不同病情及病程CAP新生兒外周血維生素D、淋巴細(xì)胞亞群、中性粒細(xì)胞吞噬功能比較及相關(guān)性分析

沈懷云，王磊，夏群，刁艷霞，周夢竹

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科，安徽蚌埠 233004

新生兒社區(qū)獲得性肺炎（CAP）是一種常見的新生兒出生后感染性肺炎，病原體主要包括細(xì)菌、病毒及其他病原體，如金黃色葡萄球菌、呼吸道合胞病毒等，一些革蘭氏陰性桿菌或與病毒混合感染后所致足月新生兒CAP 病死率大大增加［1-3］。一些病原體如細(xì)菌在肺部的感染會(huì)激活患兒免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生了一系列免疫應(yīng)答，從而使宿主細(xì)胞表面抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，最終導(dǎo)致患兒免疫系統(tǒng)功能紊亂，病情進(jìn)展迅速者甚至死亡［4-6］。維生素D（VD）是一種脂溶性維生素，具有維持體內(nèi)鈣穩(wěn)定和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等作用，尤其與小兒呼吸道感染密切相關(guān)。CAP 目前已經(jīng)成為了新生兒階段最為嚴(yán)重的感染性疾病之一，且其臨床癥狀和體征缺乏特異性，監(jiān)測不同病情和病程CAP 新生兒免疫功能及其影響因素如VD 含量，是保護(hù)此類新生兒個(gè)體安全的關(guān)鍵點(diǎn)。2019 年11 月—2021 年11 月，我們比較了不同病情及病程CAP 新生兒外周血VD、淋巴細(xì)胞亞群、中性粒細(xì)胞（NE）吞噬功能，并分析VD 含量和免疫功能的相關(guān)性，旨在為新生兒CAP 病情輕重、病程進(jìn)展及療效評(píng)估提供參考價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治 的 CAP 新 生 兒 62 例 ，男 32 例 ，女 30 例 ；胎 齡（39.23 ± 1.02）周，日齡中位數(shù)17.5（14～25）d；體質(zhì)量（3.58 ± 0.51）kg。新生兒CAP 包括院外感染院外發(fā)病和院外感染入院后在潛伏期內(nèi)發(fā)病患兒。所有新生兒CAP 病例均符合《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》（第8 版）以及兒童CAP 管理指南診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］：①咳嗽，氣促，痰鳴，伴或不伴發(fā)熱、黃疸等癥狀；②表現(xiàn)為紫紺、口吐泡沫或者伴有呻吟、呼吸困難或吸氣性三凹征；③雙肺聞及呼吸音粗或者干濕啰音；④X 線胸片顯示為斑點(diǎn)狀條絮影或斑片狀、片狀陰影，伴或不伴肺氣腫。根據(jù)病情分為輕癥者40例（輕癥組）、重癥者22例（重癥組）（新生兒重癥CAP符合上述兒童CAP 管理指南重癥肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］：①在吸入氣中氧濃度分?jǐn)?shù)≥60%的情況下，不能維持動(dòng)脈血氧飽和度≥92%；②出現(xiàn)休克；③呼吸頻率增快，脈速伴嚴(yán)重呼吸窘迫和多器官功能衰竭，伴或者不伴動(dòng)脈血氧分壓升高；④反復(fù)出現(xiàn)呼吸暫?；蚵灰?guī)則的呼吸）。根據(jù)病程分為急性期（入院后24 h 內(nèi)，急性組）、恢復(fù)期（治療7 d病情好轉(zhuǎn)時(shí)，恢復(fù)組）。另選擇同期健康體檢新生兒30 例（對(duì)照組），男18 例，女12 例；胎齡（39.15 ± 1.38）周，日齡中位數(shù) 16（12.75～24.25）d；體質(zhì)量（3.51± 0.54）kg。兩組一般資料比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有可比性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①出生時(shí)有嚴(yán)重的先天性發(fā)育畸形和遺傳代謝性疾??；②吸入性肺炎等非感染性肺炎；③入組前使用過相關(guān)影響檢測指標(biāo)的藥物。本研究已報(bào)醫(yī)院的倫理委員會(huì)審核，并獲得批準(zhǔn)，所有新生兒家長都在告知書上簽名表示同意。

1.2 外周血VD、淋巴細(xì)胞亞群、NE 吞噬功能指標(biāo)檢測 取空腹?fàn)顟B(tài)下采集各組新生兒靜脈血各3 mL。①VD：采用WATERS 公司的高效液相色譜儀檢測25 羥維生素D［25（OH）D］含量。抽取靜脈血1 mL，離心取0.5 mL 血清以甲醇沉淀蛋白，以正己烷提取后，離心取上清液過膜。甲醇∶水（95∶5）為流動(dòng)相，選用 Venusil MP-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱進(jìn)行色譜分離，流速為1 mL/min，紫外檢測波長265 nm，柱溫30 ℃。②淋巴細(xì)胞亞群：使用真空采血管（EDTA-K2 抗凝）抽取靜脈血1 mL，將標(biāo)本管編號(hào)為A 與B，A 管內(nèi)加入CD3-FITC/CD16+CD56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC 試劑20 μL，B 管 內(nèi) 加 入 CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC試劑20 μL，向A管與B管內(nèi)各加入100 μL全血，輕輕搖勻，避光置室溫孵育共15 min，向兩管內(nèi)各加入FACSLysing 溶血液2 mL，避光置室溫孵育共10 min，300 g離心5 min，棄去上清液，以PBS洗滌細(xì)胞 2 次，300 g 離心 5 min，同樣棄去上清液，再向A、B 管內(nèi)各加入1%的聚甲醛0.5 mL，采用美國BD公司的FACSCalibur 流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，用Multi-SET 程序分析淋巴細(xì)胞各亞群的相對(duì)計(jì)數(shù)，最后讀取結(jié)果。③NE吞噬率及吞噬指數(shù)：將金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29213置于水浴中加熱至100 ℃，總共10 min，以殺滅細(xì)菌，再以無菌生理鹽水稀釋成6×108/mL備用；吸取60 μL肝素鈉抗凝血液滴入凹玻片的凹孔內(nèi)，加上述制備好的葡萄球菌菌液20 μL，進(jìn)行充分混勻；并置入鋪有濕紗布的有蓋容器中，于37 ℃溫箱中作用30 min，期間每10 min搖勻一次；作用完畢后，吸取1小滴混合液置于潔凈的載玻片一端，推成薄片、晾干，采用快速瑞—姬氏染色劑染色10 min，清水沖洗和晾干后在油鏡下隨機(jī)尋找100個(gè)NE，計(jì)算 NE 吞噬率及噬指數(shù)（吞噬率=100 個(gè)NE 中吞噬細(xì)菌的細(xì)胞數(shù)/100×100%，吞噬指數(shù)=100個(gè)NE中吞噬細(xì)菌的總數(shù)/100）［8］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，其中兩兩比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t法；采用Spearman 秩相關(guān)作兩變量相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 輕癥組及重癥組和對(duì)照組外周血VD 含量、淋巴細(xì)胞亞群、NE 吞噬功能指標(biāo)比較 結(jié)果見表1。

表1 輕癥組及重癥組和對(duì)照組外周血VD含量、淋巴細(xì)胞亞群、NE吞噬功能指標(biāo)比較（）

表1 輕癥組及重癥組和對(duì)照組外周血VD含量、淋巴細(xì)胞亞群、NE吞噬功能指標(biāo)比較（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與輕癥組比較，＃P＜0.05。

組別輕癥組重癥組對(duì)照組NE吞噬指數(shù)3.01±0.97*2.26±0.93*＃3.61±0.29 n 40 22 30 25（OH）D（ng/mL）15.98±2.91*13.96 ± 3.04*＃18.08±4.00 CD3+（%）80.54±7.42*73.70±6.76*＃84.47±5.09 CD4+（%）58.53±6.86*52.66 ± 5.64*＃63.17±4.03 CD8+（%）20.12±0.70 19.59±1.46 19.82±1.39 CD19+（%）12.21±3.69*15.86±4.86*＃9.51±3.42 CD56+（%）10.50±3.27*8.44 ± 2.90*＃12.84±2.32 NE吞噬率（%）55.41±14.27*43.10 ± 13.37*＃62.10± 7.04

2.2 急性組及恢復(fù)組和對(duì)照組外周血VD 含量、淋巴細(xì)胞亞群、NE吞噬功能指標(biāo)比較 結(jié)果見表2。

表2 急性組及恢復(fù)組和對(duì)照組外周血VD含量、淋巴細(xì)胞亞群、NE吞噬功能指標(biāo)比較（）

表2 急性組及恢復(fù)組和對(duì)照組外周血VD含量、淋巴細(xì)胞亞群、NE吞噬功能指標(biāo)比較（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與恢復(fù)組比較，＃P＜0.05。

組別急性組恢復(fù)組對(duì)照組NE吞噬指數(shù)2.75±1.01*＃3.09±0.78*3.61±0.29 n 62 62 30 25（OH）D（ng/mL）15.26 ± 3.09*＃16.57±3.33*18.08±4.00 CD3+（%）78.15 ± 7.83*＃81.29±6.03*84.47±5.09 CD4+（%）56.45 ± 7.00*＃59.42±5.57*63.17±4.03 CD8+（%）19.93±1.06 19.99±0.95 19.82±1.39 CD19+（%）13.50±4.47*＃11.69±3.37*9.51±3.42 CD56+（%）9.77 ± 3.27*＃11.10±2.47*12.84±2.32 NE吞噬率（%）51.04 ± 15.06*＃55.76±11.50*62.10± 7.04

2.3 急性期組VD含量與淋巴細(xì)胞亞群、NE吞噬率及吞噬指數(shù)相關(guān)性分析 急性組VD 含量與CD3+、CD4+、CD56+細(xì)胞及NE 吞噬率、吞噬指數(shù)呈正相關(guān)（r分別為 0.354、0.321、0.386、0.520、0.559，P均＜0.05），與 CD19+細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（r為-0.342，P＜0.05），與CD8+細(xì)胞無相關(guān)性（r為0.130，P＞0.05）。

3 討論

新生兒CAP 是由各種病原體感染引起的彌漫性肺部病變，如不及時(shí)治療常會(huì)造成患兒呼吸困難，甚至呼吸衰竭，嚴(yán)重者可導(dǎo)致患兒死亡或因缺氧留下神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。由于CAP 的流行病學(xué)正在發(fā)生變化，且導(dǎo)致CAP 的病原體在不同的國家和地區(qū)之間存在差異，大多數(shù)細(xì)菌性新生兒CAP 是經(jīng)驗(yàn)性治療，選擇適當(dāng)?shù)目股刂委熢絹碓嚼щy，同時(shí)新生兒免疫功能極不成熟，因此新生兒CAP 的治療對(duì)兒科醫(yī)師來說具有很大的挑戰(zhàn)性。

VD 是促進(jìn)機(jī)體骨骼生長和調(diào)節(jié)其免疫功能的重要微量營養(yǎng)素。VD 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通過激素形式的1，25-二羥維生素D與核VD受體結(jié)合發(fā)揮對(duì)機(jī)體先天性免疫和適應(yīng)性免疫的調(diào)控，還可通過調(diào)節(jié)T 細(xì)胞中的 mTOR 途徑實(shí)現(xiàn)免疫穩(wěn)態(tài)［9］。因此，VD 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)應(yīng)該能提高機(jī)體對(duì)抗細(xì)菌或病毒等病原體感染的免疫力。VD 缺乏會(huì)明顯增加人體感染病原體的幾率，且感染后病情易進(jìn)展和加重。臨床研究已證明，血清25（OH）D 缺乏的老年新冠肺炎患者肺受累更嚴(yán)重、病程更長和死亡風(fēng)險(xiǎn)更高，即使在并發(fā)癥較少的年輕新冠肺炎患者中，也檢測到VD 水平較低［10］。劉梁等［11］報(bào)道，感染性肺炎患兒的血清 25（OH）D 水平較低，且病情較重者的水平更低。近期還有研究認(rèn)為，低濃度的血清VD 與新生兒肺炎有顯著的相關(guān)性，且VD 水平可以預(yù)測新生兒肺炎的機(jī)械通氣需求和住院時(shí)間［12］。25（OH）D 缺乏的新生兒患感染性肺炎的風(fēng)險(xiǎn)增加，且重癥肺炎新生兒外周血單個(gè)核細(xì)胞VD 受體表達(dá)下調(diào)［13］。本研究結(jié)果中輕癥組及重癥組VD 含量顯著低于對(duì)照組，重癥觀察組VD 含量低于輕癥者，說明血清VD 含量與新生兒CAP 病情輕重有關(guān)，VD 水平越低，患兒病情可能越重；急性組及恢復(fù)組VD 含量均低于對(duì)照組，提示低VD 含量與新生兒CAP 發(fā)生關(guān)系密切，且在急性期降低后短期內(nèi)無法完全恢復(fù)正常。CAP新生兒血清VD 水平降低可能與肺部感染后患兒對(duì)VD的吸收減少、同時(shí)機(jī)體處于高代謝狀態(tài)，對(duì)VD 的需求和排出增加等一些因素有關(guān)。

機(jī)體的免疫細(xì)胞由固有免疫細(xì)胞與適應(yīng)性免疫細(xì)胞組成。固有免疫細(xì)胞主要包括NK 細(xì)胞、NE、樹突狀細(xì)胞等等，固有免疫細(xì)胞參與天然免疫反應(yīng)，發(fā)揮非特異性免疫功能，如NK細(xì)胞、NE不需要抗原的刺激，也能自發(fā)地殺傷靶細(xì)胞；適應(yīng)性免疫細(xì)胞包括T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞，它們除具有天然免疫細(xì)胞的免疫功能外，還可對(duì)一些病原體感染作出針對(duì)性反應(yīng)，從而產(chǎn)生后天獲得性免疫反應(yīng)，發(fā)揮特異性免疫功能。各個(gè)淋巴細(xì)胞亞群應(yīng)維持一定的數(shù)量和比例，并且相互作用才能維持機(jī)體正常的免疫功能。新生兒免疫系統(tǒng)功能薄弱，在罹患呼吸道感染性疾病后，免疫系統(tǒng)更易受到損害，淋巴細(xì)胞亞群往往會(huì)發(fā)生變化。MCGRATH-MORROW 等［14］將新生和幼年小鼠分別吸入大腸桿菌致下呼吸道感染后，發(fā)現(xiàn)新生小鼠肺部固有免疫細(xì)胞招募延遲，肺部細(xì)菌清除也明顯延遲，并且死亡率更高。另外文獻(xiàn)［15］報(bào)道，新生小鼠肺炎時(shí)對(duì)肺部CD4+T 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄反應(yīng)減弱。有研究［16-17］認(rèn)為，細(xì)菌性肺炎的新生兒CD3+、CD4+和CD8+T 淋巴細(xì)胞均降低，而CD19+B 淋巴細(xì)胞升高，病情越重，住院時(shí)間越長，NK細(xì)胞及其亞群的比例越低。吳秀霞等［18］發(fā)現(xiàn)，感染性肺炎新生兒CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞和NK 細(xì)胞比例較對(duì)照組顯著降低，CD8+T 細(xì)胞、CD19+B 細(xì)胞比例較對(duì)照組顯著升高，但CD19+B細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白的功能是低于對(duì)照組的。目前，針對(duì)感染性肺炎患兒NE 功能變化的研究較少。袁浩等［8］發(fā)現(xiàn)，肺炎支原體肺炎患兒外周血NE 吞噬率及吞噬指數(shù)較健康對(duì)照組下降，表明患兒肺部感染后，機(jī)體非特異性免疫NE 吞噬功能下降。本研究顯示，輕癥組及重癥組CD3+、CD4+、CD56+細(xì)胞水平及NE 吞噬率、吞噬指數(shù)顯著低于對(duì)照組，CD19+細(xì)胞水平高于對(duì)照組；重癥組CD3+、CD4+、CD56+細(xì)胞水平及 NE 吞噬率、吞噬指數(shù)低于輕癥組，CD19+細(xì)胞水平高于輕癥組；提示淋巴細(xì)胞亞群、NE吞噬率及吞噬指數(shù)與新生兒CAP的病情輕重有關(guān)，患兒病情越重，特異性和非特異性免疫功能紊亂越嚴(yán)重。本研究還顯示，急性組和恢復(fù)組CD3+、CD4+、CD56+細(xì)胞水平及 NE 吞噬率和吞噬指數(shù)均低于對(duì)照組，CD19+細(xì)胞水平高于對(duì)照組；急性組 CD3+、CD4+、CD56+細(xì)胞水平及 NE 吞噬率和吞噬指數(shù)低于恢復(fù)組，CD19+細(xì)胞水平高于恢復(fù)組；提示淋巴細(xì)胞亞群、NE吞噬率及吞噬指數(shù)與新生兒CAP的病程進(jìn)展有一定關(guān)聯(lián)。隨著CAP 患兒病情好轉(zhuǎn)，CD3+、CD4+、CD56+細(xì)胞水平及 NE 吞噬率和吞噬指數(shù)升高，CD19+細(xì)胞水平下降，但在恢復(fù)期這些特異性和非特異性免疫指標(biāo)并不能達(dá)到正常新生兒水平。

VD 水平對(duì)呼吸道感染患兒特異性免疫功能如細(xì)胞免疫的影響已有不少報(bào)道。賀媛媛等［19］發(fā)現(xiàn)，反復(fù)呼吸道感染患兒血清VD 水平與全血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+呈正相關(guān)，而與全血 CD8+水平呈負(fù)相關(guān)。還有學(xué)者報(bào)道，CAP 新生兒25（OH）D 缺乏組CD3+、CD4+細(xì)胞陽性率及CD4+/CD8+均低于25（OH）D 正常組，細(xì)胞免疫與25（OH）D 水平相關(guān)，25（OH）D 缺乏患兒細(xì)胞免疫功能相對(duì)低下［20］。因此，VD 水平與呼吸道感染小兒的細(xì)胞免疫功能具有相關(guān)性。但VD 水平與呼吸道感染患兒非特異性免疫如NE吞噬功能的關(guān)系尚無相關(guān)報(bào)道。本文結(jié)果顯示，CAP 新生兒急性期 VD 含量與 CD3+、CD4+、CD56+細(xì)胞及NE 吞噬率和吞噬指數(shù)存在正相關(guān)，而與CD19+細(xì)胞存在負(fù)相關(guān)，提示CAP 新生兒急性期VD 含量與淋巴細(xì)胞亞群、NE 吞噬功能之間存在一定的關(guān)聯(lián)，VD含量減少會(huì)導(dǎo)致患兒特異性和非特異性免疫功能受損，它們共同參與和反映了新生兒CAP 的病情進(jìn)展。

總之，CAP 新生兒外周血VD 含量減少，特異性和非特異性免疫功能紊亂，且與病情輕重和疾病進(jìn)程密切關(guān)聯(lián)，新生兒CAP 急性期VD 含量與淋巴細(xì)胞亞群、NE 吞噬功能之間具有一定的相關(guān)性。因此，在新生兒CAP 的治療過程中，通過調(diào)節(jié)VD 水平，從而改善免疫功能，是否有助于患兒病情的恢復(fù)，值得我們進(jìn)一步研究。