單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在年齡相關(guān)性黃斑變性研究中的應(yīng)用

安 寧，張福燕，秦 波

0引言

細(xì)胞在多次分裂增殖期間發(fā)生分子生物學(xué)或基因的改變，產(chǎn)生細(xì)胞狀態(tài)或類型的多樣性，這種多樣性被稱為細(xì)胞異質(zhì)性，普遍存在于多細(xì)胞生物個(gè)體中。傳統(tǒng)的測(cè)序方法忽視細(xì)胞異質(zhì)性，只能反映細(xì)胞群體的平均差異，而單細(xì)胞技術(shù)可揭示細(xì)胞間異質(zhì)性，在更深層次上探究生命活動(dòng)的本質(zhì)和規(guī)律。2013年單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)被Science評(píng)為年度最值得關(guān)注的六大領(lǐng)域榜首，NatureMethods將該技術(shù)評(píng)為2013年度最重要的方法學(xué)，2015年再度登上ScienceTranslationalMedicine封面，2018年單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(single-cell RNA-sequencing，scRNA-seq)被Science評(píng)為年度突破技術(shù)，2019/2020年單細(xì)胞多組學(xué)和單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序再次評(píng)為年度技術(shù)，成為最值得期待的生物技術(shù)之一。scRNA-seq在單細(xì)胞水平對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序，直接比較來(lái)自不同生物條件的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組信息，對(duì)細(xì)胞分群、發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞類型、識(shí)別疾病進(jìn)展中起重要作用的罕見(jiàn)細(xì)胞、理解細(xì)胞異質(zhì)性、生物多樣性等具有重要意義。目前scRNA-seq已被應(yīng)用于眼科領(lǐng)域，其在視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜生理學(xué)、視網(wǎng)膜疾病如年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)中的研究日新月異，為探究ARMD病因，發(fā)展規(guī)律和靶向治療提供新的視角。

1 scRNA-seq技術(shù)簡(jiǎn)介

scRNA-seq是在單細(xì)胞水平對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序的一項(xiàng)新技術(shù)，其技術(shù)路線包括單細(xì)胞捕獲、mRNA反轉(zhuǎn)錄、cDNA擴(kuò)增、測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建、高通量測(cè)序和數(shù)據(jù)分析[1]。目前提取單細(xì)胞的方法有：熒光激活細(xì)胞分選、激光捕獲顯微切割、手動(dòng)細(xì)胞分選、微流體和微孔等[2]。一個(gè)單細(xì)胞中的總RNA量大約只有10pg，而其中的mRNA含量只有0.2pg，為獲得足夠的轉(zhuǎn)錄信息，需要進(jìn)行擴(kuò)增，目前常用的擴(kuò)增方法包括PCR擴(kuò)增法、IVT擴(kuò)增法、等溫?cái)U(kuò)增法等，其中PCR擴(kuò)增法中的Smart-seq(switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript)/Smart-seq2具有里程碑意義[3-4]，其利用mRNA識(shí)別序列、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶等方法既能將mRNA高效擴(kuò)增到需要的數(shù)量級(jí)，又可盡量避免PCR偏差而得到均一覆蓋的文庫(kù)。IVT擴(kuò)增如CEL-seq(cell expression by linear amplifcation and sequencing)/CEL-seq2[5]采用線性擴(kuò)增的測(cè)序方法使擴(kuò)增錯(cuò)誤率降低。利用Phi29聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增的PMA法[6]屬于等溫?cái)U(kuò)增法，但擴(kuò)增隨機(jī)性大，時(shí)常會(huì)導(dǎo)致整個(gè)基因組不同區(qū)域的擴(kuò)增倍數(shù)相差巨大。目前常用的單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)是基于微流控體系的10X Genomis公司的液滴法[7]及BD公司的微孔法[8]，它們把單細(xì)胞提取、附加DNA標(biāo)簽、mRNA捕獲、mRNA反轉(zhuǎn)錄與擴(kuò)增、cDNA建庫(kù)和高通量測(cè)序后的數(shù)據(jù)分析整合在一起，大大提升了單細(xì)胞測(cè)序通量和成本，還能得到帶有獨(dú)特分子標(biāo)簽的單細(xì)胞基因序列信息。液滴法通過(guò)微流控技術(shù)將帶有barcode、UMI分子標(biāo)簽、引物及酶的凝膠微珠與單細(xì)胞混合形成顆粒，做出一個(gè)基于油包水乳濁液酶反應(yīng)原理的分子生物學(xué)分析系統(tǒng)。微孔法是將細(xì)胞懸液與標(biāo)記磁珠加入含有約200000個(gè)孔的蜂窩板，每個(gè)孔中容納一個(gè)細(xì)胞，不僅可一次性捕獲大量細(xì)胞，還能同時(shí)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組和蛋白組測(cè)序。獲得的海量數(shù)據(jù)需要進(jìn)一步處理分析，進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控、基因組對(duì)比、數(shù)據(jù)歸一化(包括消除基因特異性偏差和調(diào)整細(xì)胞間計(jì)數(shù)分布差異等)，然后使用細(xì)胞聚類分析、主成分分析和t-分布隨機(jī)鄰域嵌入算法等進(jìn)行線性與非線性降維，實(shí)現(xiàn)對(duì)高維數(shù)據(jù)的降維和可視化[9-10]，最終獲得大量單細(xì)胞基因序列信息。

2 scRNA-seq在神經(jīng)視網(wǎng)膜研究中的應(yīng)用

2.1scRNA-seq在神經(jīng)視網(wǎng)膜細(xì)胞類型鑒定中的應(yīng)用scRNA-seq在眼科中的應(yīng)用主要集中在視網(wǎng)膜細(xì)胞亞型、相關(guān)基因表達(dá)和通路的研究上。視網(wǎng)膜是高度異質(zhì)性的組織，通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和分子學(xué)標(biāo)準(zhǔn)將神經(jīng)視網(wǎng)膜分為神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、雙極細(xì)胞、無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞、水平細(xì)胞、光感受器細(xì)胞5種類型，scRNA-seq還可將其再細(xì)分為100多種細(xì)胞亞型[11]。例如，Rheaume等[12]確定了40個(gè)不同的鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞簇，并在每種細(xì)胞類型中鑒定了富集的基因，且在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞亞型中確定了區(qū)分左右眼的特異性標(biāo)記基因，Shekhar等[13]將鼠雙極細(xì)胞分為15個(gè)細(xì)胞簇，Macosko等[14]在小鼠視網(wǎng)膜中鑒定了21個(gè)不同的無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞簇。細(xì)胞亞型的進(jìn)一步細(xì)化分類，能將細(xì)胞的基因表達(dá)特征與其功能和形態(tài)學(xué)特征聯(lián)系起來(lái)。

2.2scRNA-seq在黃斑中心凹與外周神經(jīng)視網(wǎng)膜差異基因分析中的應(yīng)用黃斑中心凹處的神經(jīng)元信息傳遞呈單線連接，故此區(qū)視覺(jué)非常敏銳，當(dāng)黃斑區(qū)病變時(shí)，視力明顯下降，為比較黃斑中心凹與外周神經(jīng)視網(wǎng)膜細(xì)胞的區(qū)別，有研究從死亡后6h內(nèi)處理的三組人類供體眼獲得中心凹和外周神經(jīng)視網(wǎng)膜樣本，得到8217個(gè)細(xì)胞，scRNA-seq發(fā)現(xiàn)外周神經(jīng)視網(wǎng)膜視錐細(xì)胞明顯少于中心凹，且中心凹視錐細(xì)胞富含PCP4、YBX1、PRDX1等，其分別在突觸可塑性蛋白形成、細(xì)胞增殖和應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮作用[15-17]。此外，Banin等[18]報(bào)道了黃斑區(qū)20個(gè)高表達(dá)基因(如SLC17A6、SNCG、NEFL、NET1、STMN2、YWHAH、UCHL1、DPYSL2、APP、NDRG4、TUBA1B、MDH1、EEF2)和23個(gè)在視網(wǎng)膜周邊區(qū)域高表達(dá)的基因(如SAG、RCVRN、UNC119、GPX3、PDE6G、ROM1、ABCA4、DDC、PDE6B、GNB1、NRL)。中心凹Müller細(xì)胞也表現(xiàn)出不同于外周神經(jīng)視網(wǎng)膜的基因表達(dá)譜，中央凹Müller細(xì)胞富含F(xiàn)ABP5(參與神經(jīng)元分化和神經(jīng)元損傷的恢復(fù)[19])、HES5(與膠質(zhì)形成有關(guān))，外周Müller細(xì)胞富含轉(zhuǎn)鐵蛋白和金屬硫蛋白基因家族成員MT1G和MT3。且總體而言，Müller細(xì)胞的許多基因在不同的單細(xì)胞數(shù)據(jù)集上表現(xiàn)出一致的中心凹或外周神經(jīng)視網(wǎng)膜富集。這些研究提供了黃斑中心凹具有敏銳視覺(jué)的理論支持。

3 scRNA-seq在視網(wǎng)膜色素上皮層和脈絡(luò)膜研究中的應(yīng)用

3.1scRNA-seq在視網(wǎng)膜色素上皮層和脈絡(luò)膜生理學(xué)研究中的應(yīng)用視網(wǎng)膜色素上皮層(retinal pignebt epithelium,RPE)與脈絡(luò)膜聯(lián)系緊密，RPE-玻璃膜-脈絡(luò)膜毛細(xì)血管復(fù)合體對(duì)維持光感受器微環(huán)境有重要作用，RPE為感覺(jué)層視網(wǎng)膜的外層細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)，吞噬和消化光感受器細(xì)胞外節(jié)膜盤(pán)維持新陳代謝。脈絡(luò)膜是一種多樣化的結(jié)締組織，包括施萬(wàn)細(xì)胞、黑素細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和幾類常駐白細(xì)胞，scRNA-seq鑒定了兩組在轉(zhuǎn)錄上不同的施萬(wàn)細(xì)胞簇[20]，它們均表達(dá)典型的施萬(wàn)細(xì)胞標(biāo)志物PLP1，其中簇1高表達(dá)髓鞘蛋白(MPZ)和髓鞘堿性蛋白(MBP)，簇2高表達(dá)非髓鞘施萬(wàn)細(xì)胞基因SCN7A和NCAM1[21]，有髓軸突的傳導(dǎo)速度更快，但缺少髓鞘的軸突是受損軸突的快速反應(yīng)者[22]。脈絡(luò)膜血管豐富，在解剖學(xué)上分為三層，深大口徑血管(Haller層)，中等口徑血管(Sattler層)，以及致密的淺表毛細(xì)血管網(wǎng)，此血管系統(tǒng)向外層視網(wǎng)膜供應(yīng)約85%的血液。scRNA-seq檢測(cè)了上訴三層的特異表達(dá)基因，動(dòng)脈表達(dá)SEMA3G、HEY1，靜脈表達(dá)DARC，脈絡(luò)膜毛細(xì)血管表達(dá)CA4、PLVAP[20]。ARMD的發(fā)病特征為光感受器細(xì)胞的進(jìn)行性損傷，因此，研究RPE-玻璃膜-脈絡(luò)膜毛細(xì)血管復(fù)合體生理學(xué)為進(jìn)一步理解ARMD發(fā)病機(jī)制有較大意義。

3.2scRNA-seq在黃斑區(qū)和外周視網(wǎng)膜色素上皮層或脈絡(luò)膜差異基因表達(dá)研究中的應(yīng)用ARMD的解剖學(xué)異常集中在黃斑區(qū)RPE和脈絡(luò)膜，而某些遺傳性視網(wǎng)膜疾病如視網(wǎng)膜色素變性病變位于外周視網(wǎng)膜，這種損傷模式被認(rèn)為是由于黃斑區(qū)和外周RPE或脈絡(luò)膜之間的分子差異導(dǎo)致，激發(fā)了學(xué)者對(duì)這兩個(gè)區(qū)域分子差異的研究。Mullins等[23]利用RNA測(cè)序和qPCR研究發(fā)現(xiàn)黃斑和外周RPE或脈絡(luò)膜之間存在差異表達(dá)的基因，例如，BEST1在外周RPE細(xì)胞中高表達(dá)，ICAM1在黃斑區(qū)脈絡(luò)膜中高表達(dá)，此結(jié)果在scRNA-seq中得到印證。以往的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)比較黃斑區(qū)和外周RPE或脈絡(luò)膜基因后發(fā)現(xiàn)許多RPE特異性基因，如LRAT、RPE65，總體表現(xiàn)為在外周視網(wǎng)膜中的高度富集[24]，然而scRNA-seq中，這些RPE特異性基因在黃斑和外周的表達(dá)量非常相似。這種差異歸因于黃斑區(qū)與外周脈絡(luò)膜細(xì)胞密度的不同，脈絡(luò)膜在黃斑以下最厚，徑向變薄[25]，RPE特異性基因表達(dá)量被黃斑區(qū)中更多的脈絡(luò)膜細(xì)胞稀釋，使這類基因在外周視網(wǎng)膜表達(dá)顯得更高，scRNA-seq消除這一誤差，體現(xiàn)了其區(qū)別于傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)只反映細(xì)胞群平均差異的優(yōu)勢(shì)。scRNA-seq為深刻理解視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜生理學(xué)提供了巨大幫助，突出各種細(xì)胞類型之間的特征，提高對(duì)視網(wǎng)膜生理和疾病區(qū)域特異性的理解，為如何應(yīng)對(duì)視網(wǎng)膜損傷提供新的方向。

4 scRNA-seq在ARMD研究中的應(yīng)用

ARMD能導(dǎo)致患者中心視力的不可逆損傷，是嚴(yán)重的致盲性眼病，臨床上將其分為以視網(wǎng)膜玻璃膜疣為特征的干性ARMD和以新生血管生長(zhǎng)為特征的濕性ARMD，其與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、氧化應(yīng)激等的相關(guān)性成為近年的研究熱點(diǎn)。

4.1scRNA-seq在ARMD與炎癥反應(yīng)相關(guān)性研究中的應(yīng)用Newman等[26]從基因組水平發(fā)現(xiàn)ARMD與炎癥反應(yīng)的相關(guān)性，其與許多趨化因子的高表達(dá)有關(guān)。年齡是ARMD最重要的危險(xiǎn)因素，Voigt等[20]通過(guò)scRNA-seq確定了嬰兒和成人脈絡(luò)膜內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的差異，嬰兒內(nèi)皮細(xì)胞富含的KLF2、NR4A1、NR2F2能下調(diào)炎性表面黏附分子的表達(dá)，成人內(nèi)皮細(xì)胞則表現(xiàn)出更多促炎基因的表達(dá)，包括黏附分子VCAM1、ICAM1、SELE、SELP以及趨化因子受體ACKR3等[27]。隨著年齡的增長(zhǎng)，脈絡(luò)膜內(nèi)皮細(xì)胞炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生有誘發(fā)ARMD的可能。

4.2scRNA-seq在ARMD與免疫系統(tǒng)相關(guān)性研究中的應(yīng)用Newman等[26]提出細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)是ARMD的核心特征，推斷ARMD可能是一類具有共同免疫反應(yīng)過(guò)程的疾病。ARMD的蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，脈絡(luò)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞高度表達(dá)HLA-A抗原、CA4和PLVAP[28]等免疫因子。肥大細(xì)胞脫顆粒[29]和巨噬細(xì)胞向脈絡(luò)膜募集增加[30]與ARMD的發(fā)病有關(guān)。補(bǔ)體系統(tǒng)是一個(gè)復(fù)雜的固有免疫監(jiān)視系統(tǒng)，補(bǔ)體基因的多態(tài)性與ARMD易感性密切相關(guān)[31]，補(bǔ)體因子H(complement factor H,CFH)是補(bǔ)體替代途徑的負(fù)調(diào)節(jié)因子，CFH可增強(qiáng)RPE抗氧化應(yīng)激的能力，該基因的單核苷酸多態(tài)性能顯著增加ARMD的患病風(fēng)險(xiǎn)[32]。多種補(bǔ)體基因如補(bǔ)體因子B(CFB)、補(bǔ)體因子I(CFI)、C3、C5等的單核苷酸多態(tài)性也發(fā)現(xiàn)與ARMD的發(fā)病存在顯著相關(guān)性[33]。scRNA-seq發(fā)現(xiàn)CFH主要在脈絡(luò)膜中表達(dá)[20]，表達(dá)量為：脈絡(luò)膜內(nèi)皮細(xì)胞(動(dòng)脈>毛細(xì)血管>靜脈)>脈絡(luò)膜基質(zhì)細(xì)胞(成纖維細(xì)胞和周細(xì)胞)，且脈絡(luò)膜比視網(wǎng)膜表達(dá)更多的補(bǔ)體抑制劑及大量重要的補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子CD46、CD55、CD59、CD93，提示ARMD的補(bǔ)體系統(tǒng)異常主要發(fā)生在脈絡(luò)膜[20]。補(bǔ)體旁路途徑的異常激活使膜攻擊復(fù)合物(membrane attack complex,MAC)在脈絡(luò)膜毛細(xì)血管上大量沉積[34]，是導(dǎo)致脈絡(luò)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡和功能障礙進(jìn)而誘發(fā)ARMD的重要原因[35]。Mullins等[36]發(fā)現(xiàn)老年人尤其是ARMD供體眼的MAC表達(dá)量高于青年供體眼，且青年供眼脈絡(luò)膜不受MAC的影響。RGCC基因?yàn)橹匾难a(bǔ)體應(yīng)答基因，MAC一旦被激活，RGCC就會(huì)增加炎癥基因的表達(dá)[37]并驅(qū)動(dòng)血管功能障礙，scRNA-seq發(fā)現(xiàn)ARMD脈絡(luò)膜毛細(xì)血管中含有豐富的RGCC[20]，認(rèn)為其可能作為ARMD治療的靶標(biāo)基因。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、補(bǔ)體基因的異常表達(dá)、補(bǔ)體旁路的異常激活與ARMD的易感性密切相關(guān)，scRNA-seq加強(qiáng)了對(duì)ARMD發(fā)病機(jī)制與免疫反應(yīng)相關(guān)性的深入理解，對(duì)靶向免疫治療ARMD有重要意義。

4.3scRNA-seq在ARMD與氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)性研究中的應(yīng)用氧化應(yīng)激是ARMD的發(fā)病機(jī)制之一，視網(wǎng)膜內(nèi)的鐵代謝失調(diào)被認(rèn)為是導(dǎo)致自由基產(chǎn)生進(jìn)而誘發(fā)氧化應(yīng)激的原因，轉(zhuǎn)鐵蛋白在ARMD患者中的表達(dá)增加[38]，缺乏視網(wǎng)膜鐵結(jié)合蛋白的小鼠會(huì)出現(xiàn)RPE和脈絡(luò)膜損傷[39]。scRNA-seq發(fā)現(xiàn)[20]與外周視網(wǎng)膜相比，中心凹轉(zhuǎn)鐵蛋白表達(dá)量少，提示中心凹轉(zhuǎn)鐵蛋白的相對(duì)缺乏可能會(huì)增加該區(qū)域內(nèi)氧化損傷的易感性。人類和靈長(zhǎng)類動(dòng)物中心凹含有大量的葉黃素類胡蘿卜素，它能保護(hù)視網(wǎng)膜免受氧化損傷，scRNA-seq中[20]，類胡蘿卜素裂解酶BCO2在外周視錐感光細(xì)胞中富集，而在中心凹較少[15]，提示類胡蘿卜素在中心凹積累的機(jī)制。因此，使用抗氧化應(yīng)激類藥物可能對(duì)ARMD的治療有效。

4.4scRNA-seq在濕性ARMD基因表達(dá)研究中的應(yīng)用濕性ARMD又稱滲出性或新生血管性ARMD，較干性ARMD少見(jiàn)，但能迅速導(dǎo)致視力下降、視物變形或中心暗點(diǎn)?；趕cRNA-seq對(duì)濕性ARMD的研究中，脈絡(luò)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞富集基因Egr1[20]能在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中迅速激活，被視為內(nèi)皮細(xì)胞損傷反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，且能上調(diào)與血管功能有關(guān)基因如PDGF、FGF、TGFB、TNFA、ICAM1等的表達(dá)。ATF3基因在濕性ARMD供體的脈絡(luò)膜毛細(xì)血管中富集，并能被包括DNA損傷和氧化應(yīng)激的多種細(xì)胞應(yīng)激源激活。Menon等[40]從6個(gè)ARMD人類供體眼黃斑部和外周視網(wǎng)膜中獲得約23339個(gè)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TIMP3、VEGFA、COL4A3基因在ARMD患者的視網(wǎng)膜中高表達(dá)，TIMP3和VEGFA被證實(shí)與新生血管有關(guān)[41]。Rohlenova等[42]誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生脈絡(luò)膜新生血管，進(jìn)行了一項(xiàng)針對(duì)小鼠脈絡(luò)膜新生血管內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)變化的scRNA-seq研究，發(fā)現(xiàn)這些內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出與糖酵解、ATP合成和膜運(yùn)輸有關(guān)的幾個(gè)代謝基因的異常表達(dá)，說(shuō)明此狀態(tài)下的內(nèi)皮細(xì)胞代謝需求極高。來(lái)自這個(gè)小鼠脈絡(luò)膜新生血管細(xì)胞模型中的15個(gè)最豐富的基因，其中有11個(gè)在人類濕性ARMD供體中表現(xiàn)出一定程度的富集?；趕cRNA-seq發(fā)現(xiàn)與濕性ARMD相關(guān)基因的表達(dá)，為臨床針對(duì)靶基因治療濕性ARMD提供理論依據(jù)。

5新興單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的不斷探索

雖然scRNA-seq已成為剖析細(xì)胞異質(zhì)性的重要工具，但細(xì)胞異質(zhì)性體現(xiàn)在基因組、表觀基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、空間，甚至?xí)r間等多個(gè)維度上，scRNA-seq僅局限于一維層面的測(cè)序是不完整的，因此，許多新興的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生?？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)從一個(gè)完整的組織樣本中獲取全部的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，能夠定位和區(qū)分功能基因在特定組織區(qū)域內(nèi)的表達(dá)情況[43]。目前的scRNA-seq和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)只提供了基因表達(dá)的靜態(tài)信息，這違背了RNA動(dòng)力學(xué)和轉(zhuǎn)錄活動(dòng)的隨機(jī)性，基于時(shí)間序列的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析可以揭示細(xì)胞生物信息的時(shí)間動(dòng)態(tài)[44]。單細(xì)胞的異質(zhì)性本質(zhì)上是由基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、表觀基因組共同定義的，單細(xì)胞多組學(xué)能對(duì)同一細(xì)胞同時(shí)整合多種組學(xué)數(shù)據(jù)，更完善了細(xì)胞的遺傳信息[45]。然而，這些技術(shù)在眼科領(lǐng)域中的應(yīng)用仍相對(duì)局限單薄，隨著研究者持續(xù)不斷的探索，相信單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)多元化、多維化、多方面的研究在不久后將惠及眼科研究領(lǐng)域。

6總結(jié)與展望

scRNA-seq從單細(xì)胞水平分析細(xì)胞異質(zhì)性，是鑒別細(xì)胞與細(xì)胞間轉(zhuǎn)錄組差異的新興技術(shù)。本文總結(jié)了scRNA-seq在視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜發(fā)育及ARMD研究中的應(yīng)用，展示細(xì)胞發(fā)揮生理學(xué)作用與其所表達(dá)基因的相互關(guān)系，加深了對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞生物學(xué)和疾病病理生理學(xué)的理解。scRNA-seq將轉(zhuǎn)錄信息與ARMD發(fā)病機(jī)制相結(jié)合，為深入理解ARMD發(fā)病機(jī)制及靶向診治方案提供了全新的思路。隨著scRNA-seq測(cè)序成本的不斷降低，學(xué)者實(shí)現(xiàn)更多方面的生物學(xué)和技術(shù)重復(fù)，從而提高了不同生物學(xué)條件下檢測(cè)的多樣性和一致性，大量的研究將促進(jìn)新一代視網(wǎng)膜疾病診治的發(fā)展。但scRNA-seq局限于對(duì)細(xì)胞異質(zhì)性一維層面的理解仍存在較大缺陷，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)、時(shí)間分辨測(cè)序、多組學(xué)以多維、豐富的研究賦予細(xì)胞異質(zhì)性更完整多態(tài)的理解，隨著眾多突破性技術(shù)的出現(xiàn)，單細(xì)胞測(cè)序在眼科領(lǐng)域中的應(yīng)用將會(huì)朝著更多元化的方向發(fā)展。