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    阿昔莫司對脂多糖誘導(dǎo)膿毒癥大鼠心肌損傷及Nrf2/HO-1 信號通路的影響

    2023-01-03 09:18:14黃泓軻羅健瑋冉華
    中國循環(huán)雜志 2022年12期
    關(guān)鍵詞:脂質(zhì)膿毒癥氧化應(yīng)激

    黃泓軻,羅健瑋,冉華

    心臟是膿毒癥最主要的受累器官,有超過70%的膿毒癥動物發(fā)生心功能障礙,并導(dǎo)致死亡[1-2]。研究認(rèn)為,膿毒癥心肌損傷的發(fā)病機制涉及心肌細(xì)胞凋亡、自主神經(jīng)失調(diào)、能量代謝及心肌抑制因子等多種因素[3]。革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中的脂多糖可作膿毒癥的主要致病因素,引起全身炎癥反應(yīng),造成機體多組織、多器官繼發(fā)性損傷[4]。目前研究發(fā)現(xiàn),脂多糖刺激機體組織后,組織供能失衡引起脂質(zhì)代謝紊亂、脂質(zhì)毒性物質(zhì)釋放及積累,可激活氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)途徑,加劇心肌組織細(xì)胞損傷及凋亡[5]。研究發(fā)現(xiàn),阿昔莫司聯(lián)合瑞舒伐他汀可改善心肌酶譜[6]。研究證實,阿昔莫司發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡的重要通路核因子E2 相關(guān)因子2(Nrf2)/血紅素加氧酶-1(HO-1),參與心肌組織細(xì)胞損傷后修復(fù)過程[7]。但阿昔莫司能否改善膿毒癥心肌損傷及相關(guān)作用機制還未見明確報道?;诖耍狙芯繎?yīng)用脂多糖誘導(dǎo)建立了大鼠膿毒癥模型,初步探究阿昔莫司對膿毒癥大鼠心肌損傷的影響及Nrf2/HO-1 通路在此過程中扮演的角色,以期為阿昔莫司在膿毒癥領(lǐng)域的治療應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    50只SD大鼠,雌雄不限,清潔級,體重200~220 g,6~8 周齡,購自四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所。本實驗經(jīng)本院動物倫理委員會批準(zhǔn)[批準(zhǔn)號:IACUC-01(20200102)],嚴(yán)格遵循3R 原則。

    1.2 主要試劑及儀器

    阿昔莫司(規(guī)格100 mg)購自上海喬羽生物科技有限公司;脂多糖(來源于大腸桿菌 0111:B4)、Nrf2通路抑制劑全反式維甲酸(ATRA)(HPLC ≥98%)購自美國Sigma 公司;肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cTnⅠ)ELISA 試劑盒分別購自無錫云萃生物科技有限公司、上海研生實業(yè)有限公司與上海賽可銳生物科技有限公司;總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)、游離脂肪酸(FFA)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA 試劑盒均購自江西艾博因生物科技有限公司;丙二醛(MDA)、活性氧簇(ROS)ELISA 試劑盒分別購自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司和上海圻明生物科技有限公司;Nrf2、HO-1、核因子-κB(NF-κB)、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、超氧化物歧化酶2(SOD2)、過氧化氫酶(CAT)、A 類清道夫受體(SR-A)、過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)等兔抗大鼠抗體均購自美國Abcam 公司;DM2500 熒光顯微鏡購自德國徠卡。

    1.3 大鼠膿毒癥模型建立及分組給藥

    取40 只大鼠,參照文獻(xiàn)[8]經(jīng)大鼠腹腔注射脂多糖5 mg/kg 建立膿毒癥模型,造模成功大鼠隨機分為模型組、阿昔莫司組、ATRA 組、阿昔莫司+ATRA 組,每組10 只。另取10 只大鼠,腹腔注射等量生理鹽水,作為正常對照組。

    各組大鼠均于脂多糖注射6 h 后,開始給藥(記為給藥第0 天),阿昔莫司組參照文獻(xiàn)[9]灌胃給予32 mg/kg 阿昔莫司;ATRA 組腹腔注射給予ATRA(0.2 mg/kg,給藥3 d)[10];阿昔莫司+ATRA 組灌胃給予阿昔莫司的同時,腹腔注射ATRA,阿昔莫司與ATRA 劑量同前;模型組及正常對照組灌胃并腹腔注射給予等量生理鹽水。連續(xù)給藥3 d 后,統(tǒng)計大鼠成活只數(shù),并同時取血和獲取心肌組織。

    1.4 ELISA 法檢測大鼠血清心肌損傷標(biāo)志物及血脂水平變化

    取各組大鼠腹主動脈血6 ml,血液生化分析儀檢測心肌損傷標(biāo)志物CK、LDH、cTnI 水平;按ELISA 法測血脂相關(guān)指標(biāo)TC、HDL-C、LDL-C、TG、FFA 水平。

    1.5 ELISA 法檢測大鼠心肌組織氧化應(yīng)激及炎癥因子水平

    大鼠處死,摘取心肌組織剪碎后勻漿,勻漿液ELISA 法測心肌組織中氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA、ROS 水平及炎癥因子IL-6、TNF-α 水平,剩余心肌組織,一部分置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?;另一部分置于多聚甲醛中固定,制成石蠟切片,備用?/p>

    1.6 蘇木素-伊紅(HE)染色及TUNEL 染色法測心肌組織損傷及心肌細(xì)胞凋亡情況

    取已制備石蠟切片,進(jìn)行染色封片后置于光鏡下觀察拍照。用Image-Pro Plus 6 軟件系統(tǒng)測TUNEL 染色切片中單位面積內(nèi)被染成紅棕色的凋亡細(xì)胞數(shù)目,細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目×100%,統(tǒng)計分析細(xì)胞凋亡情況。

    1.7 免疫熒光染色法檢測心肌組織的細(xì)胞核中Nrf2陽性表達(dá)水平

    取已制備石蠟切片,脫蠟、水化、透化及抗原修復(fù)后,加入一抗,4 ℃孵育過夜后,加入二抗孵育2 h,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染后,Image-Pro Plus 5.0 圖像分析系統(tǒng)分析單位面積內(nèi)Nrf2 在細(xì)胞核中陽性染色的平均光密度值。

    1.8 蛋白免疫印跡法檢測細(xì)胞HO-1、NF-κB、p-NF-κB、SOD2、CAT、LPL、PPARα、SR-A 蛋白表達(dá)

    取冰箱中保存的心肌組織,裂解、勻漿,軸提胞漿蛋白及核蛋白,BCA 法測蛋白濃度,取50 μg蛋白行電泳、轉(zhuǎn)膜反應(yīng),加入一抗,內(nèi)參β-肌動蛋白(β-actin),4 ℃孵育過夜,辣根過氧化物酶二抗(1:800)室溫孵育1 h,增強化學(xué)發(fā)光法顯影曝光,化學(xué)發(fā)光成像儀拍照,Image J 分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

    1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

    采用GraphPad Prism 8 及SPSS 24.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較及進(jìn)一步兩兩比較分別用單因素方差分析及SNK-q 檢驗,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠一般行為

    正常對照組大鼠無死亡,飲食、活動及精神狀態(tài)正常。模型組大鼠死亡2 只,飲食及活動量減少,呼吸加快、豎毛、精神萎靡、稀水樣排便行為增加。阿昔莫司組大鼠無死亡,飲食及活動量有所增加,大部分呼吸較為平緩,豎毛、精神萎靡癥狀緩解,糞便較為濃稠。ATRA 組死亡4 只,飲食及活動量進(jìn)一步減少,精神萎靡及稀水樣排便癥狀進(jìn)一步加重。阿昔莫司+ATRA 組死亡2 只,飲食、活動量、精神萎靡、豎毛、呼吸加快、稀水樣排便癥狀重于阿昔莫司組,但輕于ATRA 組,并與模型組相近。

    2.2 各組大鼠心肌損傷標(biāo)志物、血脂指標(biāo)、氧化應(yīng)激產(chǎn)物及炎癥因子的比較

    與正常對照組相比,模型組大鼠血清CK、LDH、cTnI 水平升高,TC、HDL-C、LDL-C 水平降低,TG、FFA 水平升高,MDA、ROS、IL-6、TNF-α水平升高,P均<0.05。與模型組相比,阿昔莫司組大鼠血清CK、LDH、cTnI 水平降低,TC、HDL-C、LDL-C 水平升高,MDA、ROS、IL-6、TNF-α 水平降低,P均<0.05;ATRA 組大鼠血清CK、LDH、cTnI 水平升高,TC、HDL-C、LDL-C 水平進(jìn)一步降低,MDA、ROS、IL-6、TNF-α 水平進(jìn)一步升高,P均<0.05。與阿昔莫司組相比,ATRA 組、阿昔莫司+ATRA 組血清CK、LDH、cTnI 水平升高,TC、HDL-C、LDL-C 水平降低,MDA、ROS、IL-6、TNF-α 水平升高,P均<0.05。與ATRA 組相比,阿昔莫司+ATRA 組血清CK、LDH、cTnI 水平降低,而TC、HDL-C、LDL-C 水平升高,MDA、ROS、IL-6、TNF-α 水平降低,P均<0.05,見表1。

    表1 各組大鼠心肌損傷標(biāo)志物、血脂指標(biāo)、氧化應(yīng)激產(chǎn)物及炎癥因子水平及Nrf2 下游抗氧化、抗炎、脂質(zhì)代謝相關(guān)通路蛋白表達(dá)的比較()

    表1 各組大鼠心肌損傷標(biāo)志物、血脂指標(biāo)、氧化應(yīng)激產(chǎn)物及炎癥因子水平及Nrf2 下游抗氧化、抗炎、脂質(zhì)代謝相關(guān)通路蛋白表達(dá)的比較()

    注:Nrf2:核因子E2 相關(guān)因子2;ATRA:全反式維甲酸;CK:肌酸激酶;LDH:乳酸脫氫酶;cTnI:心肌肌鈣蛋白I;TC:總膽固醇;HDL-C:高密度脂蛋白膽固醇;LDL-C:低密度脂蛋白膽固醇;TG:甘油三酯;FFA:游離脂肪酸;MDA:丙二醛;ROS:活性氧簇;IL-6:白細(xì)胞介素-6;TNF-α:腫瘤壞死因子-α;HO-1:血紅素加氧酶-1;SOD2:超氧化物歧化酶2;CAT:過氧化氫酶;p-NF-κB:磷酸化NF-κB;NF-κB:核因子-κB;β-actin:β-肌動蛋白;LPL:脂蛋白脂肪酶;SR-A:A 類清道夫受體;PPARα:過氧化物酶體增殖物激活受體α。與正常對照組比*P<0.05,與模型組比△P<0.05,與阿昔莫司組比▲P<0.05,與ATRA 組比◇P<0.05

    2.3 各組大鼠心肌損傷及心肌細(xì)胞凋亡情況(圖1)

    圖1 各組大鼠心肌組織蘇木素-伊紅染色及TUNEL 染色圖(×400)

    HE 染色可見,正常對照組大鼠心肌組織細(xì)胞排列整齊,橫紋清晰,結(jié)構(gòu)正常;模型組大鼠可見心肌纖維斷裂、間隔增寬、紅細(xì)胞滲出明顯。TUNEL 染色可見,正常對照組大鼠心肌細(xì)胞僅有少量被染成紅棕色,細(xì)胞凋亡較少;模型組大鼠可見細(xì)胞紅棕色染色加深,細(xì)胞凋亡增加。

    與正常對照組相比,模型組大鼠心肌纖維斷裂、炎性細(xì)胞浸潤等病理損傷加重,心肌細(xì)胞凋亡率升高[(0.20±0.00)% vs.(1.69±0.25)%,P<0.05]。與模型組相比,阿昔莫司組上述病理損傷緩解,心肌細(xì)胞凋亡率降低[(1.69±0.25)% vs.(1.09±0.45)%,P<0.05];ATRA 組心肌損傷進(jìn)一步加重,心肌細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高[(1.69±0.25)%vs.(2.66±0.51)%,P<0.05]。與阿昔莫司組相比,ATRA 組[(1.09±0.45)% vs.(2.66±0.51)%]、阿昔莫司+ATRA 組[(1.09±0.45)% vs.(1.66±0.42)%]心肌細(xì)胞凋亡率升高(P均<0.05),心肌損傷加重。與ATRA 組相比,阿昔莫司+ATRA 組心肌損傷減輕,心肌細(xì)胞凋亡率降低[(2.66±0.51)% vs.(1.66±0.42)%,P<0.05]。

    2.4 各組大鼠心肌組織的細(xì)胞核中Nrf2 表達(dá)(圖2)

    圖2 各組大鼠心肌組織細(xì)胞Nrf2 免疫熒光染色圖(×400)

    免疫熒光染色可見,Nrf2 在正常對照組大鼠心肌組織的細(xì)胞核中呈弱陽性表達(dá),在模型組呈強陽性表達(dá)且高于正常對照組[(1.02±0.10)mm2vs.(0.26±0.01)mm2],在阿昔莫司組陽性表達(dá)進(jìn)一步升高且高于模型組[(1.89±0.18)mm2vs.(1.02±0.10)mm2],在ATRA 組陽性表達(dá)減弱并低于模型組[(0.42±0.04)mm2vs.(1.02±0.10)mm2]與阿昔莫司組[(0.42±0.04)mm2vs.(1.89±0.18)mm2],在阿昔莫司+ATRA 組陽性表達(dá)也減弱且低于阿昔莫司組[(1.03±0.09)mm2vs.(1.89±0.18)mm2],P均<0.05。

    2.5 各組大鼠心肌組織Nrf2 下游抗氧化、抗炎相關(guān)通路及脂質(zhì)代謝相關(guān)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)(圖3~4、表1)

    圖3 各組大鼠心肌組織HO-1、SOD2、CAT、p-NF-κB、NF-κB 蛋白表達(dá)免疫印跡圖

    與正常對照組相比,模型組大鼠心肌組織HO-1、SOD2、CAT、p-NF-κB/NF-κB 及LPL、SR-A、PPARα 的蛋白表達(dá)均升高(P均<0.05)。與模型組相比,阿昔莫司組大鼠心肌組織中HO-1、SOD2、CAT 及SR-A、PPARα 的蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高(P均<0.05),p-NF-κB/NF-κB、LPL 的蛋白表達(dá)降低(P均<0.05);ATRA 組大鼠心肌組織中HO-1、SOD2、CAT 及SR-A、PPARα 的蛋白表達(dá)降低(P均<0.05),p-NF-κB/NF-κB、LPL的蛋白表達(dá)升高(P均<0.05)。與阿昔莫司組相比,ATRA 組、阿昔莫司+ATRA 組大鼠心肌組織中HO-1、SOD2、CAT 及SR-A、PPARα 的蛋白表達(dá)降低(P均<0.05),p-NF-κB/NF-κB、LPL 的蛋白表達(dá)升高(P均<0.05)。與ATRA 組相比,阿昔莫司+ATRA 組大鼠心肌組織中HO-1、SOD2、CAT 及SR-A、PPARα 的蛋白表達(dá)升高(P均<0.05),p-NF-κB/NF-κB、LPL 的蛋白表達(dá)降低(P均<0.05)。

    圖4 各組大鼠心肌組織LPL、SR-A、PPARα 蛋白表達(dá)免疫印跡圖

    3 討論

    研究證實,脂多糖刺激后,心肌組織發(fā)生氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)是膿毒癥的主要病理機制[11-13]。Wang 等[14]及李波等[15]通過體內(nèi)外實驗研究發(fā)現(xiàn),脂多糖可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶系統(tǒng)激活,并促進(jìn)ROS 在心肌細(xì)胞內(nèi)釋放及積聚。本研究發(fā)現(xiàn),模型大鼠心肌組織中發(fā)生氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)及細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。Wang等[16]認(rèn)為血脂水平的改變是引起膿毒癥全身炎癥反應(yīng)增加的潛在因素;許青宗等[17]認(rèn)為膽固醇下降可引起炎性反應(yīng)失控及組織損傷加重,進(jìn)而加劇膿毒癥病情惡化進(jìn)程。LPL 能夠水解細(xì)胞外TG釋放出FFA,使胞內(nèi)FFA 增加,而加劇心肌損傷。本研究結(jié)果提示膿毒癥心肌損傷大鼠出現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂現(xiàn)象。

    鑒于膿毒癥心肌損傷大鼠存在脂質(zhì)代謝紊亂現(xiàn)象,推測阿昔莫司可能通過改善脂質(zhì)水平,緩解膿毒癥大鼠心肌損傷。本研究發(fā)現(xiàn),模型大鼠阿昔莫司干預(yù)治療后,心肌損傷及心肌細(xì)胞凋亡緩解,心肌組織氧化應(yīng)激產(chǎn)物及炎癥因子釋放減少,證實阿昔莫司或可用于膿毒癥心肌氧化應(yīng)激、炎癥、血脂水平異常的治療。

    細(xì)菌、ROS 及炎癥因子等應(yīng)激刺激條件下,均可促進(jìn)Nrf2 與Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白Keap1解離并活化轉(zhuǎn)錄入核,啟動下游HO-1 轉(zhuǎn)錄,誘導(dǎo)CAT、SOD2 等抗氧化物酶活性增加,而清除ROS積累并發(fā)揮抗氧化作用[18]。另外,NF-κB 通路中NF-κB 磷酸化入核活化與炎癥的發(fā)生密切相關(guān),其可促進(jìn)炎癥發(fā)展,同時引起機體氧化應(yīng)激異常,而機體對炎癥和氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)可通過Nrf2 通路活化實現(xiàn),活化的Nrf2 可促進(jìn)抗氧化酶HO-1 表達(dá),而HO-1 參與調(diào)控促炎因子產(chǎn)生,HO-1 表達(dá)增加可阻斷NF-κB 磷酸化活化,從而發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激作用,抑制細(xì)胞損傷和凋亡[19-20]。Tao 等[21]及Li 等[22]發(fā)現(xiàn),Nrf2/HO-1 通路活化緩解肝組織氧化應(yīng)激損傷的同時,還能上調(diào)脂肪酸激活的轉(zhuǎn)錄因子PPARα,啟動脂肪酸代謝相關(guān)基因SR-A 表達(dá)來抑制脂肪酸及TG 等引起的脂質(zhì)堆積,維持脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài),發(fā)揮組織保護作用,預(yù)示Nrf2/HO-1 通路激活,也可改善組織脂質(zhì)代謝異常,發(fā)揮抗組織損傷作用。本研究表明,脂多糖可能通過調(diào)控Nrf2/HO-1/NF-κB 通路誘導(dǎo)心肌組織氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)代謝異常,而此時Nrf2、HO-1、SOD2、CAT、SR-A、PPARα 表達(dá)增加可能是體內(nèi)應(yīng)對氧化應(yīng)激、炎癥和脂質(zhì)代謝異常刺激的一種代償反應(yīng)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),阿昔莫司作用于膿毒癥大鼠后,心肌組織中Nrf2/HO-1 通路進(jìn)一步活化,提示阿昔莫司發(fā)揮抗膿毒癥心肌氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、血脂水平異常的作用,可能與激活Nrf2/HO-1 通路有關(guān)。而用Nrf2 通路抑制劑ATRA 阻斷心肌組織中Nrf2 入核活化后,膿毒癥大鼠心肌組織中HO-1 表達(dá)降低,其下游抗氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)SOD2、CAT表達(dá)及脂質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)PPARα、SR-A 表達(dá)亦降低,而NF-κB 磷酸化水平升高,大鼠心肌組織損傷及細(xì)胞凋亡進(jìn)一步加重,炎癥因子、氧化應(yīng)激產(chǎn)物分泌增加,血脂水平及脂質(zhì)代謝異常也進(jìn)一步加重,大鼠死亡增加,提示阻斷Nrf2/HO-1 通路活化,可加重膿毒癥大鼠心肌氧化應(yīng)激、炎癥、血脂水平異常等反應(yīng),從而加劇病情的發(fā)展。此外,本研究發(fā)現(xiàn),阿昔莫司+ATRA 組對膿毒癥大鼠的作用效果介于ATRA 組和阿昔莫司組之間,說明ATRA 一定程度上抵消了阿昔莫司對膿毒癥大鼠的作用,這也恰好證明了阿昔莫司發(fā)揮抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗凋亡和改善血脂水平異常,從而緩解脂多糖誘導(dǎo)膿毒癥大鼠心肌損傷的作用是通過激活Nrf2/HO-1 通路實現(xiàn)的。但本研究結(jié)果與Jia 等[23]研究發(fā)現(xiàn)的巨噬細(xì)胞中HO-1 的功能喪失可保護脂多糖誘導(dǎo)的心肌損傷結(jié)果貌似矛盾,原因可能是:HO-1 在不同細(xì)胞中發(fā)揮的功能可能略有差別,而本研究檢測的是整個心肌組織中HO-1 表達(dá),而在脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥心肌損傷中,心肌組織中的多種細(xì)胞共同參與。

    綜上所述,阿昔莫司能激活Nrf2/HO-1 通路介導(dǎo)的抗炎、抗氧化應(yīng)激及抗脂質(zhì)代謝異常等途徑,緩解脂多糖誘導(dǎo)建立的膿毒癥大鼠心肌氧化應(yīng)激、炎癥、脂質(zhì)堆積等引起的損傷。這可能為阿昔莫司在膿毒癥領(lǐng)域的應(yīng)用提供一定參考。但膿毒癥心肌損傷機制復(fù)雜,還涉及心血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、自噬等,膿毒癥脂質(zhì)代謝途徑涉及的通路也相對復(fù)雜,阿昔莫司在膿毒癥領(lǐng)域的應(yīng)用,還需進(jìn)一步探究及驗證。

    利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突

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