精子tsRNA在父系遺傳中的作用

許鈺薇，李文婧，茅欣怡，馬梲銚，丁之德

隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展，對于小RNA的檢測和研究變得更加快捷、方便。tsRNA（tRNA-derived small RNA），也 稱 為tRF（tRNA-derived RNA fragment）、tDR（tRNA-derived small RNA）和tiRNA（tRNA-derived stress-induced RNA）[1]，是一類來源于轉(zhuǎn)運RNA（transfer RNA，tRNA）的小RNA。tsRNA的生成受到血管生成素（angiogenin，Ang）、Dicer、RNA酶Z（RNase Z）和RNase P等酶切割的影響[1]，轉(zhuǎn)錄后修飾等過程也對其進(jìn)行調(diào)控。tsRNA是一種重要的RNA調(diào)控因子，在蛋白質(zhì)合成、信使RNA（messenger RNA，mRNA）翻譯轉(zhuǎn)錄、精子成熟、代際遺傳和癌癥等病理生理過程中發(fā)揮一定的作用?，F(xiàn)就tsRNA的分類與功能及其在精子成熟和代謝相關(guān)的父系遺傳中的作用進(jìn)行綜述，以期對其在代際遺傳，尤其在子代代謝性疾病中的作用進(jìn)一步闡明。

1 tsRNA的分類與功能

1.1 tsRNA的分類tRNA是一種用于mRNA翻譯、轉(zhuǎn)錄的非編碼RNA，長度一般在76～93 nt。成熟tRNA的生成是由tRNA前體（pre-tRNA）經(jīng)過切割、加工和轉(zhuǎn)錄后修飾而成；在其成熟過程中，一段CCA序列會被添加到pre-tRNA的3'端；最終tRNA被折疊成L型，形成3個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，分別為D環(huán)、TψC環(huán)和反密碼子環(huán)[1]。tsRNA的分類取決于其從tRNA上被切割的位置，目前共有tRF與tiRNA兩類[2]。

1.1.1 tRFtRF通常由Ang或Dicer切割而成，共分為5個亞型：1-tRF、2-tRF、3-tRF、5-tRF和i-tRF[2]。tRF曾被認(rèn)為在細(xì)胞核中合成，但有研究表明其亞種tRF-1001是由ELAC2（ElaC Ribonuclease Z 2）在細(xì)胞質(zhì)中合成，從而推測tRF的合成存在多個途徑[1]。

1-tRF是從pre-tRNA的3'端由RNase Z切割而來，一般長度為16～48 nt；通常分散在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中[2]。2-tRF僅有4種，從其來源的tRNA反密碼子環(huán)上不包含5'端和3'端結(jié)構(gòu)的部分被切割下來，能產(chǎn)生2-tRF的4種tRNA分別為tRNA-Glu、tRNA-Gly、tRNA-Asp和tRNA-Tyr前體[3]。2-tRF在缺氧條件下被誘導(dǎo)生成[1]。3-tRF由Ang在成熟tRNA的3'端切割生成，也有部分3-tRF源于成熟tRNA的TψC環(huán)；3-tRF有2個亞型——tRF-3a（18 nt）和tRF-3b（22 nt）[4]。5-tRF由酶在成熟tRNA的5'端切割生成，但切割出5-tRF的酶尚不清楚。高通量測序顯示，現(xiàn)有的所有加工微小RNA（microRNA，miRNA）的酶都與5-tRF的加工無關(guān)，表明tsRNA的加工機(jī)制可能與miRNA的加工有所不同[5]。5-tRF分為tRF-5a（14～16 nt）、tRF-5b（22～24 nt）和tRF-5c（28～30 nt）3種亞型[1]。i-tRF主要來源于成熟tRNA的中間區(qū)域[1]。

1.1.2 tiRNAtiRNA由Ang在壓力環(huán)境下（如心臟驟停、紫外線輻射、饑餓、缺氧及病毒感染等），將成熟tRNA從反密碼子環(huán)上切成兩半獲得，因此又被稱為半tRNA（tRNA halves），其長度可達(dá)到30～40 nt[2]。tiRNA可分為3'-tiRNA和5'-tiRNA兩類。

3'-tiRNA包含從反密碼子環(huán)上切割區(qū)域到原tRNA 3'端的部分，哺乳動物細(xì)胞中3'-tiRNA由Ang切割而成，酵母菌中則由RNY1（ribonuclease from Yeast 1）切割而成；5'-tiRNA包含從反密碼子環(huán)上切割區(qū)域到原tRNA 5'端的部分[2]。

關(guān)于tsRNA的分類和命名尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，因此在各種研究中會出現(xiàn)諸如3'-tsRNA（包含來源于tRNA 3'端的tsRNA）和5'-tsRNA（包含來源于tRNA 5'端的tsRNA）等名稱。高通量測序顯示，tsRNA的實際種類遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于上述幾種[1]。因此，關(guān)于tsRNA的分類和命名還需要深入研究。

1.2 tsRNA的功能tsRNA在應(yīng)激反應(yīng)、表觀遺傳、蛋白質(zhì)翻譯調(diào)控、mRNA翻譯轉(zhuǎn)錄、新血管生成、精子成熟與免疫反應(yīng)等方面有著廣泛作用，并與許多疾病之間存在關(guān)聯(lián)。

1.2.1 tsRNA在蛋白質(zhì)合成中的作用tiRNA可以抑制蛋白質(zhì)的合成。tiRNA（Ala）和tiRNA（Cys）依靠其TOG（a terminal oligo-G motif，一個終末端少G的基本序列）結(jié)構(gòu)能夠形成分子間RNA G-四鏈體（RNA G-quadruplex，RG4），替代mRNA翻譯起始復(fù)合物eTF4G/eTF4E，從而抑制蛋白質(zhì)的合成[6]。同時，tiRNA也可通過結(jié)合Y盒結(jié)合蛋白1（Y-Box Binding Protein 1，YB-1）促進(jìn)應(yīng)激顆粒（stress granules）的組裝，從而隔離翻譯起始因子和蛋白質(zhì)翻譯核糖體，增強(qiáng)對蛋白質(zhì)合成的抑制[7]。

RNA修飾在蛋白質(zhì)的合成過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，假尿苷合成酶7（PUS7）可與多種tsRNA結(jié)合，并將其第8位上的U（U8）轉(zhuǎn)變?yōu)棣罚é?），從而調(diào)控該tsRNA的生成；其中Ψ8-TOG-5-tRF能夠優(yōu)先與翻譯起始復(fù)合物中的起始因子細(xì)胞質(zhì)多聚腺苷酸結(jié)合蛋白1[poly（A）binding protein cytoplasmic 1，PABPC1]結(jié)合，并替代mRNA帽子上的eIF4A/eIF4G復(fù)合物，從而抑制蛋白質(zhì)翻譯；研究還發(fā)現(xiàn)，PUS7的缺失與蛋白質(zhì)整體合成的增加有關(guān)[8]。

1.2.2 tsRNA在mRNA轉(zhuǎn)錄翻譯中的作用研究發(fā)現(xiàn)，一種長22 nt的3'-CCA-tsRNA可與Argonaute（AGO）蛋白結(jié)合，抑制mRNA翻譯，表明tsRNA可能具有與miRNA相似的調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用[1]。在對果蠅的研究中發(fā)現(xiàn)，3-tRF和5-tRF能夠與AGO蛋白結(jié)合并抑制靶基因mRNA的翻譯，還能優(yōu)先靶向抑制翻譯過程中關(guān)鍵成分[如核糖體蛋白（ribosome proteins，RP）和翻譯啟動或延伸因子（initiation or elongation factor，IEF）]的mRNA，然而，3-tRF和5-tRF對兩者的選擇及其作用機(jī)制尚不清楚[9]。

tsRNA也可以通過其他方式在mRNA的翻譯調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，3'-tsRNA-Leu-CAG（一個來源于tsRNA-Leu-CAG 3'端長度為22 nt的序列）能夠與核糖體蛋白S28（RPS28）和RPS15的mRNA結(jié)合，解開其靶點上成對的二級結(jié)構(gòu)，最終增強(qiáng)40S核糖體的合成[10]?？傊瑃sRNA通過RNA修飾和RNA二級結(jié)構(gòu)變化等方式對mRNA翻譯起抑制作用。

1.3 tsRNA在代謝性疾病中的作用tsRNA被證實參與脂肪細(xì)胞的生成和功能，從而對受肥胖影響的糖尿病、非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）和心血管疾病等代謝性疾病產(chǎn)生作用[2]。tRF-Glu-TTC能夠促進(jìn)小鼠腎周圍脂肪組織中脂肪前體細(xì)胞的增殖，并同時抑制其分化[11]。在患有NAFLD的小鼠中，升高的tRF-3001b可以靶向抑制自噬相關(guān)基因Prkaa1的表達(dá)并促進(jìn)脂質(zhì)形成，從而促進(jìn)NAFLD的發(fā)展[12]。tsRNA也參與酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）的進(jìn)程，在ALD患者中檢測到tRF-Gly表達(dá)升高、Sirtuin1（Sirt1）表達(dá)降低，而在ALD小鼠中，tRF-Gly可以通過與AGO3蛋白結(jié)合，作用于Sirt1 mRNA的3'非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR），從而下調(diào)Sirt1的表達(dá)，促進(jìn)脂肪生成，抑制脂肪酸的β氧化，最終促進(jìn)ALD小鼠肝臟脂肪變性和肝損傷的發(fā)展[13]。

2 tsRNA在精子成熟過程中的表達(dá)及修飾

2.1 附睪中tsRNA的來源雄性生殖細(xì)胞在睪丸中生成發(fā)育，隨后在附睪進(jìn)入成熟階段；在睪丸精子中，tRNA片段很少，但隨著精子在附睪中成熟，tRNA片段逐漸增多[14]。從睪丸進(jìn)入附睪后，精子中的大部分piRNA（Piwi interacting RNA）轉(zhuǎn)化為tsRNA，piRNA退化的同時伴隨tsRNA的數(shù)量增加，即小非編碼RNA（small non-coding RNA，sncRNA）的含量發(fā)生了實質(zhì)性的改變[15]。同時，在雄性生殖細(xì)胞發(fā)育過程中，由于出現(xiàn)了個體更大的sncRNA，如tsRNA和rsRNA-28S（28S rRNA-derived small RNA），導(dǎo)致總sncRNA含量持續(xù)增加，并且tsRNA和rsRNA-28S自身含量都在由附睪頭部轉(zhuǎn)運至尾部的過程中增加[16]。

由于精子具有轉(zhuǎn)錄沉默（transcriptional silencing）特性，附睪中sncRNA含量的實質(zhì)性改變可能是sncRNA與其管腔環(huán)境持續(xù)性相互作用的結(jié)果。Chu等[17]研究發(fā)現(xiàn)男性生殖道炎癥可顯著升高成熟精子中某些sncRNA的含量，如tsRNA和rsRNA-28S。

2.2 RNA修飾對tsRNA的影響tsRNA上存在的RNA修飾可影響其穩(wěn)定性。研究表明，在哺乳動物雄性生殖細(xì)胞內(nèi)，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Ⅱ（DNMT2）和NOP2/Sun RNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族成員2（NSUN2）介導(dǎo)的5-甲基尿苷（5-methylcytidine，m5C）修飾能增加tsRNA的穩(wěn)定性[18]。

暴露在氧化應(yīng)激條件下可誘導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞中TRMT2A基因下調(diào)，從而導(dǎo)致tiRNA形成。如人宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞中TRMT2A基因的下調(diào)可誘導(dǎo)m5U54（5-methyluridine modification at position 54）tRNA低修飾，進(jìn)而導(dǎo)致Ang過表達(dá)，促進(jìn)5'-tiRNA的累積（包括5'-tiRNA-GlyGCC和5'-tiRNA-GluCT等）和穩(wěn)定tsRNA的形成；此外，轉(zhuǎn)錄組分析證實，TRMT2A的下調(diào)以及m5U54低修飾促進(jìn)了細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和RNA穩(wěn)定性，而這些改變通常也與tiRNA的產(chǎn)生有關(guān)[19]。以上結(jié)果證實tRNA低修飾與Ang依賴的tsRNA形成具有相關(guān)性，并闡明了m5U54作為tRNA切割保護(hù)的標(biāo)志性作用。

另外，tsRNA上RNA的修飾也增加了RNA結(jié)構(gòu)和功能的多樣性。研究表明，廣泛存在的N1-甲基腺苷（m1A）能夠打破RNA的堿基互補(bǔ)配對原則，從而產(chǎn)生多樣的RNA結(jié)構(gòu)和功能[20]。精子來源的內(nèi)源性tsRNA的穩(wěn)定性與活性主要依賴于轉(zhuǎn)錄后修飾。因此，不同修飾可影響tsRNA的發(fā)生與功能，從而促進(jìn)子代代謝表型的傳遞[21]。

3 tsRNA在父系遺傳中對子代代謝的影響

3.1 影響子代代謝性疾病的父代暴露因素多項研究表明，父代暴露在多種環(huán)境因素下可在子代中引發(fā)出生后特征的改變，如代謝紊亂等。若父代肥胖，其子代更容易患有代謝性疾病，并且父代可能將代謝性疾病直接遺傳給子代[22]。Chen等[23]將正常飲食（normal diet，ND）和高脂飲食（high-fat diet，HFD）雄性小鼠的精子分別用于體外受精，并將2組受精后的胚胎轉(zhuǎn)入正常飲食的健康代孕母鼠子宮內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HFD雄性小鼠的子代在給予HFD喂養(yǎng)時更易發(fā)生糖耐量受損和胰島素抵抗。

雄性暴露于一系列環(huán)境危害因素，其精子的小RNA圖譜發(fā)生改變，并將父代行為和代謝表型傳遞給子代[24]。Sarker等[22]在HFD雄鼠的子代F1雄鼠中提取富含tsRNA的精子RNA片段（30～34 nt）并進(jìn)行合子注射，發(fā)現(xiàn)可影響F2代的成癮性行為和代謝表型。

此外，父代早年的創(chuàng)傷應(yīng)激也會改變子代的行為和代謝反應(yīng)。突然失去母鼠或經(jīng)歷其他心理創(chuàng)傷的雄性幼鼠（F1），成年后更容易出現(xiàn)抑郁、行為控制能力喪失、認(rèn)知功能及社交技能受損等癥狀；其子代（F2）可表現(xiàn)出與F1代小鼠相似的行為癥狀，還會出現(xiàn)代謝紊亂和對胰島素過度敏感導(dǎo)致的低血糖等癥狀[25]。提示父代的壓力應(yīng)激可能會導(dǎo)致子代的代謝紊亂。

3.2 父代暴露因素影響子代代謝的可能機(jī)制tsRNA能夠促進(jìn)哺乳動物特定代謝表型的傳遞。在HFD和ND小鼠中，精子tsRNA（18～40 nt）的種類存在顯著差異；將HFD和ND小鼠精子中15～25 nt、30～40 nt和＞40 nt 3種不同長度的tsRNA片段分離純化后分別注射到正常受精卵中，只有注射了30～40 nt tsRNA的子代產(chǎn)生了與注射精子總RNA子代類似的代謝效應(yīng)[23]。表明精子tsRNA與精子總RNA的信息相似，是誘導(dǎo)子代獲得性代謝紊亂過程中的必要條件。此外，tsRNA對精子總RNA的調(diào)控也影響了tsRNA介導(dǎo)的跨代表觀遺傳。Chen等[23]還發(fā)現(xiàn)miRNA與tsRNA均參與獲得性代謝紊亂的代際遺傳，對HFD和ND雄鼠精子tsRNA的RNA修飾進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在HFD組中m5C修飾和m2G修飾較ND組顯著上調(diào)，而在miRNA中則未觀察到明顯變化。提示精子tsRNA相較于miRNA對高脂更加敏感，印證了tsRNA在介導(dǎo)父系獲得性代謝紊亂中的關(guān)鍵作用。

在人類精子中還發(fā)現(xiàn)了一種新的內(nèi)源性tsRNA，它是通過整段tRNA的T環(huán)序列特異性裂解而產(chǎn)生，由于這種分裂方式僅觀察到來自核DNA而非線粒體DNA的tRNA，因此，這些tsRNA被命名為核內(nèi)T環(huán)tsRNA（nuclear internal T-loop tsRNA，nitRNA），其可促進(jìn)精子運動[26]。N?tt等[26]研究發(fā)現(xiàn)，來自多物種的nitRNA在高糖飲食1周后就開始上調(diào)；在健康年輕男性中也觀察到這種上調(diào)現(xiàn)象，但在肥胖男性的樣本中，同樣的nitRNA反而下調(diào)。表明在健康狀態(tài)下，nitRNA對高糖敏感；發(fā)生代謝性疾病狀態(tài)下，nitRNA合成受到抑制。該研究在對nitRNA進(jìn)行分析時發(fā)現(xiàn)，所有nitRNA在T環(huán)中都含有相同的TTCGA序列，TTCGA序列與至少2個RNA PUS（TURB1和PUS7）的目標(biāo)序列非常相似。在人類胚胎干細(xì)胞中，PUS7介導(dǎo)的RNA假尿苷化可穩(wěn)定由D環(huán)切割產(chǎn)生短5'-tsRNA，隨后短5'-tsRNA會干擾參與翻譯作用的核糖體，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的翻譯受到抑制[8]。以上結(jié)果表明在RNA修飾和穩(wěn)定性、精子nitRNA及蛋白質(zhì)翻譯之間可能存在一定的關(guān)聯(lián)，nitRNA可能在急性和慢性代謝狀態(tài)中均發(fā)揮作用，但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

另有研究表明，對HFD父系精子RNA提取后進(jìn)行合子注射可以誘導(dǎo)小鼠早期胚胎和子代組織中代謝相關(guān)基因信號通路中DNA轉(zhuǎn)錄的改變[23]。一種解釋可能是，一旦在胚胎早期觸發(fā)異常代謝狀態(tài)，胚胎的代謝物或線粒體功能可能會發(fā)生變化，并進(jìn)一步觸發(fā)持續(xù)影響代謝狀態(tài)的連鎖反應(yīng)，而連鎖反應(yīng)可能通過表觀遺傳反饋到細(xì)胞核，使子代發(fā)生代謝性疾病或增加其發(fā)生風(fēng)險。此外，Chen等[27]通過對高質(zhì)量精子和低質(zhì)量精子受精獲得的胚胎進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，不同長度的tsRNA-Gln-TTGs（30～36 nt）在高質(zhì)量精子和低質(zhì)量精子中的含量存在明顯差異，表明人類精子tsRNA-Gln-TTGs含量與胚胎質(zhì)量有關(guān)，可能作為潛在的診斷性生物標(biāo)志物。研究證實小鼠精子中的5'-tiRNA-Glu和5'-tiRNA-Gly能夠抑制與內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄因子MERVL相關(guān)的基因表達(dá)，可能在胎盤功能與胚胎早期發(fā)育中存在影響[14]。

3.3 tsRNA在表觀遺傳調(diào)控與種系介導(dǎo)的代際遺傳中的作用當(dāng)精子穿過附睪時，小RNA被大量重塑，piRNA被降解并生成大量的tsRNA[15]。這些tsRNA的改變不僅能夠支持受精，并且在受精時被輸送到卵母細(xì)胞后還能支持正常的胚胎發(fā)育[28]。修飾后的精子tsRNA可能通過靶向特定的核糖體重新編程胚胎代謝狀態(tài)，從而影響胚胎發(fā)育的軌跡。因此，以精子RNA密碼形式存在的父系環(huán)境信息可能被轉(zhuǎn)化為胚胎的“核糖體密碼”，以產(chǎn)生翻譯的特異性并最終確定后代的代謝表型[29]。

4 結(jié)語與展望

精子中的tsRNA與父系遺傳密切相關(guān)。tsRNA在附睪中大量合成和修飾后，通過受精過程遺傳給子代，促進(jìn)了代謝表型的傳遞。如精子tsRNA會受到父代暴露因素（肥胖和心理等）的影響，這些暴露因素能夠影響tsRNA的種類以及其對細(xì)胞核RNA、轉(zhuǎn)座子和染色體可及性（chromatin accessibility）等的調(diào)控，從而影響下一代的代謝表型。因此，研究tsRNA對子代代謝性疾病的預(yù)防和治療具有重大臨床意義。然而，tsRNA在精子中生成和調(diào)控的機(jī)制仍需更多的研究進(jìn)一步證實。