血管內皮生長因子及上皮-間充質轉化在增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變發(fā)病中的作用

胡可可，杜紅俊，惠延年

0引言

增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitroretinopathy，PVR)是在孔源性視網(wǎng)膜脫離(rhegmatogenous retinal detachment，RRD)自然病程中、視網(wǎng)膜復位手術及嚴重眼球外傷后，由于玻璃體內和視網(wǎng)膜表面廣泛的纖維增生以及膜收縮，最終形成牽拉性視網(wǎng)膜脫離，而非新生血管化的致盲性眼病[1]。PVR嚴重影響患者視功能的恢復以及手術治療預后。

由于缺乏有效的治療藥物，玻璃體切除術目前仍是治療PVR的主要方法。雖然隨著玻璃體切除手術技術不斷進步，術后視網(wǎng)膜復位率大大提高，但手術仍然存在玻璃體切除不完全、增殖膜剝離不徹底、眼內填充物刺激、術后炎癥反應以及PVR復發(fā)等問題，最終造成手術失敗，因此仍有5%～10%的患者術后會再次發(fā)生PVR[2]。加深對PVR發(fā)病機制中重要途徑的闡明和對其病理學的理解，有助于尋找預防或治療PVR的藥物。

既往研究表明，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞的上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在其中發(fā)揮重要作用[3]，本文將就VEGF及EMT在PVR發(fā)病機制中的作用及二者的聯(lián)動關系進行概述，以期為研發(fā)PVR的治療藥物提供思路。

1 PVR發(fā)病機制

在發(fā)生RRD時，視網(wǎng)膜裂孔的出現(xiàn)使得RPE細胞播散至玻璃體腔，增生的細胞及其產(chǎn)生的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)組成增生膜附著于視網(wǎng)膜表面并產(chǎn)生牽拉，最終影響視網(wǎng)膜脫離的手術成功率或導致視網(wǎng)膜脫離復發(fā)。從病理機制方面，PVR包括了缺血期、炎癥期、細胞凋亡期、細胞遷移增殖期和瘢痕收縮期五個階段[4]。而從組織形態(tài)學方面，PVR的發(fā)病過程包括RPE細胞及膠質細胞的細胞遷移、遷移細胞的增殖、增殖膜形成、增殖膜收縮、細胞外膠原蛋白形成和視網(wǎng)膜上形成固定皺褶六個步驟[3]。以上變化導致了PVR患者的視功能改變及視網(wǎng)膜結構損害。

已經(jīng)證明，PVR是一個由諸多細胞及細胞因子共同作用的結果。涉及的細胞主要包括RPE細胞、視網(wǎng)膜膠質細胞和成纖維細胞等。細胞因子主要包括干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、白細胞介素-1(interleukin-1，IL-1)和白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)等炎癥因子及VEGF、血小板衍生因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、轉化生長因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)等生長因子[5]。這些因子通過介導細胞遷移、增殖、EMT和ECM的合成參與PVR的發(fā)生。其中，VEGF及RPE細胞的EMT被認為起著核心作用[6-7]。

2 VEGF在PVR發(fā)病中的作用及機制

2.1VEGF及其主要作用VEGF是一種血管內皮細胞高度特異性的有絲分裂因子，廣泛分布于人和動物的腦、腎、肝和眼等多種組織中。VEGF在眼內RPE細胞、血管內皮細胞、Müller細胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞等均可表達。VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E及胎盤生長因子(placental growth factor，PLGF)。傳統(tǒng)觀念認為，VEGF主要通過增加血管通透性和誘發(fā)新生血管形成而參與視網(wǎng)膜靜脈阻塞(retinal vein occlusion，RVO)、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)和年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)等新生血管相關疾病的發(fā)生和進展[8]。

2.2VEGF參與PVR的發(fā)生近年來的研究發(fā)現(xiàn)，除視網(wǎng)膜血管病外，VEGF還參與PVR的發(fā)生和發(fā)展，且與PVR嚴重程度呈正相關[5]。Ricker等[9]檢測了RRD患眼視網(wǎng)膜下液VEGF含量，發(fā)現(xiàn)伴PVR的患眼為不伴PVR的患眼的2～3倍。Ni等[7]檢測了24例PVR患眼的玻璃體，同樣證實了VEGF表達水平增高。

2.2.1VEGF通過促進RPE細胞增生和遷移而促進PVR VEGF通過與其特異性受體(VEGF receptor，VEGFR)發(fā)生特異性、高親和力結合后形成二聚體而發(fā)揮其直接作用。VEGFR主要包括兩個酪氨酸激酶受體，即flt-1和flk-1/KDR。RPE細胞被證實可同時表達這兩種受體，因此可在VEGF誘導下發(fā)生增生或遷移，從而導致PVR的發(fā)生或加快其進展[10]。

2.2.2VEGF通過PDGF信號通路促進PVR的發(fā)生除直接作用外，VEGF主要通過PDGF信號通路間接促進PVR的發(fā)生。VEGF與PDGF是密切相關的超家族信號傳導的成員，擁有8個半胱氨酸殘基的同源序列。PDGF家族包括PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C和PDGF-D四個成員，通過二硫鍵形成同源或異源二聚體。PDGF受體(PDGF receptor，PDGFR)具有高度特異性，包括PDGFR-α和PDGFR-β兩種亞型。PDGFR-α除了可以被PDGF直接激活，也可以被非PDGF因子(堿性成纖維細胞生長因子、肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子-1等)間接激活。

研究發(fā)現(xiàn)，PVR患眼內PDGF大量表達，且與PVR嚴重程度呈正相關[5, 11]。細胞表面的PDGFR-α被PDGF-C激活后發(fā)生二聚化，進一步激活磷脂酰肌醇3激酶(P13K)/絲氨酸-蘇氨酸蛋白(Akt)通路及其下游的信號通路，促進細胞增生和遷移。隨后PDGFR-α被快速內在化和降解，其激活的信號通路也隨即失去作用。非PDGF因子與PDGFR-α結合后，通過促進細胞內活性氧(ROS)生成和激活Src-家族酪氨酸激酶(SFK)，間接激活其下游通路[12-13]，進而活化下游的鼠雙微體基因2(murine double minute 2，Mdm2)蛋白，抑制p53基因的表達，從而促進PVR早期細胞的存活和增殖[14]。VEGF參與PVR的機制主要在于通過競爭性拮抗PDGF與PDGFR-α結合，阻止PDGFR-α的二聚化，延長PDGFR-α在細胞表面存留時間，從而增加非PDGF因子促進RPE細胞存活和增殖的作用[14]。

3 EMT在PVR發(fā)病中的作用及機制

EMT是指上皮細胞在一定條件下失去其上皮表型，轉化為具有間充質細胞表型的過程。EMT可介導胚胎發(fā)育、器官生成及傷口愈合等生理過程，同時也參與組織纖維化、癌癥轉移或PVR等病理生理過程[15]。

RPE細胞是PVR發(fā)生發(fā)展中最重要的細胞成分。在發(fā)生RRD時，RPE細胞與Bruch膜分離，并通過視網(wǎng)膜裂孔播散至玻璃體腔中。同時，由于血-視網(wǎng)膜屏障的破壞，玻璃體腔內細胞因子含量和活性增加。這些因素的共同作用促使RPE細胞啟動EMT[16-17]。

3.1EMT中RPE細胞特性的變化在生理條件下，RPE細胞是一種典型的“鵝卵石”樣上皮外觀形態(tài)，細胞內含有大量黑色素顆粒。細胞之間依靠緊密連接保持靜止狀態(tài)，維持特有的形態(tài)和功能。在EMT過程中，RPE細胞內閉合小帶蛋白-1(zonula occludens-1，ZO-1)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin，E-cad)表達減少，α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、波形蛋白及纖維連接蛋白等表達增加。由于α-SMA是細胞移行和收縮功能的基礎，其表達水平增加被認為是EMT的關鍵標志[18]。發(fā)生EMT的細胞骨架重組、細胞極性丟失、增殖和遷移能力增加，最終轉分化為具有收縮能力的成纖維細胞及肌成纖維細胞，并獲得高度侵襲移行能力、抗凋亡能力及分泌大量ECM的能力，從而導致PVR的發(fā)生和發(fā)展[3]。

3.2參與EMT的細胞因子及信號通路多種細胞因子及信號通路參與了PVR中的EMT的發(fā)生：細胞因子主要包括TGF-β、PDGF及CTGF等，信號通路主要包括Smad、Notch和Wnt/β-catenin等[19]。

3.2.1TGF-β促進EMT和PVR發(fā)生TGF-β是一種強效EMT趨化因子，在各種纖維化相關疾病中扮演著至關重要的角色，其作用貫穿了RPE細胞的增殖、分化、轉移、黏附以及纖維增殖膜的收縮。在TGF-β刺激下，RPE細胞還顯示了部分EMT改變，包括上皮細胞標志物下調、間充質細胞標記物上調和遷移能力增強。研究表明，在PVR患者和PVR動物模型中，TGF-β在玻璃體和視網(wǎng)膜前膜中表達水平均顯著上調，且與PVR的嚴重程度呈正相關，這些結果提示TGF-β在RPE細胞的EMT過程中起著重要作用[20]。

關于其機制，目前證實TGF-β主要通過激活Smad信號通路和非Smad信號通路來誘導EMT。TGF-β與跨膜的TGF-βⅡ型受體(TGFR2)結合，隨后與TGF-βⅠ型受體(TGFR1)結合，形成緊密連接復合體，誘導Smad2和Smad3磷酸化，并與共同調質Smad4結合形成三聚體，轉運到細胞核，通過與調控基因序列上的特定順式作用元件相互作用來調控TGF-β反應基因的轉錄[21]。

此外，多種非Smad信號通路也被證實參與了TGF-β誘導的EMT過程，包括p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、細胞外調節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases1/2，ERK1/2)MAPK、轉化生長因子β激活激酶-1(TGF-β activated kinase-1，TAK1)及Jagged/Notch等信號通路。p38 MAPK的激活可促進Ⅰ型膠原生成增加，ERK1/2 MAPK的激活可促進α-SMA、纖維連接蛋白、N-鈣黏蛋白和Ⅳ型膠原的表達，ERK1/2 MAPK信號通路還可以與TGF-β/Smad及Jagged/Notch信號通路產(chǎn)生交叉作用[22]。

3.2.2PDGF及PDGF信號通路與EMT 多項研究表明，PDGF-BB二聚體可通過與PDGFR-β結合后上調α-SMA和Ⅰ型膠原，下調RPE細胞中的ZO-1表達，激活ERK1/2 MAPK、P38 MAPK等信號通路來促進RPE細胞的增殖和遷移[23]。PDGF信號通路還可通過非PDGF因子介導的PDGFR-α激活途徑，促進RPE細胞的增生、活化、遷移，從而使存活的RPE細胞對TGF-β作出反應，轉分化為成纖維細胞或肌成纖維細胞。

3.2.3CTGF促進RPE細胞EMT CTGF是一種分泌蛋白，廣泛分布于人體的各組織器官，其主要作用是促進細胞增殖、遷移及分化，并已成為病理性纖維化的治療靶點[24]。在眼內，成纖維細胞樣細胞和血管內皮細胞是產(chǎn)生CTGF的主要來源。CTGF可調節(jié)多種生長因子和ECM蛋白的活性，參與ECM合成、重塑、傷口愈合及纖維化。玻璃體腔內注射CTGF可誘導兔PVR模型。CTGF作為TGF-β的下游效應介質，可通過增強TGF-β與TGFR2的結合，促進TGF-β誘導的纖維黏連蛋白EDA片段(fibronectin-EDA，EDA-FN)表達，后者進一步介導了RPE細胞EMT發(fā)生[25]。

4 VEGF與EMT的聯(lián)動關系

現(xiàn)已明確，在組織損傷中，EMT參與并導致了組織纖維化[15]。視網(wǎng)膜下纖維化為復雜的病理改變，是組織對于慢性損傷的病理應答，分為血管新生、肉芽組織形成及結締組織重塑三個階段[26]。VEGF主要通過兩個途徑參與纖維化過程：(1)VEGF和CTGF之間的平衡決定著纖維化的進程。在眼內的損傷修復過程中，VEGF和CTGF之間存在某種平衡。Inoki等[27]在體內和體外實驗中發(fā)現(xiàn)VEGF能上調CTGF的表達，二者通過形成VEGF-CTGF復合體使VEGF失活，并且當這兩種因子比率達到某一閾值時發(fā)生血管纖維化轉變，此時由過量CTGF驅動的纖維化可導致視網(wǎng)膜瘢痕形成[28]，目前引起血管新生向血管纖維化的開關尚不明確。(2)VEGF通過PDGF通路參與纖維化：VEGF可競爭性拮抗PDGF與PDGF受體α(PDGFRα)結合，或通過促進非PDGF因子介導的PDGFRα間接激活途徑促進EMT的發(fā)生，從而導致了視網(wǎng)膜下纖維化。針對VEGF與EMT聯(lián)動關系中關鍵分子和詳細機制的研究，可為PVR的治療提供了新的思路和方法。

5抗VEGF治療對PVR的防治作用

鑒于VEGF以上的作用，抗VEGF治療理論上可通過阻斷以上信號通路起到抑制EMT和PVR的發(fā)展。目前，已經(jīng)有很多的研究在動物和臨床進行了嘗試，也有了一些發(fā)現(xiàn)。

5.1抗VEGF治療對實驗性PVR的作用Pennock等[29-30]在兔眼玻璃體內注射0.1mL全氟丙烷氣體造成部分玻璃體后脫離，1wk后將成纖維細胞、富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)和細胞外基質蛋白聯(lián)合注入玻璃體制備復合PVR模型。利用此模型，研究者證實了玻璃體內注射雷珠單抗和阿柏西普均能有效抑制PVR的發(fā)生，且視網(wǎng)膜的形態(tài)及功能未受影響。Daftarian等[31]在白化兔眼玻璃體內注射0.3mL六氟化硫氣體造成玻璃體后脫離，3d后將人RPE細胞注入玻璃體制備PVR模型。進一步研究發(fā)現(xiàn)，CTGF在PVR早期表達水平明顯增高。玻璃體內注射抗CTGF藥物可降低VEGF-A表達，阻斷VEGF-A的功能。單獨抗CTGF藥物及聯(lián)合抗VEGF治療可顯著抑制視網(wǎng)膜下纖維化，表現(xiàn)為增殖膜厚度、膠原纖維面積及肌成纖維細胞密度降低。而單純抗VEGF治療僅在PVR早期通過與PDGFR的相互作用降低增殖膜厚度，對膠原纖維面積及肌成纖維細胞密度無明顯影響。

5.2抗VEGF治療在臨床上對PVR的防治效果不同于動物研究的結論，多個臨床研究顯示，與單純玻璃體腔硅油填充相比，硅油填充聯(lián)合貝伐單抗注射并不能提高PVR患者的視網(wǎng)膜復位率、改善術后視力及降低術后PVR發(fā)生率[32-33]。 Ghasemi等[32]還發(fā)現(xiàn)，玻璃體腔硅油填充聯(lián)合貝伐單抗注射術后視網(wǎng)膜再脫離患者中，55.5%患者的視網(wǎng)膜可見廣泛的纖維增殖膜，提示抗VEGF治療可能加重了PVR。

5.3動物實驗和臨床研究差異的原因關于動物實驗與臨床研究結果的差異，目前認為可歸于四個主要原因[5]：(1)PVR是一種由多種細胞、細胞外基質以及大量自分泌或旁分泌的細胞因子混合作用的復雜病理過程，單一藥物很難在多種致病環(huán)節(jié)中均發(fā)揮作用；(2)目前的動物模型均不能完全準確地反映臨床PVR發(fā)生發(fā)展的全過程；(3)動物實驗為早期PVR，病理改變以RPE細胞增生為主。臨床入組為PVR C級，此時的病理改變以EMT為主，因此抗VEGF藥物作用有限；(4)臨床上抗VEGF藥物抑制VEGF生物學活性的同時，會打破VEGF和CTGF之間的平衡，造成CTGF表達水平增高，從而引發(fā)纖維化，導致瘢痕形成和視力喪失。

對于臨床上PVR發(fā)生發(fā)展的高危眼，如年輕患者、巨大裂孔(大于90°的視網(wǎng)膜裂孔)、多發(fā)性撕裂孔、廣泛性視網(wǎng)膜脫離、伴有脈絡膜脫離的視網(wǎng)膜脫離等，PVR早期使用抗VEGF藥物，是否可有效抑制PVR的發(fā)生，尚有待進一步研究。

6小結及展望

手術設備和方式的創(chuàng)新顯著提高了PVR患者術后的解剖復位率，基礎研究和臨床試驗加深了我們對PVR發(fā)病機制的理解。然而，由于PVR發(fā)病機制復雜，目前也遠未闡明，因此其治療仍是一大難題。PVR的發(fā)生是多種細胞和多種因子聯(lián)合作用的結果，雖然新的研究證實了VEGF及EMT在PVR發(fā)生發(fā)展中起著一定作用，但有關VEGF和EMT在PVR不同階段的作用、二者的聯(lián)動關系、抗VEGF治療對EMT的潛在影響、治療時機以及對臨床PVR的防治效果等還需進一步研究和探索。同時，在臨床試驗尚未明確其療效的情況下，將抗VEGF用于臨床PVR的治療需要非常謹慎。