慢性哮喘小鼠氣道重塑情況觀察及發(fā)生機(jī)制探討

盧衛(wèi)紅，吳湘濤，李多多，鄧翔，張星亮，徐亞利，李樹軍，馮沖

1 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科，河南新鄉(xiāng) 453100；2 廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科；3 深圳市兒童醫(yī)院兒研所；4 合肥學(xué)院生物食品與環(huán)境學(xué)院

哮喘是兒童常見的慢性呼吸道疾患，患病率約3%，近年發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢［1］。哮喘的長期反復(fù)發(fā)作容易導(dǎo)致氣道特異性高反應(yīng)性、氣道壁炎癥、氣道平滑肌增生和肥大等［2-5］。微小RNA（miRNA）是一類內(nèi)源性的非編碼RNA，在調(diào)節(jié)過敏性疾?。ū热缦┑陌l(fā)生發(fā)展過程中對氣道平滑肌的病理改變有重要作用［6］，但是其發(fā)揮作用的具體分子機(jī)制有待深入研究［7-10］。研究［11］顯示，自噬相關(guān)基因Atg5某些SNP位點(diǎn)與兒童哮喘相關(guān)。從自噬尋找哮喘治療靶點(diǎn)是一個新的研究領(lǐng)域，但自噬與氣道平滑肌和成纖維細(xì)胞的生理學(xué)等問題還需要進(jìn)一步研究［11-13］。我們前期報道了 miR-3162-3p 首個靶蛋白為β-catenin 蛋白，并在急性哮喘小鼠模型上證明內(nèi)源性 miR-3162-3p 降低肺組織 β-catenin 蛋白［14］。有文獻(xiàn)［11］報道，Wnt/β-catenin 通路和自噬信號存在相關(guān)性。因此，我們猜測miR-3162-3p/β-catenin 有可能通過調(diào)控自噬信號影響哮喘氣道平滑肌肥大增厚。2020 年3—12 月，我們觀察了慢性哮喘小鼠氣道重塑情況，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物及主要試劑、儀器 6～8周齡SPF級雌性BALB/c小鼠25只，體質(zhì)量（20± 2）g，購買于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗動物中心，在通風(fēng)良好清潔的動物房中適應(yīng)飼養(yǎng)3 d，溫度23～26 ℃，相對濕度52%～57%，明暗各半交替循環(huán)，自由飲水進(jìn)食。鼠源βcatenin 單克隆抗體（ab32572，Abcam），鼠源β-actin多克隆抗體（4967S，CST），兔源LC3B-Ⅰ/Ⅱ單克隆抗體（12741，CST），HRP 標(biāo)記山羊抗鼠 IgG（H+L）（E03012002，Earthox），HRP 標(biāo) 記 山 羊 抗 兔 IgG（H+L）（A0208，碧云天），Goat Anti-rabbit IgG/ Alexa 488（4412S，CST），TGF-β1（240-B，CST），Tween 20（Amresco），雞卵清蛋白OVA（Grade V，Sigma），乙酰甲膽堿（Grade V，Sigma），DMEM 高糖培養(yǎng)基（Thermo Fisher Scientific），胎牛血清（16000-044）購于美國Gibco 公司。PageRuler Prest Protein Ladder（26616，F(xiàn)ermentas），miRNA mimics［百奧生物技術(shù)（南通）有限公司］，BeyoECL Plus（P0018M，碧云天），Lipo 3000（L3000075，Life Technologies），miRNA RT-PCR Kit（RR716）和 Mir-X ? miRNA First Strand Synthesis Ki（t638313）購于TAKARA，馬松三色染色試劑盒（G1340）購于北京索萊寶科技有限公司。引物合成及測序服務(wù)均有華大基因公司提供。BUXCO 無創(chuàng)動物肺功能儀購于美國Buxco 公司，KYWH1004 型霧化器購于佛山凱亞醫(yī)療科技有限公司，LightCycler? 480Ⅱ熒光定量PCR 系統(tǒng)購于美國羅氏公司，BioPhotometer 分光光度計儀購于德國 Eppendorf 公司，Biolmaging system 凝膠成像系統(tǒng)購于美國UVP 公司，TCS SPF5 Ⅱ徠卡激光共聚焦顯微鏡購于徠卡公司，蛋白垂直電泳儀購于Bio-Rad 儀器廠。

1.2 小鼠分組、哮喘模型制備及模型制備成功判定 取小鼠16 只，并隨機(jī)分為哮喘組和對照組（各8 只）。哮喘組于第0 和7 天腹腔注射致敏液（含25 μg 的 OVA，1 mg 佐劑明礬，溶于 0.2 mL 的 PBS，現(xiàn)配現(xiàn)用），第2 至12 周用激發(fā)液（125 mg 的 OVA溶于5 mL 的PBS，現(xiàn)配現(xiàn)用）霧化激發(fā)，每2 周2次，連續(xù)2 d，每次30 min。對照組采用PBS 替代致敏液和激化液。模型制備成功判定：①小鼠肺功能檢測：兩組小鼠均在末次激發(fā)后24 h 進(jìn)行肺功能檢測。將4 只清醒狀態(tài)小鼠分別放進(jìn)Buxco 無創(chuàng)肺功能儀中，測定基礎(chǔ)值，包括呼吸頻率（F）、潮氣量（TV）、每分鐘通氣量（MV）、吸氣時間（Ti）、呼氣時間（TE）、吸氣峰流速（PIF）、呼氣峰流速（PEF）、呼吸 間 歇（Pause）和 PenH 值（PenH=Pause×PEF／PIF）。PenH 主要反映了氣道阻力。小鼠霧化吸入不同濃度的乙酰甲膽堿溶液（0、3.12、6.25、12.50、25.00 mg/mL），每次霧化2 min，反應(yīng)、記錄時間為3 min，恢復(fù)時間為1 min。計算小鼠的PenH，方法參照文獻(xiàn)［14-15］。與對照組相比，哮喘組 PenH 顯著升高，提示氣道呈高反應(yīng)狀態(tài)。②小鼠肺泡灌洗液（BALF）中細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞分類計數(shù)：將哮喘組和對照組小鼠仰臥位固定在小動物手術(shù)臺上，剪開頸部和胸部中間皮膚和肌肉暴露氣管和胸廓。采用眼科手術(shù)剪將肺與膈肌及相關(guān)黏連完全剝離，結(jié)扎左肺支氣管根部（支氣管分叉處附近）和氣管遠(yuǎn)心端，剪取左肺用于小鼠肺支氣管厚度和膠原沉積檢測。用靜脈留置針插入右肺相通的氣管內(nèi)約0.2 cm 后拔針芯，同時向前推進(jìn)留置針軟管約0.3～0.4 cm 處固定。注射器抽取0.5 mL 生理鹽水緩慢注入右肺，待肺組織膨脹后數(shù)秒后回抽，灌洗3 次，每次回收率不低于80%。將收集好的BALF 在 4 ℃和800 g的條件下離心5 min 棄上清，用100 μL 生理鹽水充分重懸混勻細(xì)胞團(tuán)，取混勻的重懸液10 μL 滴入血球計數(shù)板，于低倍鏡下計數(shù)（四角大方格，每大方格又分16個小方格），細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)/mL=（4 個大格細(xì)胞總數(shù)/4）×104。將 50 μL 的BALF 細(xì)胞重懸液在玻片上涂片，立即熱風(fēng)干，約30 min 后進(jìn)行瑞氏—吉薩姆染色，計算細(xì)胞分類。方法參照文獻(xiàn)［14-15］。收集BALF 進(jìn)行白細(xì)胞總數(shù)和分類計數(shù)，與正常組相比，哮喘組總細(xì)胞數(shù)量增加了近6倍，嗜酸性粒細(xì)胞的百分含量顯著升高，但是淋巴細(xì)胞的百分含量明顯下降。氣道反應(yīng)性和BALF細(xì)胞計數(shù)的結(jié)果提示，OVA-慢性哮喘小鼠模型構(gòu)建成功。

1.3 小鼠肺支氣管厚度和膠原沉積的檢測 取“1.2”實(shí)驗剪取好的兩組（各6 只）小鼠左側(cè)肺葉中部，置于4%多聚甲醛溶液中固定。脫水透明和浸蠟包埋后進(jìn)行連續(xù)切片（厚度約3 μm）、烤片、染色、洗片、封片等操作，采用馬松三色染色試劑盒。在倒置光鏡下觀察肺組織病理學(xué)形態(tài)，隨機(jī)選擇5 個直徑100～200 μm 的支氣管橫截面，并通過圖像采集系統(tǒng)獲取圖像。使用圖像分析軟件Image-pro Plus 6.0測量基底膜周長（Pbm）、平滑肌面積（Wam）和基底膜下膠原面積（Wcol）。計算平滑肌層厚度（Wam/Pbm，μm2/μm）和基底膜下膠原沉積厚度（Wcol/Pbm，μm2/μm）。

1.4 小鼠肺組織miR-3162-3p、β-catenin、LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白檢測 ①miR-3162-3p：采用qRT-PCR法。取每組小鼠（各3只）右肺組織20～30 mg，液氮研磨，然后采用天根公司 miRcute miRNA Isolation kit（DP501）試劑盒提取小鼠肺組織的microRNA。采用TaKaRa公司的 SYBR? PrimeScript ? miRNA RT-PCR Kit（RR716）試劑盒進(jìn)行miR-3162-3p 的逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時熒光定量PCR。miR-3162-3p：5’-UCCCUACCCCUCCACUCCCCA-3’，5’-CTACCCCTCCACTCCCCAAAA-3’，RNU6B：5’-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3’，5’-TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3’。Light-Cycler 480Ⅱ擴(kuò)增儀進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR 和數(shù)據(jù)分析。采用2-ΔΔCt值相對定量法計算目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄水平。方法參照文獻(xiàn)［14］。②β-catenin、LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白：采用Western blot 法。取每組小鼠（各3 只）左肺中下葉組織100 mg，用預(yù)冷的PBS 洗滌肺組織后置于預(yù)冷的研缽內(nèi)（后續(xù)步驟均在冰上完成），加適量液氮，充分研磨后采用移液槍吸取肺組織勻漿至1 mL 的EP 管內(nèi)。對于小鼠氣道平滑肌細(xì)胞，各組收集一個6 孔板細(xì)胞，棄培養(yǎng)基后加入PBS 沖洗3次。加適量RIPA 蛋白裂解液及蛋白抑制劑，靜置20 min 充分裂解組織和細(xì)胞后于4 ℃環(huán)境下以13 000 g 條件離心10 min，保留上清液，采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測量上清液中總蛋白濃度。取30 μg總蛋白的上清液加入適量緩沖液煮沸5 min后上樣，采用10%SDS-PAGE 進(jìn)行分離，然后采用PVDF 膜濕 轉(zhuǎn) ，5% 脫 脂奶 粉室 溫封 閉 1 h，加入LC3B-Ⅱ/Ⅰ一抗（1∶1 000）或者 β-catenin 一抗（1∶3 000）于4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后采用相應(yīng)種屬HRP 標(biāo)記的二抗（1∶2 000）在室溫下反應(yīng) 2 h，ECL 化學(xué)發(fā)光法在暗室曝光。以β-actin（1∶3 000）作為內(nèi)參。實(shí)驗重復(fù)3 次。采用Image J 圖像分析軟件采集信號和灰度掃描。

1.5 小鼠氣道平滑肌細(xì)胞分組、miR-3162-3p mimic轉(zhuǎn)染及LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白檢測 斷頸法處死小鼠（每組5 只），在75%酒精中浸泡2 min，快速分離氣管，放入D-Hanks 液（含100 U/mL 青鏈霉素）中，在超凈臺內(nèi)去凈氣管外周組織后縱切氣管，小心去除內(nèi)外膜，使用眼科剪將氣管剪成約1 mm3小組織塊，貼在25 mL 培養(yǎng)瓶底，加入 2 mL 高糖 DMEM 培養(yǎng)基（含20%胎牛血清），不使培養(yǎng)液接觸組織塊。倒置培養(yǎng)瓶，37 ℃和5%CO2培養(yǎng)箱中靜置約3 h。組織塊將近干涸時緩慢再次倒置培養(yǎng)瓶，使得培養(yǎng)液剛好覆蓋組織塊表面，靜置培養(yǎng)3 d 后添加培養(yǎng)液至5 mL，在第6天換液，此后每3天換1次液。在光學(xué)顯微鏡下觀察組織塊邊緣細(xì)胞逐漸匯合達(dá)80%即可進(jìn)行首次傳代。棄培養(yǎng)基后2 mL 的D-Hanks 液清洗3次，加入0.25%胰酶消化，顯微鏡下細(xì)胞邊緣透亮且胞質(zhì)回縮后加入15%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，吹打成單細(xì)胞懸液鋪板接種。采用差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞。含有10%胎牛血清、終濃度100 U/mL 的青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2，飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d 換液，細(xì)胞長勢良好時每3 d 傳代1次，以上細(xì)胞原代培養(yǎng)參照文獻(xiàn)［16］。當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期，分成兩組，對照組加入PBS，Mimic 組轉(zhuǎn)染 miR-3162-3p mimic（5'-UCCCUACCCCUCCACUC CCCA-3'，5'-UGGGGAGUGGAGGGGUAGGGA-3'），各組在6 孔板中鋪入細(xì)胞。24 h 后，再添加TGF-β1（2 ng/mL）孵育24 h。小鼠氣道平滑肌細(xì)胞LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)和分布檢測：采用免疫熒光實(shí)驗檢測。將小鼠氣道平滑肌細(xì)胞以5×104的密度鋪于底部有玻片的6 孔細(xì)胞板，干擾處理24 h 后，采用PBS沖洗細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，1%Triton 通透細(xì)胞膜，LC3B-Ⅱ/Ⅰ一抗孵育12 h，孵育Alexa 488 標(biāo)記的兔IgG 抗體。采用DAPI 重新固定細(xì)胞核，并通過共聚焦成像。參照文獻(xiàn)［17］方法。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用雙樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠肺支氣管厚度變化及支氣管平滑肌厚度、基底膜下膠原沉積厚度比較 兩組小鼠支氣管厚度變化見圖1，由圖1可知，對照組馬松三色染色結(jié)果顯示肺泡間隔勻稱、支氣管結(jié)構(gòu)清晰正常；哮喘組肺組織結(jié)構(gòu)不均勻，偶見支氣管上皮細(xì)胞疏散，哮喘組的支氣管平滑肌肌層肥厚，上皮下纖維化明顯增多，基底膜增厚，支氣管周圍藍(lán)色膠原沉積加重。哮喘組、對照組支氣管平滑肌厚度分別為（11.120 0±0.342 7）、（4.110 0 ± 0.202 9）μm2/μm，基底膜下膠原沉積厚度分別為（39.130 0 ± 1.072 0）、（14.100 0 ±0.444 7）μm2/μm，兩組比較，P均＜0.05。

圖1 兩組小鼠支氣管厚度、基底膜下膠原沉積厚度變化（馬松三色染色，×200）

2.2 兩組小鼠肺組織miR-3162-3p、β-catenin 蛋白、LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)比較 小鼠肺組織miR-3162-3p、β-catenin 蛋白、LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)比較見表1。

表1 兩組小鼠肺組織miR-3162-3p、β-catenin蛋白、LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)比較（）

表1 兩組小鼠肺組織miR-3162-3p、β-catenin蛋白、LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

組別哮喘組對照組LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白1.200 00±0.056 82*1±0 miR-3162-3p 2.362 0±0.116 2*1±0 β-catenin蛋白0.428 90±0.077 12*1±0

2.3 兩組小鼠氣道平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-3162-3p mimic 后LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)比較 在TGF-β1誘導(dǎo)支氣管平滑肌肥大增厚模型上，轉(zhuǎn)染miR-3162-3p mimic后，免疫熒光技術(shù)檢測結(jié)果顯示LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白在細(xì)胞質(zhì)中熒光強(qiáng)度較對照組明顯增強(qiáng)，提示自噬水平大幅上調(diào)（圖2A）。WB 檢測結(jié)果顯示，Mimic 組LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白比例明顯增多，灰度值分析顯示Mimic組和對照組LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白比值分別為1.969 0 ± 0.174 1、1 ± 0，P＜0.05，進(jìn)一步證實(shí)自噬水平上升（圖2B）。

圖2 兩組LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)分布和水平

3 討論

慢性哮喘是呼吸科常見的一種氣管慢性炎癥反復(fù)發(fā)作的疾病，以氣道炎癥、咳嗽、喘息、呼吸急促、胸悶等典型特征和氣流受限作為診斷的主要依據(jù)［18］。目前認(rèn)為，慢性哮喘可以引起氣道重構(gòu)，是導(dǎo)致氣道不完全可逆狹窄的重要原因。氣道重構(gòu)的主要表現(xiàn)包括氣道平滑肌細(xì)胞增生和肥大、氣道上皮基底膜增厚和基底膜下膠原沉積、氣道上皮細(xì)胞增殖以及杯狀細(xì)胞化生［19］。哮喘治療方案中重要的手段之一是吸入糖皮質(zhì)激素，但糖皮質(zhì)激素的使用會對兒童的發(fā)育和成長產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響，如激素依賴和抵抗或是股骨頭壞死或生長抑制等不良反應(yīng)［20］。布地奈德福莫特羅粉吸入劑為吸入性糖皮質(zhì)激素/長效β2受體激動劑，作為中至重度持續(xù)發(fā)作哮喘患者的長期治療藥而被使用，可獲得優(yōu)于加倍劑量糖皮質(zhì)激素的功效，但仍存在不少不良反應(yīng)。因此，探索哮喘新治療方案一直是呼吸系統(tǒng)疾病研究領(lǐng)域關(guān)注的重點(diǎn)［10］。miRNA 在特定的組織和發(fā)育階段、疾病發(fā)生的某個過程發(fā)揮調(diào)控功能。已有研究［21］證實(shí)，與疾病相關(guān)的多種miRNA 具有被開發(fā)成診斷試劑盒或治療性藥物的潛力。在急性哮喘小鼠模型上我們已經(jīng)證實(shí)，miR-3162-3p可以靶向下調(diào)β-catenin蛋白，miR-3162-3p 抑制劑保護(hù)肺組織β-catenin 蛋白，降低肺組織的炎癥水平［14］。本研究旨在慢性哮喘小鼠模型上研究miR-3162-3p 及靶蛋白的變化以及初步探討其影響氣道重塑的分子機(jī)制。目前已有研究表明，miRNAs 參與哮喘的發(fā)生及發(fā)展。文獻(xiàn)［22］報道，miR-20b 誘導(dǎo)慢性哮喘小鼠肺髓源性抑制細(xì)胞增多。miRNA-142 通過抑制TGF-β 依賴性EGFR 信號通路，抑制哮喘大鼠氣道重塑過程中氣道平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡［23］。研究［6］顯示，miR-485通過靶向Smurf2 調(diào)節(jié)慢性哮喘小鼠TGF-β/Smads信號通路，肺組織中3 種miRNA 增高或者降低。采用OVA 霧化激發(fā)6 周建立慢性哮喘小鼠，發(fā)現(xiàn)氣道壁miRNA 表達(dá)水平先上升后逐漸下降［4］。本文構(gòu)建12 周的慢性哮喘小鼠模型，發(fā)現(xiàn)其氣道反應(yīng)性明顯比對照組小鼠高，表明慢性哮喘小鼠的肺功能下降；BALF 細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示慢性哮喘小鼠氣道炎癥浸潤明顯增多；馬松三色染色的結(jié)果顯示慢性哮喘小鼠氣道平滑肌增厚、膠原沉積顯著增多，證明氣道明顯變狹窄；與對照組比較，慢性哮喘小鼠肺組織中miR-3162-3p 表達(dá)水平上升，提示miR-3162-3p 在慢性哮喘小鼠氣道重塑中可能發(fā)揮重要作用。

有研究［24］顯示，β-catenin 蛋白在調(diào)節(jié)慢阻肺氣道重塑中有重要作用，比如miR-337。β-catenin 蛋白還可以影響人氣道成纖維細(xì)胞［25］、人氣道上皮細(xì)胞［26］或氣道平滑肌細(xì)胞［27］進(jìn)而影響氣道重塑。本文觀察到慢性哮喘小鼠肺組織miR-3162-3p 的靶蛋白β-catenin 明顯下調(diào)。Wnt/β-catenin 通路和自噬相互關(guān)聯(lián)，自噬基因Atg5 表達(dá)減弱導(dǎo)致β-catenin 蛋白表達(dá)增加；β-catenin蛋白表達(dá)增加，自噬減弱［11］。自噬激活Src，促進(jìn)Src 相關(guān)的β-catenin 蛋白在Y-654磷酸化，形成 pY654-β-catenin/p-Smad2 復(fù)合物，促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)小鼠腎小管上皮C1.1 細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［28］。在小鼠的 PanIN 細(xì)胞中，經(jīng)典 Wnt3a 配體能誘導(dǎo)自噬標(biāo)志物［29］。β-catenin 蛋白和自噬之間存在調(diào)控或者被調(diào)控的關(guān)系，但是沒有明確一致的關(guān)系，可能與細(xì)胞或者組織的特異性有關(guān)［30］。TGF-β1是哮喘患者氣道重塑的關(guān)鍵細(xì)胞因子，可以引起細(xì)胞外基質(zhì)增加以及氣道平滑肌細(xì)胞的肥大［31］。本文采用TGF-β1誘導(dǎo)氣道平滑肌細(xì)胞肥大，證實(shí)miR-3162-3p mimic 能促使肥大型氣道平滑肌細(xì)胞自噬水平上升。因此可以推測，在氣道平滑肌細(xì)胞上，miR-3162-3p 靶向β-catenin 蛋白促進(jìn)了細(xì)胞自噬水平上調(diào)，這可能影響慢性哮喘小鼠氣道重塑的發(fā)病機(jī)制。

總之，miR-3162-3p 可能是通過下調(diào)β-catenin蛋白的表達(dá)，促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞自噬水平上調(diào)，減輕OVA 誘導(dǎo)的慢性哮喘導(dǎo)致的氣道平滑肌增厚和基底膜下的膠原沉積，緩解了氣道狹窄。