液體活檢技術及其在乳腺癌中應用的研究進展▲

韋 葦 易賢林 廖 海

[1 廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學影像中心/廣西臨床重點?？?醫(yī)學影像科)/優(yōu)勢培育學科(醫(yī)學影像學科)，南寧市 530021，電子郵箱：570944612@qq.com； 2 廣西醫(yī)科大學附屬武鳴醫(yī)院泌尿外科，南寧市 530199]

【提要】 早期診斷、早期治療是改善乳腺癌患者預后的關鍵。目前用于篩查和診斷乳腺癌的方法均存在一定的局限性，其中組織活檢只能在診斷穿刺或腫瘤切除時進行，不能反映整個腫瘤復雜的分子表達譜。而液體活檢可以在不同時間點多次進行，可以通過原發(fā)性和轉移性腫瘤部位采樣來確定腫瘤成分及腫瘤起源，模仿腫瘤個體的結構組合，可用于腫瘤遺傳分析，這有助于乳腺癌的早期診斷、預后評估、個體化治療。本文就液體活檢技術及其在乳腺癌中應用的研究進展進行綜述。

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤[1]。近年來，我國乳腺癌的發(fā)病率及檢出率逐年上升[2]，嚴重影響女性的生活質量和身心健康。早期診斷、早期治療是降低乳腺癌死亡率、提高患者生活質量的關鍵。乳腺X線鉬靶或超聲是目前篩查乳腺癌的常用手段，但這些檢查均存在一定假陰性和假陽性率[3]；乳腺癌組織病理檢查是診斷乳腺癌的金標準，但其只能在診斷穿刺或腫瘤切除時進行，不能反映整個腫瘤分子復雜的表達譜。因此，需要一種更有效的新方法來診斷乳腺癌。

隨著分子病理學、蛋白質組學及基因組學的深入研究，循環(huán)腫瘤標志物備受關注。循環(huán)腫瘤標志物包括循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)、循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)、循環(huán)腫瘤RNA(circulating tumor RNA，ctRNA)及腫瘤細胞來源的外泌體等，而目前臨床上采用液體活檢的方法從患者的血液、胸腹腔積液、尿液等標本中檢測這些標志物[3]，以達到診斷疾病的目的。上述循環(huán)腫瘤標志物在乳腺癌的早期診斷、進展與轉移、異質性與耐藥性以及預后療效評估等方面都發(fā)揮著重要的協(xié)助作用，因此乳腺癌的液體活檢已成為研究熱點之一。本文就液體活檢技術及其在乳腺癌中應用的研究進展進行綜述，旨在為乳腺癌的分子診斷及臨床療效監(jiān)測等提供新信息。

1 液體活檢技術及其檢測的主要循環(huán)腫瘤標志物

1.1 液體活檢技術概述 在原發(fā)性腫瘤形成和生長、凋亡及壞死過程中，其各種組分如CTC、ctDNA、ctRNA和外泌體等，可釋放到人體外周體液中[4]。液體活檢通過檢測人體體液的各種組分從而獲取相關疾病的分子信息數(shù)據(jù)，具有可連續(xù)取樣、自動化完成及結果可重復等諸多優(yōu)點[5]。目前，常用的液體活檢技術包括酶聯(lián)免疫吸附檢測、聚合酶鏈反應、生物傳感器技術、高通量測序等。酶聯(lián)免疫吸附檢測、聚合酶鏈反應可檢測蛋白、DNA/RNA的表達水平；生物傳感器技術具有超靈敏、免標記的特點；高通量測序多用于基因組、表觀基因組、轉錄組等檢測；高通量納米生物芯片集成系統(tǒng)可快速、同時和多重檢測單個細胞囊泡的蛋白質、mRNA/微小RNA(microRNA,miRNA)及其組合[6]。上述檢測技術均可通過檢測患者體液(如尿液、血液、腦脊液及胸腹水等)，觀察病癥(如惡性腫瘤等)相關特異性蛋白、DNA、RNA等生物標志物的表達變化，從而診斷或輔助診斷疾病及評價臨床治療效果。

1.2 液體活檢技術檢測的主要循環(huán)腫瘤標志物

1.2.1 CTC：CTC是從原發(fā)性或轉移性腫瘤中脫落的腫瘤細胞，通過淋巴系統(tǒng)或血管進入血液循環(huán)，這些細胞可以在腫瘤形成和生長期間、微轉移期間等任何時間釋放，甚至可以從腫瘤前病變中釋放[7]。在腫瘤轉移的早期階段，腫瘤細胞可發(fā)生侵襲、脫落從而進入外周血液循環(huán)，并與原發(fā)性腫瘤具有相似的遺傳或免疫學特征[8]。但由于機械因素或人體免疫系統(tǒng)的破壞，只有極少部分CTC能存活并進入血液循環(huán)系統(tǒng)，同時大多數(shù)CTC處于休眠狀態(tài)或增殖能力低下，對化療藥物耐藥，并可逃避機體的免疫監(jiān)視[7]。目前認為CTC逃避細胞凋亡和免疫監(jiān)視、抗脫落凋亡的能力可能與上皮-間充質轉化相關[8]，但CTC的具體生存機制尚不明確。有研究顯示，CTC特異性存在于腫瘤患者體內，1 g癌組織每天大約向外周血釋放1×106個CTC，即使切除原發(fā)性腫瘤，在腫瘤衍生的炎性趨化因子的誘導下，CTC可通過基質金屬蛋白酶1、肌成束蛋白1等載體從外周血滲透進入組織，返回原發(fā)性腫瘤的發(fā)生部位進行克隆性增殖，因此切除原發(fā)性腫瘤后外周血中仍能檢測到CTC[8]。CTC可應用于預測癌癥轉移的風險，研究顯示，CTC含量越高，轉移的可能性越大[9]；檢測CTC中的相關基因，可為靶向藥物的選擇提供指導[10]；CTC還可用于預測患者對治療的反應及預后評估等[11]。

1.2.2 ctDNA：外周血游離DNA和外泌體是兩個重要的液體活檢生物標志物[12]。1977年，Leon等[13]發(fā)現(xiàn)癌癥患者的循環(huán)游離DNA(circulating free DNA,cfDNA)含量顯著高于正常健康人，故猜測其與癌癥的發(fā)生相關 。因為cfDNA在血液中的濃度較高，其作為液體活檢標志物的效果優(yōu)于CTC[14]。在腫瘤患者中，ctDNA是總cfDNA的一個亞群。ctDNA僅占血漿總cfDNA的一小部分[15]。ctDNA可用于監(jiān)測正在發(fā)生的腫瘤學改變，其表達水平可反映腫瘤突變、表觀遺傳變化和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性等基因組學變化[16]。可通過靶向和非靶向測序技術分析從血液樣品中提取的ctDNA序列，其中靶向測序可用于分析已知的乳腺癌相關基因組，而非靶向全基因組測序可用于識別未知的新變異。

1.2.3 ctRNA：高代謝率是腫瘤細胞的一個關鍵特征，這需要特定基因的高表達從而導致大量mRNA的產(chǎn)生，而這些mRNA又可能從細胞中大量流失。原發(fā)性腫瘤細胞壞死后可將核酸釋放入血，在血液循環(huán)中凋亡或被人體免疫系統(tǒng)消滅的腫瘤細胞亦可將核酸釋放入血，其中包含了ctRNA。目前，針對ctRNA的研究熱點是循環(huán)非編碼RNA，循環(huán)非編碼RNA包括長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)、環(huán)狀RNA、小核RNA(small nuclear RNA,snRNA)和核仁小分子RNA(small nucleolar RNA，snoRNA)、miRNA以及與Piwi蛋白相互作用RNA(piRNA)[8]。

在人類基因組計劃中，只有約2%的人類基因組編碼蛋白質被發(fā)現(xiàn)，而98%的轉錄產(chǎn)物是非編碼RNA。lncRNA是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，其可通過基因沉默、染色質修飾、轉錄激活等機制，在多個不同層面調控基因表達，從而調控癌癥的發(fā)生和發(fā)展并影響癌癥預后。根據(jù)其功能所涉及的不同分子機制，lncRNA可分為信號原型、誘餌原型、引導原型、支架原型等類型。近年來的研究表明，lncRNA、miRNA和mRNA三者之間可相互作用，lncRNA通過內源性競爭性抑制miRNA的表達，促進下游靶基因的表達，從而發(fā)揮促腫瘤或抑腫瘤的作用[7]。

1.2.4 外泌體：外泌體是細胞之間溝通的載體，直徑在30～200 nm之間，是細胞分泌的包裹著DNA、RNA和蛋白質的囊泡，具有典型的脂質雙分子層膜結構，在細胞培養(yǎng)上清液及血清、唾液、尿液等體液中均可存在；腫瘤細胞分泌的外泌體具有抑制免疫系統(tǒng)、刺激細胞生長、促進腫瘤血管生成等功能，同時還參與了腫瘤細胞的轉移過程[8]。外泌體含有特定的標志蛋白及大量的脂質，后者包括膽固醇、磷脂酰絲氨酸和飽和脂肪酸等[17]，分析外泌體脂質表面分子抗原還可以確定腫瘤細胞的來源。除了蛋白質和脂質，外泌體還含有ctDNA、腫瘤mRNA和miRNA等成分，均在腫瘤生長、轉移及細胞間通訊中發(fā)揮著重要作用[18]。

2 液體活檢在乳腺癌中的臨床應用

臨床上，液體活檢可以分析原發(fā)性和轉移性乳腺癌患者相關標本中的生物標志物，可用于早期診斷或復發(fā)的檢測。此外，液體活檢可獲得整個腫瘤基因組信息，可用于鑒定新的遺傳標記，并用于患者個體化基因組分層和定制藥物[3]。

2.1 用于乳腺癌的早期診斷 早期診斷對于降低乳腺癌死亡率至關重要；早期乳腺癌通?？梢灾斡?，如果腫瘤<2 cm，早期診斷能明顯提高患者的總體生存率和預后[19]。此外，乳腺癌的早期診斷可影響治療方案的選擇，而這與患者預后息息相關。然而，由于乳腺癌無特異性癥狀，早期診斷困難較大。多項研究表明液體活檢在有助于在早期發(fā)現(xiàn)乳腺癌。其中，利用液體活檢檢測外周血ctDNA/cfDNA的水平，可比臨床和放射學手段提前5個月診斷乳腺癌[20]。此外，在腫瘤的早期階段，可通過檢測體細胞中ctDNA的突變情況及血漿中的cfDNA水平提高早期診斷的準確度[21]。還有研究顯示，對于具有乳腺癌易感基因突變的人群或乳腺癌的高風險人群，采用液體活檢方法可以在更早期進行診斷[22]。故為了早期乳腺癌檢測，需要開發(fā)高靈敏度檢測血漿cfDNA水平的方法。雖然乳腺癌患者cfDNA中確切的腫瘤突變譜尚不清楚，但是研究者們已經(jīng)開始通過篩選大量已知的乳腺癌始動基因、鑒定非腫瘤細胞的體細胞致癌突變以增加檢測敏感性。

CTC的檢測也有助于早期診斷乳腺癌。Kruspe等[23]開發(fā)了一種快速、靈敏的熒光核酸酶激活的探針來檢測乳腺癌CTC，該方法的原理是對CTC衍生的核酸酶進行信號擴增，這些酶在包括上皮細胞-間充質轉化誘導的乳腺癌在內的多種惡性腫瘤中升高；結果顯示，熒光核酸酶激活的探針可用于快速檢查CTC水平，可作為一種經(jīng)濟有效的乳腺癌早期診斷方法。但CTC應用于乳腺癌的診斷及預測尚處于早期研究階段，其作用仍有待進一步研究驗證。

2.2 用于乳腺癌的復發(fā)和預后評估 由于CTC會進入二級器官或被從血液中清除，其在外周血中的半衰期非常短(1～2.4 h)[10]。雖然在血液中分離低豐度CTC具有挑戰(zhàn)性，但它們已被證明是預測腫瘤預后的有力工具。Bidard等[11]檢測了乳腺癌患者血液中CTC的豐度，發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者平均每7.5 mL血液中有5個或更多的CTC，同時也發(fā)現(xiàn)CTC低水平(低于5個/7.5 mL)患者的疾病無進展生存時間和總生存時間較CTC高水平患者更長。Madic等[24]探討了三陰性乳腺癌患者的預后與血漿CTC水平的關系，也發(fā)現(xiàn)CTC計數(shù)與患者預后呈負相關，即CTC計數(shù)高的患者其總生存期及疾病進展時間更短。因此，CTC可作為潛在的液體活檢標志物，為監(jiān)測患者病情變化提供實時信息，有助于對乳腺癌患者預后進行評估。

ctDNA也可用于乳腺癌患者術后復發(fā)的評估[25]。基因組改變(包括多種ESR1基因組改變)有助于評估復發(fā)或轉移性乳腺癌，基于ctDNA的基因組分析是一種敏感的檢測手段[26]。研究表明，ctDNA水平與乳腺癌患者的總體存活率升高相關，并可定量評估早期的治療反應；對ctDNA基因組畸變的測定也可用于輔助預測乳腺癌復發(fā)[3]。Garcia-Murillas等[25]跟蹤檢測ctDNA以監(jiān)測早期乳腺癌患者根治性手術治療后的復發(fā)情況，發(fā)現(xiàn)多數(shù)(96%)未復發(fā)患者術后ctDNA為陰性，ctDNA預測復發(fā)的準確率為80%(12/15)。另外一項回顧性研究結果顯示，針對轉移性乳腺癌，術后ctDNA水平診斷復發(fā)情況的準確率達到93%～100%[27]。此外，ctDNA可在出現(xiàn)臨床癥狀前7.9～11.0個月預測乳腺癌患者的復發(fā)情況[25]。

2.3 用于腫瘤間/腫瘤內異質性的判斷 干性突變發(fā)生于腫瘤的早期階段并存在于所有的腫瘤細胞中；相反，在后期轉移性腫瘤階段發(fā)生的個體突變僅發(fā)現(xiàn)于部分腫瘤克隆中[28]?？v向監(jiān)測和比例分析干性突變有助于腫瘤克隆分層，以及區(qū)分原發(fā)腫瘤部位和轉移性腫瘤[28]。乳腺癌的組織活檢只能在診斷穿刺或腫瘤切除時進行，不能反映整個腫瘤復雜的分子表達譜。而液體活檢可以通過提供個體化的腫瘤圖譜來實現(xiàn)這些功能，即通過判斷腫瘤間的異質性，從而進行原發(fā)腫瘤定位。其中，組織特異性甲基化和核小體定位模式可以為原發(fā)性腫瘤的定位提供有價值的信息。Lehmann-Werman等[29]使用甲基化組數(shù)據(jù)庫鑒定組織的特異性cfDNA，其利用硫酸氫鹽來處理提取的cfDNA，對其含有特征CpG位點的區(qū)域進行PCR擴增，并對擴增的cfDNA進行了測序，以確定甲基化模式，然后與甲基化組數(shù)據(jù)庫進行比對，從而確定從血液中提取的cfDNA的起源組織。

此外，ctDNA突變檢測可用于判斷腫瘤內的異質性。De Mattos-Arruda等[30]納入了發(fā)生骨和肝臟轉移的浸潤性乳腺癌患者，在其接受蛋白激酶B抑制劑進行四線治療期間，多次收集血漿來源的ctDNA用于測定腫瘤相關基因，結果表明，基于ctDNA的大規(guī)模并行測序是靶向治療期間識別新發(fā)基因突變和監(jiān)測體細胞遺傳變異的潛在方法，這或有助于應對腫瘤內異質性所帶來的挑戰(zhàn)。

2.4 用于乳腺癌治療反應的評估 在治療過程中，腫瘤組織不斷獲得克隆和亞克隆的耐藥細胞，而液體活檢可在藥物治療期間縱向監(jiān)測腫瘤細胞的動態(tài)克隆進化[31]。有研究顯示，在治療過程中可出現(xiàn)雌激素受體1(estrogen receptor 1,ESR1)基因突變，這可導致轉移性乳腺癌細胞對內分泌治療產(chǎn)生耐藥性。例如，Beije等[32]納入43例初次接受一線內分泌治療的轉移性乳腺癌患者和40例一線內分泌治療后進展的轉移性乳腺癌患者，檢測了CTC和cfDNA中ESR1的突變情況，結果顯示，與前者相比，后者cfDNA中ESR1突變發(fā)生率升高，提示ESR1突變可導致轉移性乳腺癌患者對內分泌治療產(chǎn)生耐藥性。此外，O′Leary等[33]發(fā)現(xiàn)，在早期乳腺癌患者中，周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)4/6抑制劑治療前后ctDNA中磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞基α突變的變化情況可較好地預測患者對CDK4/6抑制劑的反應性。由此可見，液體活檢循環(huán)腫瘤標志物中相關基因的突變情況，有助于評估或預測乳腺癌患者的治療效果。

2.5 用于乳腺癌微小殘余病灶的評估 轉移性腫瘤發(fā)生的決定性因素是治愈性手術和化療后存在乳腺癌微小殘余病灶(minimal residual disease，MRD)。早期檢測MRD可以最大限度地提高患者的治療效果。從MRD釋放至血液的ctDNA中腫瘤相關基因發(fā)生了特異性突變，即ctDNA中存在不同于原發(fā)瘤灶的新轉移瘤基因圖譜表達[34]。而這些特異性突變可利用液體活檢來鑒定。研究表明，對于已進行腫瘤切除術的乳腺癌患者，檢測ctDNA和cfDNA有助于這些患者的術后監(jiān)測，即尋找MRD，指導臨床切除術后可能導致復發(fā)的任何殘余腫瘤的治療[35]。有學者使用微滴式數(shù)字聚合酶鏈式反應檢測早期乳腺癌患者手術前后的血漿ctDNA中PIK3CA基因的突變情況，結果顯示，14例術前cfDNA發(fā)現(xiàn)PIK3CA基因突變的患者中，有10例患者進行術后cfDNA檢測，其中5例在術后仍可檢測到PIK3CA突變[36]。這提示，在早期乳腺癌患者手術前后使用液體活檢技術檢測cfDNA有助于評估術后殘余腫瘤的情況，這助于臨床醫(yī)師制訂個性化治療方案進行及時干預，避免過度治療。

3 小 結

盡管目前液體活檢還只能作為乳腺癌的二線診斷手段，但隨著高靈敏度檢測技術的進步，液體活檢可為乳腺癌傳統(tǒng)組織活檢提供強有力的輔助作用。隨著新的研究不斷開展和標準化流程的建立，液體活檢的特異性和靈敏度不斷提高，液體活檢將為乳腺癌的篩查和治療提供更有力的支撐，在臨床上發(fā)揮更重要的作用。