骨髓間充質(zhì)干細胞外泌體中miRNA在視網(wǎng)膜新生血管形成中的作用及機制

張 璐，王雅芬，葉亞婷，白 倩，郭長梅

0引言

視網(wǎng)膜血管疾病如早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity, ROP)、糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)和視網(wǎng)膜靜脈阻塞等以異常增生的視網(wǎng)膜新生血管為主要病理表現(xiàn)。在該類病變中，均有不同程度的視網(wǎng)膜血管損害導致的血管閉塞，進一步引起視網(wǎng)膜缺血而促進異常視網(wǎng)膜新生血管(retinal neovascularization, RNV)的增生[1]。RNV異常的細胞組成損害血視網(wǎng)膜屏障，血管的脆性增加易導致視網(wǎng)膜出血、滲出、玻璃體腔出血甚至纖維血管增殖牽拉致視網(wǎng)膜脫離，使視力惡化甚至喪失[2]?，F(xiàn)多以激光光凝、抗血管內(nèi)皮生長因子藥物或手術治療[3]，但均有不同程度的限制性和并發(fā)癥。近年來有研究表明，骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)通過旁分泌作用釋放的外泌體(exosomes, Exo)可有效降低氧誘導視網(wǎng)膜病變模型小鼠(oxygen-induced retinopathy, OIR)視網(wǎng)膜缺血的嚴重程度。本文闡明了BMSCs及其衍生Exo-miRNA對RNV形成的作用及機制。

1骨髓間充質(zhì)干細胞和外泌體及外泌體源性miRNA概述

1.1骨髓間充質(zhì)干細胞概述間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一種來源于骨髓、脂肪、臍帶和胎盤組織，以炎癥分解、傷口愈合和維持具有高異質(zhì)性的內(nèi)穩(wěn)態(tài)而聞名的祖細胞[4]，具有塑性黏附性和多譜系分化特性，而且還能表達特定的表面標記[5]。被認為在疾病治療方面極具潛力，但近來研究表明，玻璃體腔內(nèi)直接注射MSCs可能誘導正常和病變視網(wǎng)膜的血管擴張、白內(nèi)障和視網(wǎng)膜炎癥反應，這表明使用干細胞治療視網(wǎng)膜疾病存在一定風險[6]。然而其旁分泌效應產(chǎn)生的營養(yǎng)和免疫抑制因子等，能夠通過血視網(wǎng)膜屏障而無明顯免疫、炎癥反應，可以作為葡萄膜炎、青光眼、視網(wǎng)膜和眼表疾病細胞治療的新型治療藥物[7]。因此，在新生血管性視網(wǎng)膜疾病中，BMSCs對損傷視網(wǎng)膜的旁分泌營養(yǎng)效應可能是一種比直接細胞治療視網(wǎng)膜功能障礙更安全有效的方法[8]。

1.2外泌體概述Exo是細胞內(nèi)多囊泡體與細胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中，以旁分泌等途徑到達受體細胞，通過細胞表面結(jié)合蛋白或膜融合傳遞物質(zhì)的一類直徑約為30～100nm的膜性囊泡[9-10]。其來源和分布廣泛，可由多種細胞所分泌。Exo的內(nèi)容物豐富，含有細胞因子、蛋白、RNA、miRNA和脂質(zhì)等，參與了如免疫應答、細胞間通訊、蛋白質(zhì)和RNA轉(zhuǎn)運等多種生理過程，是一種重要的細胞間物質(zhì)和信息交流的工具[11-12]。

1.3外泌體源性miRNA概述MicroRNA是一種小分子量單鏈非編碼RNA，可以通過抑制mRNA翻譯或促進mRNA降解來下調(diào)靶基因的表達，作為負性調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼基因而促進生理和病理血管生成[13-14]。Exo對疾病的作用與miRNA有著密切的關系。心肌缺血等疾病中，BMSCs分泌包含有miR-125b的Exo可通過靶向SIRT7途徑保護心肌細胞以免受缺血再灌注損傷[15]。卵巢疾病中，攜帶有miR-644-5p的BMSCs-Exo通過靶細胞的p53來改善卵泡形態(tài)、抑制卵巢顆粒細胞的凋亡，對卵巢功能早衰恢復卵巢功能具有潛在治療效果[16]。同樣，Exo在眼部疾病中的作用與miRNA的重要關系也已被證實。青光眼中，BMSCs衍生的Exo對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cell, RGC)及軸突的神經(jīng)保護作用，正是通過Exo成功地將多種miRNA遞送到視網(wǎng)膜內(nèi)層，與效應分子Argonaute-2相互作用促進RGC的存活及其軸突的再生[17]。

已有研究表明，腫瘤細胞的Exo能夠調(diào)控免疫功能、促進腫瘤血管新生和侵襲而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[18-19]。由于腫瘤形成發(fā)展過程伴隨著含miRNA的Exo向胞外基質(zhì)的釋放，并且在所有的生物體液中幾乎均可發(fā)現(xiàn)由各類細胞衍生的Exo，使它們作為微創(chuàng)性液體活檢的一種方式極具吸引力[20]。如體循環(huán)Exo-miR-21升高與膠質(zhì)細胞瘤、胰腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、卵巢癌和食管癌有關，尿源性Exo-miR-21升高與膀胱癌和前列腺癌有關[21]。因此，對體液中Exo及Exo-miRNA的檢測將為腫瘤的臨床診斷和預后評估提供新的方式[22]。與腫瘤類似，新生血管性視網(wǎng)膜疾病中，也有血管異常增生的現(xiàn)象，且在眼部疾病中，Exo及Exo-miRNA越來越被認為是調(diào)節(jié)視覺系統(tǒng)中細胞間通信的重要因子，并且現(xiàn)在正作為生物標志物、治療劑和藥物遞送載體被廣泛探索[23]。

由于目前眼科研究中，視網(wǎng)膜新生血管形成相關研究大多以人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)作為視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞的替代，故本文通過介紹BMSCs來源Exo-miRNA對HUVECs的作用，說明在視網(wǎng)膜血管疾病中可能的作用及機制。

2 BMSCs調(diào)控新生血管形成的作用及機制

2.1BMSCs直接調(diào)控新生血管形成既往已有研究證實BMSCs釋放血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、IL-6等血管生長因子來促進新生血管形成[24]。對比骨髓和人胎盤來源MSCs條件培養(yǎng)基中的血管生長因子，可見BMSCs來源培養(yǎng)基中，VEGF、肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白IGFBP2和IGFBP6的水平明顯較高[25]。Hou等[26]已證明了BMSCs在眼內(nèi)對脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)病變所產(chǎn)生的影響，缺氧誘導miR-188-5p的降低直接上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-13)的表達促進BMSCs等骨髓來源干細胞向CNV病變發(fā)生處遷移，從而促進了脈絡膜中病理性新生血管的形成而增加CNV病變的嚴重程度。

2.2巨噬細胞介導BMSCs調(diào)控新生血管形成BMSCs還可在巨噬細胞的介導下促進新生血管形成。BMSCs可在M2型巨噬細胞通過VEGF和趨化因子基質(zhì)細胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1, SDF-1)等細胞因子介導下發(fā)生動員、遷移并募集至缺氧的視網(wǎng)膜中，進一步分化為血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞等血管細胞及結(jié)締組織細胞促進新生血管形成，而參與RNV的形成[27-28]。

去除OIR小鼠模型玻璃體內(nèi)的巨噬細胞可減緩RNV病變程度，表明缺血缺氧引發(fā)的病理性新生血管與巨噬細胞的聚集有關[29]。OIR小鼠模型中，在該過程中起主要作用的色素上皮衍生因子(PEDF)是一種天然的病理性血管生成抑制劑，通過調(diào)節(jié)MAPKs的磷酸化來介導巨噬細胞的極化。MAPKs的激活影響M2型巨噬細胞極化，而Notch1途徑影響M1型巨噬細胞極化，雖然M1和M2型巨噬細胞在體內(nèi)外均可促進新生血管形成，但與HUVECs的共培養(yǎng)中，M2型巨噬細胞在促進細胞增殖中更具潛力[30]。對比M1和M2型巨噬細胞與人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)后對內(nèi)皮細胞的增殖程度和管腔形成的提高效果，可見M2型巨噬細胞增加的程度更為顯著[31]。

除自身促進血管生成的效應外，M2型巨噬細胞還可在缺氧條件下促進BMSCs的遷移和分化。將BMSCs注射入心肌中，鄰近BMSCs的巨噬細胞表現(xiàn)出M2標記物精氨酸酶-1(Arg1)的強表達。體外實驗BMSCs共培養(yǎng)骨髓源性巨噬細胞，誘導型一氧化氮合酶(iNOS)等M1標志物明顯減少，Arg1等M2標志物顯著增加[32]。用M2型巨噬細胞的培養(yǎng)基培養(yǎng)BMSCs，可檢測到SDF-1、CXCR4、VEGF和MMP-9的表達增高，表明M2型巨噬細胞通過SDF-1/CXCR4信號通路在促進BMSCs的遷移分化，進而促進新生血管形成的過程中發(fā)揮重要作用。

3 BMSCs-Exo調(diào)控新生血管形成的作用及機制

近年來研究表明，在心血管疾病中，內(nèi)皮細胞功能改變在疾病發(fā)展不同階段起關鍵作用[33]。該進程由BMSCs通過旁分泌釋放Exo調(diào)控，BMSCs-Exo在體外促進HUVECs的管腔形成，而且在心肌梗死小鼠模型中，也具有增強心臟血管密度和募集心臟祖細胞能力[34]。另外，BMSCs-Exo可通過調(diào)控miR-494等miRNA的含量增強血管生成[35]。

Bian等[36]發(fā)現(xiàn)缺氧刺激下BMSCs可釋放細胞外囊泡，迅速被HUVECs攝取，能夠以劑量依賴性的方式促進HUVECs的增殖、遷移和管腔形成。體外模擬外周動脈疾病，MSCs釋放Exo的劑量與新生血管形成之間形成劑量依賴關系，當濃度最高達到100ng/mL時促血管生成能力降低[37]。其機制與NF-κB信號通路有關，NF-κB信號通路可調(diào)節(jié)細胞生長分化和存活發(fā)育，是重要的血管生成調(diào)節(jié)通路[38]。在抑制了NF-κB信號通路之后Exo誘導管腔形成的能力顯著下降，證明了NF-κB信號通路在Exo介導的新生血管形成中的重要作用，且該作用具有顯著的劑量依賴效應[37]。

4 BMSCs來源Exo-miRNA調(diào)控新生血管形成的作用及機制

4.1Exo-miRNA促進新生血管形成的作用及機制Gong等[39]學者的研究發(fā)現(xiàn)MSCs-Exo可促進HUVECs管腔結(jié)構(gòu)的形成。在抑制Exo中miR-30b的表達后，血管生成的能力顯著降低。這證明了MSCs通過釋放Exo將miR-30b、miR-30c、miR-424、let-7f轉(zhuǎn)移至內(nèi)皮細胞來動員內(nèi)皮細胞增殖、遷移和形態(tài)改變而促進血管生成。此外，MSCs-Exo所包含的生長因子、細胞因子和趨化因子也可能參與血管生成。

新生血管性視網(wǎng)膜疾病主要改變是病理性增生的RNV，RNV的形成與缺氧有密不可分的關系。在缺氧環(huán)境中，會產(chǎn)生更多的活性氧(reactive oxygen species, ROS)來介導缺氧誘導的細胞反應，當ROS的產(chǎn)生超過內(nèi)源性抗氧化劑的能力時，就會發(fā)生氧化應激[40]。檢測缺氧刺激后的OIR小鼠視網(wǎng)膜可見ROS的大量積累，組織缺氧和ROS使得VEGF-A和缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor-1, HIF-1α)表達明顯增加而介導新生血管的形成[41]。HIF-1α在100多個基因的轉(zhuǎn)錄控制中起關鍵作用，這些基因調(diào)控血管生成、葡萄糖和能量代謝、紅細胞生成、細胞增殖和活力等功能[42]。Sun等[43]將HIF-1α過表達的BMSCs-Exo與缺氧處理的HUVECs共培養(yǎng)，可顯著提高新生血管管腔的長度和數(shù)量。

Zhu等[34]對BMSCs缺氧處理誘導細胞中HIF-1α升高，升高的HIF-1α通過直接調(diào)控中性鞘磷脂酶-2(nSMase2)的表達使其較常氧環(huán)境下顯著增加，增強BMSCs-Exo釋放及囊泡活性，而上調(diào)Exo-miR-210含量，進而提高HUVECs中VEGF含量以促進血管生成，增強血管內(nèi)皮細胞的管腔形成能力及心臟保護作用。這可能是由于HIF-1α調(diào)控異質(zhì)性胞核核糖核蛋白(hnRNPs)的表達，使得miR-210通過與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合形成復合物呈hnRNPs依賴性途徑運輸?shù)紼xo中，以保持穩(wěn)定性并發(fā)揮生物合成及信息交換等關鍵作用[44-45]。另一方面，HIF-1α通過結(jié)合鞘磷脂磷酸二酯酶3(SMPD3)基因啟動子序列中假定的缺氧反應元件(HREs)導致下游靶點nSMase2表達增加了神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生，進一步促進包含有miR-210的Exo裝載釋放[34]。

其中，Exo隨旁分泌到達靶細胞后通過與特定表面蛋白的受體結(jié)合，觸發(fā)融合作用而直接與質(zhì)膜融合，或由靶細胞內(nèi)吞作用將其內(nèi)容物釋放到目標細胞質(zhì)中[9]。BMSCs-Exo中所含的Jagged1作為關鍵參與者介導該過程。Jagged1是Notch信號的配體，隨HIF-1α升高而在細胞與BMSCs-Exo中均有顯著升高，通過介導HUVECs中Notch信號靶基因HES1和HEY2的表達促進血管形成[46]。

王雅芬等[47]收集缺氧條件下的BMSCs條件培養(yǎng)基，與視網(wǎng)膜脈絡膜組合細胞(RF/6A)共培養(yǎng)后檢測細胞的遷移能力和管腔形成能力，均可見明顯提升。也就是說BMSCs對RF/6A可起到相同的促進內(nèi)皮細胞遷移和管腔形成作用，該作用通過BMSCs的條件培養(yǎng)基產(chǎn)生，說明很可能同樣由Exo及其中的miRNA介導，故進一步探索Exo-miRNA在RNV和CNV形成中的作用及機制具有重要意義。

4.2Exo-miRNA抑制新生血管形成的作用及機制Exo-miRNA不僅可以促進RNV形成參與視網(wǎng)膜血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程，還可以抑制RNV形成對該類疾病起治療效果。如在DR中，高糖誘導內(nèi)皮細胞中ROS增加發(fā)生氧化應激，繼之視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞損傷而RNV形成是DR的病理生理學表現(xiàn)之一[48]。此過程中可檢測到視網(wǎng)膜Müller細胞中的VEGF等促進新生血管形成相關因子增加。Li等[49]檢測DR視網(wǎng)膜細胞中各項指標的變化情況，發(fā)現(xiàn)miR-486-3p的表達量顯著降低以及TLR4、NF-κB的表達量顯著上調(diào)。miR-486-3p具有抗氧化應激，減少ROS的作用，在腫瘤細胞、2型糖尿病、PM2.5導致的肺泡上皮細胞損傷中均有所降低[50-52]。TLR4、NF-κB則與抑制視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞氧化應激及炎癥相關，TLR4在伴隨微血管并發(fā)癥的糖尿病患者單核細胞中表達增高[53]。將BMSCs來源的Exo-miR-486-3p與Müller細胞共培養(yǎng)后，VEGF等促血管形成相關因子的表達量有所下降，從而抑制了高糖環(huán)境中視網(wǎng)膜新生血管的形成。同時，miR-486-3p可通過TLR4/NF-κB信號通路減少氧化應激造成的細胞損傷[49]。由此可見，BMSCs來源Exo-miRNA不僅在疾病的發(fā)生中起作用，還可在視網(wǎng)膜血管疾病的治療中發(fā)揮積極效應。

5小結(jié)與展望

Exo作為一種性質(zhì)較為穩(wěn)定的物質(zhì)，其易保存和運輸?shù)奶匦詷O大提升了在治療等領域的應用價值。近期Yao等[54]為拓寬Exo在心肌缺血治療方面的應用，開創(chuàng)了一種內(nèi)含Exo的微創(chuàng)噴霧制劑來在最大限度保留Exo生物功能的基礎上避免開胸手術等創(chuàng)傷性治療方式，達到增強心臟功能，減少心肌梗死面積的療效。同樣，在眼科疾病的診斷與治療過程中，Exo及Exo來源miRNA與角膜損傷、DR、青光眼和葡萄膜黑色素瘤等疾病存在密切關系[55-56]。Moisseive等[57]將BMSCs-Exo注射入OIR小鼠玻璃體腔，可顯著減緩視網(wǎng)膜缺血嚴重程度和視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)展，而無炎癥及免疫反應的發(fā)生。這與部分體外實驗中BMSCs-Exo對內(nèi)皮細胞的作用相反，可能與其所處的微環(huán)境相關。因此，本文簡要概述BMSCs來源Exo-miRNA在RNV形成的發(fā)病機制中所起的作用及機制，有利于為全面認識其應用方式以及潛在治療效果提供幫助。故進一步探索BMSCs-Exo在RNV和CNV等新生血管性眼病中的作用及機制，以及不同作用效果產(chǎn)生的微環(huán)境及條件對于BMSCs-Exo以安全、有效的方式運用于臨床實踐具有重要的意義。