合PRP療法治療POF。

3.2 宮腔粘連反復(fù)嚴(yán)重的宮腔粘連影響子宮內(nèi)膜容受性，不利于胚胎著床，可導(dǎo)致不孕癥和不良輔助生殖結(jié)局。ΔNp63是p53家族中的一員，其上調(diào)與低增殖和低分化有關(guān)。Zhao等[7]發(fā)現(xiàn)BMMNCs與轉(zhuǎn)染了ΔNp63腺病毒的子宮內(nèi)膜上皮細胞共培養(yǎng)，能夠顯著下調(diào)子宮內(nèi)膜上皮細胞ΔNp63 mRNA水平，上調(diào)細胞增殖與分化相關(guān)標(biāo)志物如細胞周期蛋白D1（cyclin D1，CCND1）、細胞增殖核抗原Ki67、雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）及胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1）水平。鑒于近年來發(fā)現(xiàn)的生物支架在宮腔粘連治療中的積極作用[20]，Zhao等[7]采用自體BMMNCs搭載膠原支架對5例重度宮腔粘連患者進行治療，發(fā)現(xiàn)患者子宮內(nèi)膜上皮細胞ΔNp63表達下降，CCND1、Ki67、ERα 及IGF1表達增加，并且患者子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量及細胞密度增加，局部血流增加，內(nèi)膜增厚；4例患者行體外受精-胚胎移植助孕，1例患者自然妊娠，最終5例患者全部獲得活產(chǎn)。這提示BMMNCs可能通過下調(diào)ΔNp63表達促進子宮內(nèi)膜重建與功能恢復(fù)。盡管5例患者均獲得了良好的妊娠結(jié)局，但該研究存在一定的局限性，樣本量小及非隨機的試驗設(shè)計降低了結(jié)論的可信度。令人期待的是，該團隊注冊了一項預(yù)計納入144例受試者的多中心、隨機、單盲對照試驗，探究搭載膠原支架的自體BMMNCs對嚴(yán)重宮腔粘連患者的治療作用，以期為MNCs在宮腔粘連中的臨床應(yīng)用提供高質(zhì)量證據(jù)。

3.3 RIF目前認為子宮內(nèi)膜容受性降低是導(dǎo)致RIF的重要原因，內(nèi)分泌系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)在調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜增殖分化、改善子宮內(nèi)膜容受性及促進胚胎植入方面有重要作用。PBMNCs含有豐富的淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞和NK細胞等免疫細胞。LIF和整合素αvβ3是評估子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志性分子。研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜上皮細胞與PBMNCs共培養(yǎng)的培養(yǎng)液中LIF及整合素αvβ3水平均明顯升高[21]。輔助性T細胞1（helper T cell 1，Th1）/Th2細胞的平衡對胚胎的成功種植至關(guān)重要。正常情況下，母胎界面Th2細胞占優(yōu)勢，主導(dǎo)免疫耐受的形成。自體PBMNCs宮腔灌注后，RIF患者宮頸管內(nèi)分泌物中的Th2型細胞因子IL-6水平升高，Th1型細胞因子腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平降低。RIF患者經(jīng)宮腔灌注PBMNCs后胚胎種植率和臨床妊娠率提高[22-23]。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotropin releasing hormone，CRH）參與了胚胎著床過程中免疫耐受的發(fā)生。CRH體外可抑制PBMNCs表達Th1型細胞因子，上調(diào)Th2型細胞因子的表達，宮腔灌注經(jīng)CRH激活的PBMNCs可提高RIF患者的臨床妊娠率，推測可能是CRH促進了PBMNCs表達Th2型細胞因子，從而推進母胎界面的免疫耐受的形成，改善子宮內(nèi)膜容受性[24-25]。以上研究提示PBMNCs可能通過調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞免疫平衡改變子宮內(nèi)膜局部免疫微環(huán)境，改善子宮內(nèi)膜容受性，從而改善RIF患者的妊娠結(jié)局。

hCG同樣參與了胚胎著床過程中免疫耐受的形成。宮腔灌注hCG預(yù)處理的PBMNCs可提高RIF患者宮腔液中與胚胎種植相關(guān)的細胞因子Eotaxin、VEGF及IL-8水平[26]。Yoshioka等[27]的研究發(fā)現(xiàn)，宮腔灌注與hCG共培養(yǎng)的PBMNCs（hCG-PBMNCs）可提高有4次及以上胚胎種植失敗史患者的新鮮周期胚胎植入率。但當(dāng)年齡超過40歲時，hCG-PBMNCs對胚胎植入率無明顯影響。Qin等[28]的Meta分析表明，于胚胎移植前2～3 d宮腔灌注與hCG共培養(yǎng)48 h的PBMNCs，RIF患者的臨床妊娠率和活產(chǎn)率可升高，hCG的劑量及PBMNCs的濃度對妊娠結(jié)局無明顯影響。但該Meta分析納入的7項研究中僅有1項為高質(zhì)量的雙盲隨機對照研究，且不同研究之間的異質(zhì)性較高，結(jié)論存在一定偏倚。RIF定義中胚胎植入失敗的次數(shù)并不統(tǒng)一。研究發(fā)現(xiàn)，對于胚胎種植失敗4次及以上的患者，hCG-PBMNCs能夠改善凍融胚胎移植周期的胚胎植入率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率，但對有1～3次胚胎植入失敗史的患者妊娠結(jié)局無明顯改善[29]。Okitsu等[30]發(fā)現(xiàn)，僅當(dāng)胚胎移植失敗次數(shù)在3次或更多次時PBMNCs才能改善RIF患者凍融胚胎移植周期的胚胎植入率和臨床妊娠率。同時該研究指出了PBMNCs可能的負面影響，包括可能存在中性粒細胞污染，以及PBMNCs可能產(chǎn)生過量的Th1型和Th2型細胞因子。因此，該研究僅推薦將PBMNCs用于3次及以上胚胎移植失敗的患者。以上研究提示，PBMNCs對3次及以上胚胎種植失敗患者的妊娠結(jié)局有改善作用，對于僅有1次或2次失敗史的患者，效果尚不確定。

3.4 其他與體外受精-胚胎移植相比，人工授精的成功率始終較低。鑒于PBMNCs在RIF中的良好結(jié)果，Joao等[31]探討了PBMNCs對人工授精結(jié)局的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PBMNCs并未提高人工授精的妊娠率和活產(chǎn)率，這一結(jié)果似乎也印證了部分研究中宮腔灌注PBMNCs對單次胚胎移植失敗患者妊娠結(jié)局無明顯改善的結(jié)論。

4 結(jié)語與展望

目前MNCs在治療不同生殖系統(tǒng)疾病中的研究進展及側(cè)重點各異。MNCs治療POF的研究仍處于臨床前階段，原位移植臨床操作的不便性、靜脈注射療效及安全性不確切等問題均限制了其臨床試驗的開展。BMMNCs可改善宮腔粘連患者子宮內(nèi)膜容受性及妊娠結(jié)局，但仍需更多研究探討治療機制。新型生物支架聯(lián)合MNCs是治療宮腔粘連未來可深入探究的方向之一。hCG-PBMNCs對RIF的治療效果已被多項研究證實，但需要更高質(zhì)量的隨機對照試驗指導(dǎo)臨床，并且探究可能的機制。外泌體作為近年來的研究熱點之一，其發(fā)揮作用的機制主要與血管生成、抗炎、抗纖維化有關(guān)[32]。與MNCs相比，外泌體無細胞相關(guān)的移植物抗宿主反應(yīng)，安全性更高，且無倫理問題。研究表明，從凋亡PBMNCs分離提取的外泌體可促進機體組織損傷的修復(fù)，已被證實在心肌損傷、神經(jīng)損傷及皮膚損傷等組織損傷中發(fā)揮修復(fù)作用[33]。MNCs來源的外泌體有望在生殖系統(tǒng)疾病中成為新的治療方法。此外，MNCs聯(lián)合基因療法也已獲得一些有意義的結(jié)果，轉(zhuǎn)染了載有神經(jīng)營養(yǎng)因子基因的重組腺病毒的UCBMNCs可促進脊髓損傷的恢復(fù)[34]。未來或可將重組腺病毒技術(shù)聯(lián)合MNCs治療用于生殖系統(tǒng)組織損傷，以期獲得新的治療思路。3種MNCs的臨床應(yīng)用特點各有優(yōu)劣，關(guān)于3種MNCs在療效方面的比較研究暫未開展，未來可探究不同種類MNCs對生殖系統(tǒng)不同疾病的治療效果及相關(guān)作用機制。而且MNCs在應(yīng)用中仍有許多問題亟待解決，其治療不同生殖系統(tǒng)疾病時的移植途徑及濃度對效果的影響仍需進一步研究。