干擾FTO蛋白對人卵巢癌細胞系SKOV3增殖、遷移、侵襲的影響及其機制

黃錦源，楊靜，代蔭梅

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院北京婦幼保健院婦科，北京 100026

卵巢癌是婦科常見三大惡性腫瘤之一，在婦科惡性腫瘤中病死率最高，患者預(yù)后差［1］。卵巢癌患者早期臨床癥狀不明顯或無特異性，超過75%的病例在晚期才被確診［2］。盡管大多數(shù)患者受益于手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等，但卵巢癌的難以早期診斷、復(fù)發(fā)和耐藥等問題導(dǎo)致整體患者預(yù)后不佳。文獻［2］報道，卵巢癌的治療取決于癌細胞本身的內(nèi)在特征。因此，迫切需要研究卵巢癌進展相關(guān)基因改變和潛在分子機制。脂肪量和肥胖相關(guān)蛋白（FTO）是N6-甲基腺嘌呤（m6A）去甲基化酶，位于染色體 16q12.2 上［3］。FTO 在惡性腫瘤中具有差異性表達，影響腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲、腫瘤干細胞特性和耐藥等惡性生物學(xué)行為［4］。FTO 在卵巢癌中表達水平及其發(fā)生發(fā)展過程中的作用相關(guān)研究較少，且不同研究間存在較大差異，可能發(fā)揮促癌或抑癌作用。本實驗選取對數(shù)生長期人卵巢癌腺癌細胞系SKOV3，并分別轉(zhuǎn)染第一條靶向FTO 的小干擾RNA（siFTO-1）、第二條靶向FTO的小干擾RNA（siFTO-2），并以無靶向作用的小干擾RNA（si-NC）作對照，觀察干擾FTO 對SKOV3細胞增殖、遷移、侵襲的影響，并探討其可能機制，以期驗證FTO 發(fā)揮促癌或抑癌作用。

1 材料與方法

1.1 細胞系、主要試劑及儀器 SKOV3 細胞購自美國ATCC細胞庫。高糖DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM Ⅰ減血清培養(yǎng)基和胎牛血清均購自美國Gbico 公司，TRIzol Reagent 購 自 美 國 Ambion 公 司 ，ColorMixed Protein Marker、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和 2×SYBR Green qPCR Mix 試劑盒均購自武漢 ABclonal 公司，F(xiàn)TO 引物和GAPDH 內(nèi)參引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，Lipofectamine 2000 購自美國 invitrogen 公司，si-NC、siFTO-1、siFTO-2 由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，AKT 抗體、p-AKT 抗體、PI3K 抗體、p-PI3K 抗體和GAPDH 內(nèi)參抗體均購自美國CST公司，F(xiàn)TO 抗體購自英國 Abcam 公司，ECL 試劑盒購自美國Thermo Scientific 公司，CCK-8 試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Transwell 小室購自美國Corning 公司。Nano-300微型分光光度計購自杭州奧盛儀器有限公司，熒光定量PCR 儀購自美國BIO-RAD 公司，CO2恒溫培養(yǎng)箱和多功能酶標儀購自美國Thermo Scientific 公司，倒置相差顯微鏡購自日本Olympus IX51，Tanon 5200 系列全自動化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)為上海天能科技有限公司。

1.2 SKOV3細胞培養(yǎng)及siFTO-1、siFTO-2轉(zhuǎn)染和分組 SKOV3細胞系培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長狀況和培養(yǎng)液顏色變化進行細胞換液或胰酶消化傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期SKOV3 細胞，進行胰酶消化，后用培養(yǎng)基重懸，按2×105細胞/孔接種于六孔板培養(yǎng)，待細胞生長融合度達到70%時，分別取si-NC、siFTO-1、siFTO-2（各40 pmol）與Opti-MEM I 減血清培養(yǎng)基（125 μL）、Lipofectamine 2000（4 μL）充分混勻，37 ℃孵育20 min；分別將si-NC、siFTO-1、siFTO-2 轉(zhuǎn)染混勻液加入已接種 SKOV3 細胞的六孔板中，轉(zhuǎn)染4 h 后將培養(yǎng)液更換為高糖DMEM 新鮮培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染后細胞分別標記為si-NC組、siFTO-1 組、siFTO-2 組（其中 siFTO-1 組、siFTO-2組主要起到平行重復(fù)實驗和避免siRNA序列誤差的作用）。采用qRT-PCR 法和Western blotting 法分別檢測各組FTO mRNA、蛋白相對表達量以判定轉(zhuǎn)染效率。qRT-PCR 結(jié)果顯示，si-NC組、siFTO-1組、siFTO-2組FTO mRNA 相對表達量分別為1.00±0.00、0.25 ± 0.11、0.17 ± 0.05，siFTO-1 組、siFTO-2 組分別與 si-NC 組比較，P均＜0.05；Western blotting 法檢測結(jié)果顯示，si-NC 組、siFTO-1 組、siFTO-2 組 FTO 蛋白相對表達量分別為 1.02 ± 0.06、0.74 ± 0.13、0.64 ± 0.11，siFTO-1 組、siFTO-2 組分別與 si-NC 組比較，P均＜0.05；提示各組轉(zhuǎn)染成功。

1.3 SKOV3 細胞增殖率測算 采用CCK-8 法。轉(zhuǎn)染 24 h 后，胰酶消化收集“1.2”中 3 組 SKOV3 細胞，用高糖DMEM 培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為1×105/mL，按100 μL/孔接種于96 孔板，每組均設(shè)置5個復(fù)孔，置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后加入CCK-8 檢測試劑，10 μL/孔，在培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標儀測定各孔450 nm 吸光度值（OD 值），并計算細胞增殖率，細胞增殖率（%）=（實驗組OD 值-空白組OD 值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。

1.4 SKOV3 細胞遷移率測算 采用細胞劃痕實驗。待“1.2”中3 組SKOV3 細胞生長融合度達到70%后，用無菌200 μL 移液槍頭垂直輕劃六孔板，PBS 洗滌2～3 次，每孔加入含2%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基，分別于劃痕0、72 h 顯微鏡下觀察細胞遷移情況，并拍照。采用Image J 軟件測量各組細胞劃痕間隙的距離，計算各組細胞的相對遷移率，細胞相對遷移率=1-72 h 劃痕間隙距離/0 h 劃痕間隙距離×100%。

1.5 SKOV3 細胞穿膜細胞數(shù)觀察 采用Transwell實驗。將低濃度基質(zhì)膠（Matrigel）均勻鋪在Transwell 小室底部膜的上室面（50 μL/小室），放置培養(yǎng)箱中30 min 干燥后待用。轉(zhuǎn)染后24 h，胰蛋白酶消化收集“1.2”中3 組 SKOV3 細胞，用無血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為4×105/mL，將200 μL 無血清重懸細胞液加小室的上部，小室的下腔加入1 000 μL 含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育48 h，后以PBS 洗滌2 次，加入甲醇固定細胞30 min，用棉簽輕擦拭掉上室面細胞，下室面細胞使用5%結(jié)晶紫溶液進行染色2 h，PBS洗滌3次，在顯微鏡200倍視野下隨機拍攝5個視野計數(shù)穿膜細胞數(shù)，計算平均值。

1.6 SKOV3 細胞AKT、p-AKT/AKT、PI3K、p-PI3K/PI3K 蛋白相對表達量測算 采用Western blotting法。轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化收集“1.2”中3組SKOV3細胞，加入 500 μL 的 NP-40 裂解液提取總蛋白，吹打后冰上靜置30 min，4 ℃環(huán)境下，以12 000 r/min的速度離心5 min，取上清；按BCA 蛋白定量試劑盒說明書操作進行蛋白濃度的檢測和蛋白定量，往定量后的上清液中加入loading buffer（上清液體積∶loading buffer 體積=4∶1），混勻后100 ℃加熱10 min使蛋白變性；配制10%SDS-PAGE 凝膠，各取20 μg總蛋白進行電泳，電泳條件：120 V 過濃縮膠至蛋白marker 分離清晰后，改160 V 直到溴酚藍跑至膠底；隨后進行轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜，轉(zhuǎn)膜條件為250 mA、120 min；根據(jù)蛋白marker 和待檢測蛋白分子量進行剪膜，5%脫脂牛奶封閉30 min，PBST 涮洗1 次后孵育對應(yīng)一抗稀釋液4 ℃過夜（兔抗FTO 單克隆抗體1∶5 000，兔抗AKT 單克隆抗體1∶1 000，兔抗p-AKT單克隆抗體1∶1 000，兔抗PI3K 單克隆抗體1∶1 000，兔抗 p-PI3K 單克隆抗體 1∶1 000 和兔抗GAPDH 單克隆抗體 1∶5 000）；第 2 天 PBST 快洗 3次，慢洗3 次，每次15 min，常溫下孵育辣根過氧化物酶標記二抗（1∶5 000）1 h，PBST 快洗3 次，慢洗3次，每次15 min，采用ECL試劑盒顯色，經(jīng)曝光、顯影和定影后拍照；采用Image J 軟件分析各條帶的灰度值，計算各目的蛋白相對表達量并進行歸一化處理。各目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/對應(yīng)GAPDH灰度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graph Pad Prism 9.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，兩組間比較采用獨立t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞增殖率、相對遷移率、穿膜細胞數(shù)比較 細胞增殖率、相對遷移率、穿膜細胞數(shù)比較見表1。

表1 各組細胞增殖率、相對遷移率、穿膜細胞數(shù)比較（）

表1 各組細胞增殖率、相對遷移率、穿膜細胞數(shù)比較（）

注：與si-NC組比較，P＜0.05。

組別siFTO-1組siFTO-2組si-NC組細胞穿膜細胞數(shù)（個）110.80±27.40*134.60±25.15*31.20± 6.76細胞增殖率125.20%±8.24%*121.20%±5.42%*100.00%±0.00%細胞相對遷移率47.29%±11.05%*51.08%± 8.48%*29.15%± 1.92%

2.2 各組細胞 AKT、p-AKT/AKT、PI3K、p-PI3K/PI3K 蛋白相對表達量比較 細胞AKT、p-AKT/AKT、PI3K、p-PI3K/PI3K 蛋 白 相 對 表 達 量 比 較見表2。

表2 各組細胞AKT、p-AKT/AKT、PI3K、p-PI3K/PI3K蛋白相對表達量比較（）

表2 各組細胞AKT、p-AKT/AKT、PI3K、p-PI3K/PI3K蛋白相對表達量比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

組別siFTO-2組siFTO-1組si-NC組p-PI3K/PI3K 0.21±0.02*0.06±0.01*0.05±0.00 AKT 0.84±0.17 0.82±0.18 0.96±0.20 p-AKT/AKT 0.38±0.01*0.26±0.02*0.18±0.01 PI3K 1.04±0.08 1.08±0.08 1.00±0.08

3 討論

卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一，也是世界上重要的公共衛(wèi)生問題，嚴重影響患者的身心健康。根據(jù)全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2020 年全球卵巢癌新發(fā)約 31.4 萬例，卵巢癌死亡人數(shù)約 20.7 萬例［5］。根據(jù)2022 年最新發(fā)布的癌癥登記和隨訪監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，2016 年卵巢癌新發(fā)病例約5.72 萬，卵巢癌死亡病例約2.72萬［6］。由于卵巢癌發(fā)病隱匿不易早期發(fā)現(xiàn)，患者被確診時往往處于晚期，患者常失去手術(shù)機會，而放化療治療效果不佳，近期和遠期預(yù)后不良［2］。人卵巢癌腺癌細胞系 SKOV3 由 TREMPE 和OLD 在1973 年從一位64 歲白人女性卵巢腺癌患者的腹腔積液分離得到，其能夠很好代表卵巢癌的生物特性。靶向分子治療具有更高的靶向選擇性和較高的治療效果，積極探討卵巢癌致病過程的分子機制，以期為卵巢癌的治療提供新的理論依據(jù)和有前途的靶點。FTO 作為m6A 去甲基化酶，主要與m6A甲基轉(zhuǎn)移酶共同調(diào)節(jié)體內(nèi)m6A 水平，從而在人類生理和病理過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。近年多項研究顯示，F(xiàn)TO在惡性腫瘤發(fā)病過程主要發(fā)揮促癌作用，靶向 FTO 顯示出一定的治療效果［7-9］。但 FTO 也被報道在膀胱癌［10］、肝細胞癌［11］和卵巢癌［12］中發(fā)揮抑癌作用，但FTO 在卵巢癌中的表達和作用尚存在爭議。多篇文獻報道顯示FTO 在卵巢癌中的表達顯著下調(diào)［12-15］，但 ZHAO 等［16］發(fā)現(xiàn) FTO 在人卵巢腫瘤組織中表達顯著上調(diào)。此外，F(xiàn)TO 能通過促進卵巢癌細胞增殖、抑制細胞凋亡、激活自噬過程，從而促進卵巢癌細胞的生長，發(fā)揮促癌作用［16］。然而另一項研究顯示，過表達FTO 抑制體外卵巢癌細胞的集落形成、球體形成、卵巢癌干細胞的增殖和自我更新，以及體內(nèi)成瘤的生長，在卵巢癌中發(fā)揮抑癌作用［12］。而下調(diào)FTO 增強卵巢癌細胞對聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制劑的耐藥性［13］。過表達FTO 能降低磷酸二酯酶4B 和磷酸二酯酶1C mRNA 中的m6A 水平和穩(wěn)定性，上調(diào)環(huán)磷酸腺苷水平，增強環(huán)磷酸腺苷的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，最終抑制體內(nèi)外卵巢癌的進展［12］。而下調(diào)FTO 可顯著增加卷曲蛋白10 mRNA 上的m6A 水平和穩(wěn)定性，進而激活下游Wnt/β-catenin 信號通路，最終導(dǎo)致卵巢癌細胞對聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制劑的耐藥性［13］。

腫瘤的惡性生物學(xué)行為涉及多方面，比如增殖、凋亡、遷移、侵襲、耐藥和腫瘤干細胞特性。為增加本實驗的可信度，本實驗設(shè)計合成序列不同的特異性靶向 FTO 的siRNA（siFTO-1 和 siFTO-2）進行平行重復(fù)試驗。本文結(jié)果顯示，與si-NC 組比較，siFTO-1組和siFTO-2 組細胞增殖、遷移和侵襲能力均顯著上調(diào)，說明干擾卵巢癌SKOV3細胞中FTO 的表達后可顯著促進細胞增殖、遷移和侵襲能力，這提示FTO在卵巢癌中發(fā)揮抑癌作用。本文結(jié)果與HUANG等［12］和FUKUMOTO 等［13］研究結(jié)果一致，但與 ZHAO等［16］研究結(jié)果相反。FTO在卵巢癌中相矛盾的結(jié)果為后續(xù)的臨床應(yīng)用和靶向藥物開發(fā)帶來一定的挑戰(zhàn)。在腫瘤治療中，基于小分子化合物靶向FTO 的策略不完全適用于卵巢癌的治療。相反，通過調(diào)節(jié)FTO內(nèi)源性上下游效應(yīng)分子間接促進FTO的表達或直接上調(diào)FTO 也可能是抑制卵巢癌進展的治療方法之一。FTO 在卵巢癌中發(fā)揮促癌或抑癌作用是FTO的本身功能多樣性，腫瘤微環(huán)境影響、亦或者是FTO 受時間和空間特異性影響，未來還需進一步研究和探索。

PI3K/AKT 信號通路是細胞周期過程中經(jīng)典的細胞內(nèi)信號通路，其上下游多種分子參與調(diào)節(jié)信號通路的激活過程，與細胞生理功能各個方面密切相關(guān)。PI3K 蛋白家族是一大類信號脂質(zhì)激酶，能夠磷酸化質(zhì)膜上磷脂酰肌醇的3′-OH 基團；AKT 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是 PI3K 途徑的關(guān)鍵分子［17］。PI3K 活化磷酸化導(dǎo)致AKT 在細胞膜上的募集和活化，而活化的Akt 具有激活cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白、抑制p27、激活磷脂酰肌醇3-磷酸和和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白等多種生物學(xué)功能，從而在許多細胞過程中起關(guān)鍵作用，包括葡萄糖代謝、凋亡、細胞增殖、轉(zhuǎn)錄和細胞遷移［17-18］。PI3K/AKT 信號通路可被表皮生長因子、胰島素樣生長因子和鈣調(diào)素等多種生物分子所激活，但也能被第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因和糖原合酶激酶3β 等其他分子所拮抗［18］。此外，PI3K/AKT 信號通路的異常激活也證實與多種惡性腫瘤的進展有關(guān)，靶向PI3K/AKT 信號通路及其上下游分子可能是抗腫瘤的有效手段［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，與 si-NC 組比較，siFTO-1 組和 siFTO-2 組細胞中 PI3K、AKT 蛋白相對表達量無顯著變化，但p-AKT/AKT 和P-PI3K/PI3K 蛋白相對表達量顯著升高，提示干擾FTO 可顯著激活SKOV3 細胞中 PI3K/AKT 信號通路，表明 FTO 對卵巢癌細胞中PI3K/AKT 信號通路具有負性調(diào)控作用，本文結(jié)果不同于ZHAO 等［16］的研究報道，即FTO能促進卵巢癌細胞中AKT 的磷酸化過程。以上結(jié)論提示，上調(diào)FTO 表達間接抑制PI3K/AKT 信號通路將會為卵巢癌的治療提供新的治療策略和思路。

總之，干擾FTO 可顯著促進卵巢癌SKOV3 細胞的增殖、遷移和侵襲，其作用機制可能是通過上調(diào)PI3K 和 AKT 的磷酸化水平，進而激活 PI3K/AKT 信號通路。