基于代謝組學技術的肺癌早期診斷標志物研究進展

劉一潼，盧婧懿，于翰喆，董超，魏斌斌

（中國醫(yī)科大學藥學院，遼寧 沈陽 110021）

肺癌是當今世界上最常見的惡性腫瘤之一，新發(fā)病率和死亡率多年來都居于各類癌癥之首，其中85%的肺癌都是非小細胞癌（NSCLC）。肺癌的高隱匿性是造成其高死亡率的最主要原因，因此為肺癌的早期診斷和病理分期尋求高效可靠的檢測方法是十分必要的［1］。由于不同肺癌患者體內癌細胞的擴散程度和腫瘤的發(fā)展趨勢不同，可將肺癌進行分期，即0期、Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期或者Ⅳ期（晚期）。對于不同分期、不同種類的肺癌，分別有相應的治療方法和手段，如手術療法、化學療法、放射療法以及化學輻射的綜合療法等。近年來，除了上述傳統(tǒng)治療方法以外，又出現了一些治療效果顯著的新療法，如靶向治療、免疫治療。目前，在臨床治療上，根據疾病的復雜性多以聯合治療為主。但是由于惡性腫瘤的特殊性和醫(yī)療條件的受限，以往臨床上雖多采用手術與輔助化療方法，其治療效果往往難以令人滿意，很難控制肺癌患者的五年生存率。因此，針對肺癌的早期診斷和有效的新型治療方法的開發(fā)研究十分重要。

代謝組學是對某一生物或者細胞的所有小分子量代謝產物進行定性和定量分析的一種技術手段，其借助高通量技術如核磁共振波譜法（NMR）或質譜法等來鑒定代謝物和代謝循環(huán)。當機體處于病理生理狀態(tài)時，細胞中的代謝產物也會發(fā)生性質和數量上的變化，代謝組學因而可應用于疾病診斷。代謝組學可根據是否對代謝物具有針對性（或對整個代謝組的不偏向性）分為靶向代謝組學和非靶向代謝組學［1］。根據所研究內源性代謝物質的分布可將代謝組學分為：細胞代謝組學、呼吸代謝組學、尿液代謝組學、血液代謝組學和組織代謝組學等。

生物標志物是一種可衡量疾病發(fā)生或存在程度的指標，可用于疾病篩查、診斷、定性和監(jiān)測；用于開發(fā)個性化的治療干預措施；用于預測治療反應等。同時具有可以在各種生物材料中（如血液、器官組織、糞便、唾液和尿液）檢測的優(yōu)點。因此，生物標志物檢測類似于藥物的開發(fā)階段，可以為臨床應用提供理論基礎［2］。本文將從血液、呼吸、細胞、尿液、組織代謝組學五方面闡述代謝組學技術在肺癌早期診斷的生物標志物研究中的應用。

1 細胞代謝組學

有研究發(fā)現，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與生物體糖酵解代謝及三羧酸循環(huán)代謝等代謝過程異常高度相關［3］。細胞在氧氣充足的條件下，通過大量攝取葡萄糖生成乳酸，激活相關信號通路并改變腫瘤微環(huán)境。在糖酵解代謝過程中，有許多調控代謝的相關蛋白質在調控細胞凋亡的發(fā)生，如甘氨酸脫羧酶（GLDC）誘導糖酵解和甘氨酸/絲氨酸代謝的劇烈變化，導致嘧啶代謝的變化，以調節(jié)癌細胞的增殖。在臨床中，GLDC 異常激活與肺癌患者生存期較差相關，在多種癌癥類型中均可觀察到GLDC 的異常表達［4］。某些調控細胞凋亡的蛋白質也在代謝通路中發(fā)揮著信使作用，即糖酵解通路中甘氨酸的代謝和腫瘤發(fā)生之間的這種聯系可能為抗癌治療提供新的靶點。孫海超等［3］通過基于氣相色譜/質譜聯用（GC/MS）的代謝組學技術分析多西他賽（抗腫瘤藥物）處理和未處理的A549 和H1299 細胞，發(fā)現處理后8 種代謝物發(fā)生顯著變化，其中三羧酸循環(huán)關鍵調控酶即異檸檬酸脫氫酶顯著下調，表明多西他賽誘導NSCLC細胞凋亡可能與三羧酸循環(huán)代謝途徑抑制有關。Chen等［5］采用固相微萃取、熱解吸結合氣相色譜作為檢測系統(tǒng)，分別檢測不同類型的肺癌細胞、支氣管上皮細胞、味蕾細胞、成骨細胞、脂肪細胞等多種靶細胞培養(yǎng)基中揮發(fā)性有機化合物（VOCs）的含量，發(fā)現4 種特殊的VOCs，它們是肺癌細胞的代謝產物，可作為肺癌早期檢測的生物標志物。Wang等［6］對多組試驗對象的呼出氣進行VOCs分析，并對3種肺癌細胞和18例肺癌患者的組織進行體外培養(yǎng)，對培養(yǎng)物頂部空間VOCs進行分析，發(fā)現23種VOCs為肺癌的VOCs生物標志物，得到了可以通過呼吸診斷肺癌的直接證據，為肺癌的診斷提供了一種新穎、無創(chuàng)和快速的方法。

綜上所述，通過分析細胞代謝物分泌情況的差異表達進而尋找可能的肺癌生物標志物是具有科學依據且具有發(fā)展前景的便捷可行的新手段。細胞層面的相關檢測在與傳統(tǒng)以患者血液、尿液和組織為樣本的代謝組學研究相互佐證和補充后，為研究肺癌的發(fā)病機制、預防和治療提供新思路和新方法［7］。

2 呼吸代謝組學

反映肺癌發(fā)病機制的生物標志物的另一種可能來源是呼出氣體冷凝物（EBC）——一種生物液體和呼吸道的天然基質［8］。DNA、RNA、蛋白質、代謝物和VOCs 等分子存在于EBC 中，它們的存在與否或濃度的變化可作為早期診斷肺癌的代謝組學生物標志物。Peralbo-Molina等［9］將EBC用作臨床樣本，從2 個對照組（有和沒有危險因素）中開發(fā)肺癌鑒別的篩查工具，使用PanelomiX工具配置3 個代謝物組，以最小化假陰性（特異性）和假陽性（敏感性），5種代謝物的組合導致3個組的敏感性高于77.9%，特異性高于67.5%，曲線下面積（AUC）高于77.5%，還發(fā)現與肺癌患者相比，單硬脂酸在危險因素個體中的相對濃度較低。同時，從一個由積極吸煙者和前吸煙者組成的危險因素組和另一個對照組由健康的非吸煙者組成2個對照組的對照實驗中開發(fā)了一種可用于肺癌早期診斷篩查工具，利用GC-TOF/MS分析，建立了基于代謝組的預測模型，包括煙草、單?；视脱苌锖椭舅峒柞サ认嚓P化合物，以區(qū)分肺癌患者和對照組，強調了它們在早期檢測肺癌的潛在適用性。

3 尿液代謝組學

泌尿生物標志物不僅在泌尿生殖道的器官中，還在其他器官，例如乳房、卵巢和大腦中，都可顯示癌癥。作為機體的重要代謝物，尿液是一種重要的非侵入性收集的生物肽，是肺癌潛在生物標志物的來源。有研究指出，泌尿生物標志物會快速解決癌癥治療中現有的診斷和預后缺陷，研究已經確定了金屬元素、特定蛋白質、蛋白質特征、熒光峰比、非揮發(fā)性代謝物、外體蛋白和煙草代謝物在肺癌患者尿液中的差異［10-11］。有研究表明，新的生物標志物，包括蛋白質和代謝物，可以預測癌癥的風險和治療后復發(fā)［12-13］。尿液有很多獨特的優(yōu)點，跟血液不同，它的分子活性在取樣后變化不大，是相對干凈的介質，它含有很少的干擾蛋白，并且它適應非侵入性采樣。尿液通過侵入性較小的手段比血液數量大，允許反復取樣與測量。到目前為止，已有100多種揮發(fā)性泌尿生物標志物與癌癥有關，其中肺癌相關尿代謝物是肌酸核苷、N-乙酰氨基氨酸（NANA）、硫酸皮質醇和不確定代謝物561+，這些代謝物在肺癌診斷之前在受試者的尿液樣本中升高［14］。同時，相關新的檢測技術也應用廣泛，近年來，An等［15］將親和層析色譜結合LC-MS/MS用于肺癌尿液代謝組學研究，并取得很好的進展。

4 血液代謝組學

因為肺癌導致代謝的變化，患者體內血液中的某些物質（如氨基酸、核酸等）的含量與平衡往往與健康人群有所差異。血液中的代謝物作為所有細胞代謝過程的產物，對疾病條件和環(huán)境變化有著較高的敏感度與特異性，代表所有器官生理功能的終末產物，形成對個體當前生理狀態(tài)的詳細系統(tǒng)表征［16］。

Kumar 等［17］基于GC-TOF-MS 的血漿和血清樣本的非靶向代謝組學研究，從41例肺癌病例和41例對照受試者中收集血液樣本，以確定重要的代謝物以及發(fā)現肺癌的血漿和血清生物標志物，結果顯示，在血漿樣品中發(fā)現了27 種差異代謝物（BH調整后的P<0.05），并在肺癌的血清樣品中發(fā)現了13 種差異代謝物（BH 調整的P<0.05），同時獲得了3個重要途徑：（1）丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑；（2）?；撬岷痛闻；撬岽x途徑；（3）來自血漿樣品的丙酮酸代謝途徑。在通路分析和代謝組學相關性網絡分析的基礎上，得出4個代謝物?；撬?、阿斯珀酸、谷氨酰胺和丙酮酸為血漿生物標志物，3個代謝物天冬氨酸、牛磺酸和肌苷作為肺癌的血清生物標志物。在這些代謝物中，?；撬?、冬氨酸和丙酮酸在癌癥患者中上調，谷氨酰胺和肌苷下調。

Fahrmann等［18］收集血清和血漿用于ADC1與ADC2兩組獨立的病例對照研究（ADC1中有52例NSCLC腺癌病例和31例對照組，ADC2中有43例NSCLC 腺癌病例和43例對照組），采用GC-TOF/MS對2組病例進行代謝組學檢測研究，研究結果表明NSCLC腺癌患者中多種循環(huán)代謝物顯著升高或降低，體現了代謝組學在發(fā)現和驗證診斷NSCLC 腺癌的候選生物標志物方面的應用和有效性，在一定程度上確定了個體代謝物和多代謝物組對于肺癌早期篩查診斷的作用。

5 組織代謝組學

與血液標本相比，組織標本受外界因素影響較小，組織代謝物代表的是不同組織和器官的總體變化水平，通過比較代謝物在肺癌組織中與在癌旁組織中的含量變化，進而比較該代謝物的含量在組織中是否一致。

余江清等［19］通過冷凍保存的肺癌組織及正常組織，分析篩選出脂質、乳酸和甜菜堿為肺癌組織與正常肺組織間的差異代謝物。Jordan 等［20］對肺癌患者和健康人的肺組織進行分析，發(fā)現在肺癌組織中葡萄糖、肌醇和乙酸的濃度下降，而乳酸、磷酸膽堿和甘油磷酸膽堿的濃度升高。陳文學等［21］利用高分辨魔角旋轉核磁共振（HRMAS 1HNMR）技術，對肺癌患者不同部位的組織萃取液進行代謝組學分析，報道了12例肺癌組織中代謝物的變化差異，發(fā)現相比于鄰近非侵入肺組織，肺癌組織中乳酸含量顯著升高，而肌醇、谷氨酰胺和纈氨酸的含量顯著下降。Wu 等［22］利用丹磺酰衍生化和液相色譜/質譜（LC/MS）方法，用于分析腫瘤和正常肺組織中大量含胺或酚的代謝物的變化，可作為腫瘤標志物。

然而，組織作為臨床上診斷肺癌的金標準，由于獲取較困難，不利于作為肺癌早期篩查手段進行推廣，在后續(xù)的研究中應將其結果與其他樣本代謝組學結果結合使用，相互驗證，從而探索敏感性高、特異性強的肺癌早期診斷生物標志物。

綜上所述，代謝組學研究作為一門新興學科，能夠輔助疾病的早期診斷，從代謝水平發(fā)現疾病的標志物，繼而為臨床診斷提供參考。如今科學技術飛速發(fā)展，將代謝組學和其他組學（基因組學、轉錄組學、蛋白質組學等）相結合，從而建立完善且可靠的肺癌生物標志物數據庫，有利于提升對肺癌系統(tǒng)生物學的認識，從而能夠更完整地揭示肺癌生物調控網絡的復雜性。