牛卵母細(xì)胞體外成熟存在的問題及可能的解決方法

徐 華，邢寶奎，朱 捷

（1.廊坊市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 廊坊 065000；2.廊坊市六驥生物技術(shù)開發(fā)有限公司，河北 廊坊 065000）

1978年世界上第一個(gè)“試管女嬰”路易絲·布朗（Louise Brown）在英國出生。小路易絲的誕生標(biāo)志著哺乳動物體外受精（in vitrofertilization，IVF）技術(shù)已經(jīng)成熟。輔助生殖技術(shù)（包括IVF技術(shù)）為動物和人類生殖生物學(xué)增添了新的內(nèi)容，也為無數(shù)不孕不育夫妻帶來“福音”。由于這項(xiàng)技術(shù)在動物生殖生物學(xué)的基礎(chǔ)研究成果在治療不孕不育及動物育種中表現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景，此項(xiàng)技術(shù)在后來的10年里有了較快發(fā)展，特別是在大家畜IVF技術(shù)方面，1981—1986年間通過體外受精技術(shù)生產(chǎn)的試管牛［1］、試管豬［2］、試管綿羊［2］及試管山羊［3］相繼獲得成功。遺憾的是所有這些成功案例采用的卵子全部來自體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞?？梢娺@時(shí)的IVF技術(shù)是真正意義上的IVF。隨著該項(xiàng)技術(shù)研究不斷深入及技術(shù)的發(fā)展，IVF技術(shù)的內(nèi)涵也發(fā)生了很大改變，已經(jīng)發(fā)展成為集卵母細(xì)胞體外成熟（in vitromaturation，IVM）、成熟卵母細(xì)胞IVF和胚胎體外培養(yǎng)（embryoin vitroculture，IVC）三項(xiàng)技術(shù)于一體的綜合技術(shù)體系。到1990年前，主要家畜的IVF體系基本建立。由于牛特殊的經(jīng)濟(jì)價(jià)值及IVF技術(shù)在品種改良上的巨大潛力，其IVF技術(shù)在所有家畜中發(fā)展最快、水平最高，并迅速在生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用。2017年，全球體外生產(chǎn)（in vitroembryo production，IVP）的牛胚胎移植數(shù)首次超過了體內(nèi)回收胚胎移植數(shù)，其中60%以上是鮮胚移植，冷凍體外胚胎由于移植成功率偏低致使其占比相對較少［4］。這些數(shù)據(jù)僅僅是國際胚胎移植協(xié)會發(fā)布的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，而實(shí)際數(shù)據(jù)可能還要高。這也標(biāo)志著牛胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)已經(jīng)進(jìn)入規(guī)?；虡I(yè)應(yīng)用階段。近20年來在世界范圍內(nèi)已累計(jì)進(jìn)行了超過1 600萬次牛胚胎移植［5］。目前，全世界每年生產(chǎn)約100萬枚IVP牛胚胎，其中約1萬枚為性控胚胎。另外在提高單頭優(yōu)秀母牛繁殖效率方面，?；铙w采卵（ovum pick-up，OPU）結(jié)合體外受精和胚胎移植技術(shù)（OPU-IVF-ET）正在取代傳統(tǒng)的超數(shù)排卵和胚胎移植技術(shù)（MOET），展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。例如，在美國綜合育種值排名前100名的奶用種公牛中，有87頭是通過OPU-IVF-ET技術(shù)產(chǎn)生的?；仡?0多年來牛IVF技術(shù)的發(fā)展，在一些方面取得了進(jìn)展，如激素和各種添加因子在體外成熟體系中的應(yīng)用、無血清培養(yǎng)體系或無動物產(chǎn)品培養(yǎng)體系的建立；但遺憾的是IVF生產(chǎn)效率并沒有明顯提高，如卵母細(xì)胞的體外成熟率仍然保持在80%～90%，受精后48 h分裂率為70%～80%，囊胚率為30% ～40%，囊胚率極少超過50%。這些結(jié)果被認(rèn)為是目前的國際先進(jìn)水平，幾乎與30年前相同。這意味著超過50%的體外成熟卵母細(xì)胞在受精后無法正常發(fā)育。這已成為制約牛OPU-IVF-ET技術(shù)普及應(yīng)用的最大障礙，而IVF技術(shù)的難點(diǎn)正是卵母細(xì)胞的體外成熟［5］。因此，文章將著重圍繞牛卵母細(xì)胞體外成熟中遇到的主要問題（即卵母細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)不同期成熟、卵母細(xì)胞群中每個(gè)卵母細(xì)胞發(fā)育階段不同期及表觀遺傳學(xué)的變化）進(jìn)行論述，并提出可能的解決辦法。

1 卵母細(xì)胞細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)成熟不同期

無論是OPU采集，還是通過屠宰廠卵巢得到，從離開卵泡時(shí)開始，卵母細(xì)胞核成熟就失去了卵泡液中一些抑制因子的調(diào)控，其細(xì)胞周期重新恢復(fù)，從而產(chǎn)生了卵母細(xì)胞核成熟超前而細(xì)胞質(zhì)成熟滯后的情況，即“卵母細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)成熟不同期”的問題。這樣的卵母細(xì)胞要么無法受精，要么因?yàn)槁涯讣?xì)胞質(zhì)量差導(dǎo)致受精后發(fā)育停滯。另外，成熟卵母細(xì)胞質(zhì)量的好壞不僅直接影響受精率和發(fā)育率，而且直接影響多精入卵現(xiàn)象的發(fā)生。與體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞相比，體外成熟的卵母細(xì)胞受精后多精入卵的發(fā)生率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于前者。顯然，這種卵母細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)成熟的不同期會隨著采卵人員技術(shù)不熟練或卵母細(xì)胞離開卵泡到進(jìn)入卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)間的延長而加劇。因此，抑制卵母細(xì)胞核成熟速度、縮小卵母細(xì)胞核成熟與細(xì)胞質(zhì)成熟不同期化的程度，是在體外成熟培養(yǎng)過程中獲得高質(zhì)量成熟卵母細(xì)胞的關(guān)鍵。

牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)中存在的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)成熟不同期的問題是長期以來研究人員一直關(guān)注并努力解決的問題。要解決這個(gè)問題，最直接的方法是模擬卵母細(xì)胞體內(nèi)發(fā)育過程，詳細(xì)了解不同發(fā)育階段卵泡內(nèi)環(huán)境條件的變化規(guī)律，從而找到有效解決辦法。在這方面研究人員已經(jīng)取得了一些成果。在卵泡內(nèi)部卵母細(xì)胞和周圍的顆粒細(xì)胞通過間隙連接和卵泡液（follicular fluid，F(xiàn)F）傳遞的因子不斷相互作用，使卵母細(xì)胞獲得發(fā)育能力。這些相互作用是卵母細(xì)胞分化成功的決定性因素。目前已經(jīng)在卵泡液中發(fā)現(xiàn)許多化合物，包括由顆粒細(xì)胞或卵母細(xì)胞本身分泌的生長因子［6］及包括外泌體（exosomes）在內(nèi)的細(xì)胞外載體（extracellular vehicles，EV）［7］，這些細(xì)胞載體來源于體細(xì)胞和卵母細(xì)胞，其中包括蛋白質(zhì)、mRNA、microRNA和脂質(zhì)［8］。這些外泌體參與保護(hù)卵母細(xì)胞免受過氧化物的損害［9］，以及microRNA信號傳導(dǎo)、誘導(dǎo)早期胚胎中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［10］和調(diào)節(jié)卵丘擴(kuò)張［11］等作用?？傊瑢ν饷隗w的進(jìn)一步研究可能會改善胚胎體外生產(chǎn)效率［12］，并有助于確定卵母細(xì)胞質(zhì)量的標(biāo)志物。卵泡液中含有眾多已知和未知的因子，在不改變其他條件的情況下，直接利用卵泡液取代體外成熟培養(yǎng)液中的犢牛血清，可顯著改善牛卵母細(xì)胞體外成熟效率［13］。卵泡液的主要作用可能是促進(jìn)了卵母細(xì)胞在體外成熟過程中細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)成熟的同期化。但卵泡液中各種因子的含量和活性易受諸多因素影響而發(fā)生變化，很難做到在牛卵母細(xì)胞的IVM中精確添加。因此，研究人員希望通過調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的細(xì)胞周期，降低其細(xì)胞核成熟速度或提高細(xì)胞質(zhì)成熟速度，使卵母細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)達(dá)到同期（或同步）成熟。目前比較理想的辦法是在卵母細(xì)胞離開卵泡后立即抑制或停止卵母細(xì)胞的細(xì)胞周期，使卵母細(xì)胞的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)在IVM前接近同期化，之后再進(jìn)入IVM液開始體外培養(yǎng)過程。自1990年以來，在不同畜種上開展了大量試驗(yàn)研究，并有許多相關(guān)文章發(fā)表［14-17］。調(diào)控卵母細(xì)胞細(xì)胞周期的抑制因子主要有放線菌酮（cycloheximide，CHX，一種蛋白質(zhì)合成抑制劑）［18］、卵母細(xì)胞成熟促進(jìn)因子激酶活性的抑制劑（roscovitine，ROS）［19］、6-二甲基氨基嘌呤（6-dimethylaminopurine，一種磷酸化抑制劑）［17，20-22］、蛋白酪氨酸磷酸酶抑制劑（vanadate，即NaV03）［20］、侵入性細(xì)胞外腺苷酸環(huán)化酶（iAC）、磷酸二酯酶抑制劑（PDE inhibitor）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）［23-24］和丁內(nèi)酯Ⅰ（ButyrolactoneⅠ，一種核成熟抑制劑）［14，25］。以上這些抑制因子都通過不同途徑對卵母細(xì)胞的細(xì)胞周期產(chǎn)生抑制或停滯作用。而當(dāng)這些因子的抑制或停滯作用被取消后卵母細(xì)胞的細(xì)胞周期又可以重新恢復(fù)，而且絕大多數(shù)的抑制劑并不影響卵母細(xì)胞正常成熟。但這些試驗(yàn)的結(jié)果并不總是有效的。R.D.Rose等［26］將從屠宰廠卵巢獲得的羊卵母細(xì)胞-顆粒細(xì)胞復(fù)合體在正常IVM培養(yǎng)之前，用含有100 mmol／L的Forskolin（FSK）加500 mmol／L的3-isobutyl-1-methylxanthine（IBMX）溶液處理卵母細(xì)胞-顆粒細(xì)胞復(fù)合體2 h，卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞復(fù)合體的cAMP濃度提高了10倍。并且IVF后囊胚率和胚胎質(zhì)量獲得顯著提高。此外，Milrinone是一種3型磷酸二酯酶的特異性抑制劑，只在卵母細(xì)胞中表達(dá)；而Rolipram是一種4型磷酸二酯酶的特異性抑制劑，只在顆粒細(xì)胞中表達(dá)。如果將這兩種抑制劑同時(shí)加入成熟培養(yǎng)液中，囊胚率也會明顯提高。這說明上述抑制劑不僅抑制卵母細(xì)胞的細(xì)胞周期，而且抑制顆粒細(xì)胞的細(xì)胞周期，這對卵母細(xì)胞成熟是非常有利且必要的。同樣，添加cAMP調(diào)節(jié)劑或其他類似試劑到成熟培養(yǎng)液中也可以改善卵母細(xì)胞成熟效率和質(zhì)量［15，27-29］，或者至少對卵母細(xì)胞發(fā)育潛力無不利影響［14，29-30］。另外，IVM的卵母細(xì)胞與體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞相比，除了質(zhì)量上的差異以外，還有一個(gè)顯著缺點(diǎn)就是最佳受精時(shí)間短，一般僅為2～3 h（如果卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量不好，時(shí)間可能更短），而體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞最佳受精時(shí)間可達(dá)4～6 h，甚至更長。因此，延長IVM卵母細(xì)胞最佳受精時(shí)間不僅可以提高卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量和數(shù)量，同時(shí)也能讓一些接近老化的卵母細(xì)胞延緩老化，使更多的卵母細(xì)胞可以被受精，進(jìn)而提高IVF效率。從理論上講，凡是可以維持或提高卵母細(xì)胞中成熟促進(jìn)因子（maturation promoting factor，MPF）的藥物都應(yīng)該是潛在的候選藥物。篩選出適宜的抑制劑，并優(yōu)化其使用濃度和處理時(shí)間是非常重要的。

綜上所述，采用特異性抑制劑去停滯或延遲卵母細(xì)胞核成熟的速度或加速卵母細(xì)胞質(zhì)成熟的速度，使細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的成熟同期化，有可能成為未來提高體外成熟卵母細(xì)胞質(zhì)量的一個(gè)有效途徑。

2 卵母細(xì)胞群中每個(gè)卵母細(xì)胞發(fā)育階段不同期

IVF技術(shù)的最大優(yōu)勢就是可以高效利用優(yōu)秀母畜卵巢上的卵母細(xì)胞資源，充分發(fā)揮繁殖潛力和遺傳優(yōu)勢。但牛是單胎動物，無論是通過活體采卵、還是通過屠宰廠卵巢獲得的卵母細(xì)胞，在進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)時(shí)各自處于不同的發(fā)育階段，這種現(xiàn)象稱為群體卵母細(xì)胞發(fā)育階段的不同期。當(dāng)采集的卵母細(xì)胞進(jìn)行正常的體外成熟培養(yǎng)后（一般22～24 h）通常可以得到以下類型的卵母細(xì)胞：（1）死的或閉鎖的卵母細(xì)胞；（2）沒有成熟的卵母細(xì)胞；（3）老化的成熟卵母細(xì)胞；（4）細(xì)胞核成熟而細(xì)胞質(zhì)未成熟的卵母細(xì)胞；（5）細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)都成熟的卵母細(xì)胞。其中，只有第5種類型的卵母細(xì)胞是真正具有發(fā)育潛力的合格細(xì)胞。另外，除了死的卵母細(xì)胞，有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員可以通過形態(tài)學(xué)觀察加以剔除，而其他很難通過形態(tài)學(xué)加以區(qū)分。群體卵母細(xì)胞發(fā)育階段的不同期是造成牛體外受精效率在過去30多年中沒有明顯提高的最主要原因。為什么不同的技術(shù)人員處理同一批卵母細(xì)胞會得到不同的結(jié)果？究其原因，具備熟練操作經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員是關(guān)鍵，一是這類人員動作熟練、操作速度快，可以顯著縮短卵母細(xì)胞離開卵泡后進(jìn)入體外成熟培養(yǎng)系統(tǒng)的時(shí)間。二是他們對采集卵母細(xì)胞的質(zhì)量判斷和形態(tài)學(xué)選擇更加準(zhǔn)確。因此，對初學(xué)者進(jìn)行必要的培訓(xùn)是快速提高操作人員技術(shù)水平的必由之路［8］。

與讓單個(gè)卵母細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)成熟同期化相比，欲使從屠宰廠采集的卵巢或活體采卵收集的卵母細(xì)胞群體中所有或絕大多數(shù)卵母細(xì)胞發(fā)育期達(dá)到同期化要相對更難些。前已述及，不僅卵母細(xì)胞的細(xì)胞周期需要同期化，而且附著在卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞也需要同期化，這對卵母細(xì)胞群體的同期化至關(guān)重要。而顆粒細(xì)胞的細(xì)胞周期一般為22～24 h。這也意味著與卵母細(xì)胞核成熟被抑制或停滯相比，卵母細(xì)胞群體的同期化可能需要更長時(shí)間。一般認(rèn)為群體卵母細(xì)胞的成熟不可能同時(shí)到達(dá)成熟（即第二次減數(shù)分裂的中期MⅡ）。通過匯總分析卵母細(xì)胞到達(dá)成熟的時(shí)間和數(shù)量等數(shù)據(jù)，可以得到卵母細(xì)胞的成熟率曲線，一般呈左半正態(tài)分布的狀態(tài)，這是目前衡量IVM卵母細(xì)胞成熟的一項(xiàng)重要指標(biāo)。當(dāng)成熟率曲線分布越廣，表明卵母細(xì)胞群中處于不同期狀態(tài)的卵母細(xì)胞數(shù)量越多，預(yù)示IVF效率越低；相反，當(dāng)成熟率曲線分布范圍越小，則說明卵母細(xì)胞群中到達(dá)成熟的時(shí)間比較集中、同期化程度較高，預(yù)示會有更多的卵母細(xì)胞可在最佳時(shí)間內(nèi)得以受精。因此，IVM卵母細(xì)胞成熟率曲線是提高卵母細(xì)胞體外成熟率的關(guān)鍵，也是決定動物體外胚胎生產(chǎn)效率最主要的因素之一。如何提高卵母細(xì)胞群體成熟率，同步、集中卵母細(xì)胞群體成熟時(shí)間，是目前全世界牛IVF技術(shù)領(lǐng)域面臨的共同挑戰(zhàn)。比較理想的解決思路就是設(shè)法讓所有的卵母細(xì)胞在IVM之前，像“百米短跑比賽”一樣，能夠“站在”同一起跑線上，即讓卵母細(xì)胞在進(jìn)入IVM培養(yǎng)前處于同一發(fā)育階段，不允許其停滯在原來的自然發(fā)育階段。這樣經(jīng)過同樣時(shí)間的IVM培養(yǎng)，就會有更多的卵母細(xì)胞共同發(fā)育、成熟到較為集中、統(tǒng)一的最佳受精時(shí)間，為后續(xù)受精和胚胎發(fā)育奠定物質(zhì)基礎(chǔ)［9］。有研究者采用蛋白合成抑制劑放線菌酮或絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶抑制劑6-二甲基氨基嘌呤處理卵母細(xì)胞24 h，以避免卵母細(xì)胞核的成熟［31］。他們發(fā)現(xiàn)幾乎所有被處理過的牛卵母細(xì)胞都停止在GⅤ期，表明抑制劑的作用是有效的。當(dāng)抑制劑被移除后，這些卵母細(xì)胞可以正常成熟和受精。采用放線菌酮處理后體外成熟的牛卵母細(xì)胞，經(jīng)過體外受精及胚胎培養(yǎng)，囊胚率略低于未經(jīng)抑制劑處理并在體外成熟22 h后的卵母細(xì)胞再進(jìn)行體外受精的對照組，但高于26 h受精的對照組；不過，放線菌酮處理48 h后卵母細(xì)胞可以正常成熟與受精，但沒有囊胚出現(xiàn)。而6-二甲基氨基嘌呤處理后的牛卵母細(xì)胞，盡管后續(xù)可發(fā)育至囊胚，但囊胚率低于未經(jīng)藥物處理的對照組，同時(shí)也低于放線菌酮處理組。同時(shí)，在含有放線菌酮的溶液中添加促卵泡素（FSH）＋17β-雌二醇（estradiol-17β，E2）或只添加17β-雌二醇處理，受精后的囊胚率與對照組沒有差異。更重要的是，將經(jīng)過放線菌酮處理24 h的卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精后得到的胚胎進(jìn)行受體移植，最終獲得2頭健康牛犢。這表明采用放線菌酮處理24 h的卵母細(xì)胞可以產(chǎn)生正常胚胎，且這些胚胎具有發(fā)育成動物個(gè)體的潛力。這為廣大研究人員打開了“新的窗口”，提供了解決問題的新思路。按照這個(gè)思路，筆者正在進(jìn)行中的試驗(yàn)取得的初步結(jié)果（尚未發(fā)表）表明，與對照組相比，對卵母細(xì)胞群體進(jìn)行同期化處理組的卵母細(xì)胞成熟率及受精48 h后的分裂率、囊胚率、胚胎質(zhì)量都有顯著提高。隨著對卵母細(xì)胞體內(nèi)發(fā)育過程的生理機(jī)制更為深入的研究和了解，加強(qiáng)對卵母細(xì)胞體外發(fā)育調(diào)控方法的創(chuàng)新和持續(xù)優(yōu)化，相信在不久的將來，這個(gè)長期困擾牛卵母細(xì)胞IVM的問題一定可以得到圓滿解決。

3 表觀遺傳學(xué)的變化

眾所周知，卵母細(xì)胞在體內(nèi)生長環(huán)境和體外成熟培養(yǎng)環(huán)境有著很大的不同。其中最大的不同是，體內(nèi)生長環(huán)境是一個(gè)動態(tài)的自主調(diào)控系統(tǒng)，即按照卵母細(xì)胞生長需求，機(jī)體不斷提供相應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)和調(diào)控因子，通過下丘腦-垂體-性腺軸的負(fù)反饋和正反饋調(diào)控機(jī)制調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞生長、發(fā)育、成熟和排卵所必需的生殖激素［11］。而體外培養(yǎng)環(huán)境是一個(gè)固定態(tài)，讓卵母細(xì)胞-顆粒細(xì)胞復(fù)合體在一個(gè)人為模擬體內(nèi)環(huán)境的條件下培養(yǎng)24 h。這個(gè)復(fù)合體需要在這個(gè)固定態(tài)的培養(yǎng)體系中進(jìn)行新陳代謝，溶液中被消耗的營養(yǎng)物質(zhì)和激素?zé)o法得到及時(shí)補(bǔ)充和更換，加上代謝產(chǎn)物也無法及時(shí)排出，這種雙重作用會直接導(dǎo)致卵母細(xì)胞-顆粒細(xì)胞復(fù)合體在發(fā)育成熟過程中的一些基因表達(dá)發(fā)生異常，從而使卵母細(xì)胞的成熟偏離正常的發(fā)育軌跡。因此，把這種卵母細(xì)胞基因本身沒有變化、但因環(huán)境因素改變而導(dǎo)致基因表達(dá)發(fā)生改變視為表觀遺傳的變化。例如，小鼠受精卵在Whitten培養(yǎng)液中培養(yǎng)至囊胚階段，與體內(nèi)的同期囊胚相比，有114個(gè)基因表達(dá)出現(xiàn)異常；而同樣的小鼠受精卵培養(yǎng)在KSOM＋氨基酸的溶液中，僅發(fā)現(xiàn)有29個(gè)基因表達(dá)出現(xiàn)異常［32］。由此可見，不同培養(yǎng)液對胚胎細(xì)胞發(fā)育的影響非常大。另外，由于采用卵母細(xì)胞-顆粒細(xì)胞復(fù)合體體外成熟培養(yǎng)，在細(xì)胞發(fā)育過成程中產(chǎn)生的各種代謝產(chǎn)物無法及時(shí)清除，造成一些有毒、有害代謝產(chǎn)物的積累，進(jìn)而對卵母細(xì)胞的成熟產(chǎn)生不良影響，其中代謝產(chǎn)生的過氧化物對卵母細(xì)胞或胚胎的毒害作用是研究人員應(yīng)特別關(guān)注的問題。另一方面，血清和氨基酸代謝產(chǎn)生的氨對細(xì)胞也有毒害作用，常導(dǎo)致胚胎在著床前印記基因的表達(dá)喪失或異常，這被認(rèn)為是導(dǎo)致牛羊出現(xiàn)“大胎兒綜合征（large offspring syndrome，LOS）的主要原因。大約10% 的體外生產(chǎn)胚胎在移植后可能出現(xiàn)“大胎兒綜合癥”［33］。因此，目前的卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)體系與機(jī)體自身卵泡內(nèi)成熟系統(tǒng)相比，遠(yuǎn)沒有達(dá)到理想條件。這也說明改善牛卵母細(xì)胞的IVM仍然有很大提升空間。

目前，絕大多數(shù)已發(fā)表的有關(guān)動物卵母細(xì)胞體外成熟的文章都屬于表觀遺傳變化范疇，歸納起來主要包括：（1）營養(yǎng)物質(zhì)或代謝對卵母細(xì)胞成熟的影響。例如溶液成分［34-35］、氨基酸［36］、脂肪因子［37］、氧氣與葡萄糖［38］、茴香腦［39］、DMSO［40］、葉酸［41］等。（2）各種激素、生長因子（包括旁激素對卵母細(xì)胞成熟的影響）。例如雌激素［42］、上皮生長因子（EGF）和透明質(zhì)酸［43］、前列腺素［44］、促卵泡素（FSH）［45］、L-半胱氨酸、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-15（BMP15）和生長分 化 因 子 -9（GDF9）［46］、白 血 病 抑 制 因 子（LIF）［47-48］等。（3）抗氧化劑或緩解代謝毒素對卵母細(xì)胞成熟的影響。例如褪黑色素（melatonin）［49-50］、番茄紅素（lycopene）［51］、諾比列?。∟obiletin）［52］等。盡管類似的探索試驗(yàn)還有很多，但絕大多數(shù)結(jié)果與試驗(yàn)條件有很大的關(guān)系。有些試驗(yàn)結(jié)果報(bào)道有效，但有些試驗(yàn)結(jié)果是不可重復(fù)的。

4 小結(jié)和展望

與其他很多學(xué)科和技術(shù)相比，IVF技術(shù)仍然非常年輕。從IVF包括IVM建立以來，只在短短的30年時(shí)間里，這項(xiàng)技術(shù)不僅累計(jì)產(chǎn)生了近千萬的“試管嬰兒”，為許多不孕不育家庭解除了痛苦、帶來了歡樂，而且正在或?qū)⒃谔岣呒倚笊a(chǎn)率和改良動物育種效率上發(fā)揮越來越重要的作用。近兩年，國內(nèi)以牛IVF技術(shù)為基礎(chǔ)的生物技術(shù)公司不斷涌現(xiàn)，標(biāo)志著IVF技術(shù)已經(jīng)初步具備了商業(yè)化生產(chǎn)的條件和基礎(chǔ)。隨著國內(nèi)動物育種（特別是牛育種）的發(fā)展和日益增長的市場需求，我國牛IVF技術(shù)也將迎來一個(gè)重要的發(fā)展機(jī)遇期。同時(shí)應(yīng)該看到，目前國內(nèi)體外受精技術(shù)水平與國際相比，無論是在科研還是在生產(chǎn)應(yīng)用上都存在很大差距。一方面我們深切感到將現(xiàn)代動物繁殖生物新技術(shù)應(yīng)用到動物育種上的緊迫感，另一方面又面臨著相關(guān)技術(shù)瓶頸的限制。因此，加快牛IVF技術(shù)由研究轉(zhuǎn)向應(yīng)用，必須從關(guān)鍵技術(shù)層面解決好主要瓶頸問題。盡管到目前為止，牛IVF技術(shù)研究涉及的相關(guān)因素至少有上百種，但在本文中僅簡要?dú)w納為三類，其中前兩項(xiàng)最為重要，也是難度最大的。這是多年來筆者在IVF科研實(shí)踐與推廣應(yīng)用中收獲的體會。

生產(chǎn)效率是一項(xiàng)技術(shù)轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力的生命線，沒有生產(chǎn)效率的技術(shù)是失敗技術(shù)。因此，需要廣大科研和推廣工作人員立足實(shí)際，通過聯(lián)合研發(fā)、集成協(xié)作、實(shí)驗(yàn)示范，著力解決IVF技術(shù)中存在的主要問題，力爭使我國早日進(jìn)入到該技術(shù)世界先進(jìn)水平，為牛OPU-IVF-ET技術(shù)在我國牛育種中快速、高效應(yīng)用奠定扎實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)和平臺。