阿昔莫司對脂多糖誘導(dǎo)膿毒癥大鼠心肌損傷及Nrf2/HO-1 信號通路的影響

黃泓軻，羅健瑋，冉華

心臟是膿毒癥最主要的受累器官，有超過70%的膿毒癥動物發(fā)生心功能障礙，并導(dǎo)致死亡[1-2]。研究認(rèn)為，膿毒癥心肌損傷的發(fā)病機制涉及心肌細(xì)胞凋亡、自主神經(jīng)失調(diào)、能量代謝及心肌抑制因子等多種因素[3]。革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中的脂多糖可作膿毒癥的主要致病因素，引起全身炎癥反應(yīng)，造成機體多組織、多器官繼發(fā)性損傷[4]。目前研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖刺激機體組織后，組織供能失衡引起脂質(zhì)代謝紊亂、脂質(zhì)毒性物質(zhì)釋放及積累，可激活氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)途徑，加劇心肌組織細(xì)胞損傷及凋亡[5]。研究發(fā)現(xiàn)，阿昔莫司聯(lián)合瑞舒伐他汀可改善心肌酶譜[6]。研究證實，阿昔莫司發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡的重要通路核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）/血紅素加氧酶-1（HO-1），參與心肌組織細(xì)胞損傷后修復(fù)過程[7]。但阿昔莫司能否改善膿毒癥心肌損傷及相關(guān)作用機制還未見明確報道?；诖耍狙芯繎?yīng)用脂多糖誘導(dǎo)建立了大鼠膿毒癥模型，初步探究阿昔莫司對膿毒癥大鼠心肌損傷的影響及Nrf2/HO-1 通路在此過程中扮演的角色，以期為阿昔莫司在膿毒癥領(lǐng)域的治療應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

50只SD大鼠，雌雄不限，清潔級，體重200～220 g，6～8 周齡，購自四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所。本實驗經(jīng)本院動物倫理委員會批準(zhǔn)[批準(zhǔn)號：IACUC-01（20200102）]，嚴(yán)格遵循3R 原則。

1.2 主要試劑及儀器

阿昔莫司（規(guī)格100 mg）購自上海喬羽生物科技有限公司；脂多糖（來源于大腸桿菌 0111：B4）、Nrf2通路抑制劑全反式維甲酸（ATRA）（HPLC ≥98%）購自美國Sigma 公司；肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cTnⅠ）ELISA 試劑盒分別購自無錫云萃生物科技有限公司、上海研生實業(yè)有限公司與上海賽可銳生物科技有限公司；總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、甘油三酯（TG）、游離脂肪酸（FFA）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒均購自江西艾博因生物科技有限公司；丙二醛（MDA）、活性氧簇（ROS）ELISA 試劑盒分別購自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司和上海圻明生物科技有限公司；Nrf2、HO-1、核因子-κB（NF-κB）、磷酸化NF-κB（p-NF-κB）、脂蛋白脂肪酶（LPL）、超氧化物歧化酶2（SOD2）、過氧化氫酶（CAT）、A 類清道夫受體（SR-A）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）等兔抗大鼠抗體均購自美國Abcam 公司；DM2500 熒光顯微鏡購自德國徠卡。

1.3 大鼠膿毒癥模型建立及分組給藥

取40 只大鼠，參照文獻(xiàn)[8]經(jīng)大鼠腹腔注射脂多糖5 mg/kg 建立膿毒癥模型，造模成功大鼠隨機分為模型組、阿昔莫司組、ATRA 組、阿昔莫司+ATRA 組，每組10 只。另取10 只大鼠，腹腔注射等量生理鹽水，作為正常對照組。

各組大鼠均于脂多糖注射6 h 后，開始給藥（記為給藥第0 天），阿昔莫司組參照文獻(xiàn)[9]灌胃給予32 mg/kg 阿昔莫司；ATRA 組腹腔注射給予ATRA（0.2 mg/kg，給藥3 d）[10]；阿昔莫司+ATRA 組灌胃給予阿昔莫司的同時，腹腔注射ATRA，阿昔莫司與ATRA 劑量同前；模型組及正常對照組灌胃并腹腔注射給予等量生理鹽水。連續(xù)給藥3 d 后，統(tǒng)計大鼠成活只數(shù)，并同時取血和獲取心肌組織。

1.4 ELISA 法檢測大鼠血清心肌損傷標(biāo)志物及血脂水平變化

取各組大鼠腹主動脈血6 ml，血液生化分析儀檢測心肌損傷標(biāo)志物CK、LDH、cTnI 水平；按ELISA 法測血脂相關(guān)指標(biāo)TC、HDL-C、LDL-C、TG、FFA 水平。

1.5 ELISA 法檢測大鼠心肌組織氧化應(yīng)激及炎癥因子水平

大鼠處死，摘取心肌組織剪碎后勻漿，勻漿液ELISA 法測心肌組織中氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA、ROS 水平及炎癥因子IL-6、TNF-α 水平，剩余心肌組織，一部分置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；另一部分置于多聚甲醛中固定，制成石蠟切片，備用?/p>

1.6 蘇木素-伊紅（HE）染色及TUNEL 染色法測心肌組織損傷及心肌細(xì)胞凋亡情況

取已制備石蠟切片，進(jìn)行染色封片后置于光鏡下觀察拍照。用Image-Pro Plus 6 軟件系統(tǒng)測TUNEL 染色切片中單位面積內(nèi)被染成紅棕色的凋亡細(xì)胞數(shù)目，細(xì)胞凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目×100%，統(tǒng)計分析細(xì)胞凋亡情況。

1.7 免疫熒光染色法檢測心肌組織的細(xì)胞核中Nrf2陽性表達(dá)水平

取已制備石蠟切片，脫蠟、水化、透化及抗原修復(fù)后，加入一抗，4 ℃孵育過夜后，加入二抗孵育2 h，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）核染后，Image-Pro Plus 5.0 圖像分析系統(tǒng)分析單位面積內(nèi)Nrf2 在細(xì)胞核中陽性染色的平均光密度值。

1.8 蛋白免疫印跡法檢測細(xì)胞HO-1、NF-κB、p-NF-κB、SOD2、CAT、LPL、PPARα、SR-A 蛋白表達(dá)

取冰箱中保存的心肌組織，裂解、勻漿，軸提胞漿蛋白及核蛋白，BCA 法測蛋白濃度，取50 μg蛋白行電泳、轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，加入一抗，內(nèi)參β-肌動蛋白（β-actin），4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶二抗（1：800）室溫孵育1 h，增強化學(xué)發(fā)光法顯影曝光，化學(xué)發(fā)光成像儀拍照，Image J 分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8 及SPSS 24.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較及進(jìn)一步兩兩比較分別用單因素方差分析及SNK-q 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般行為

正常對照組大鼠無死亡，飲食、活動及精神狀態(tài)正常。模型組大鼠死亡2 只，飲食及活動量減少，呼吸加快、豎毛、精神萎靡、稀水樣排便行為增加。阿昔莫司組大鼠無死亡，飲食及活動量有所增加，大部分呼吸較為平緩，豎毛、精神萎靡癥狀緩解，糞便較為濃稠。ATRA 組死亡4 只，飲食及活動量進(jìn)一步減少，精神萎靡及稀水樣排便癥狀進(jìn)一步加重。阿昔莫司+ATRA 組死亡2 只，飲食、活動量、精神萎靡、豎毛、呼吸加快、稀水樣排便癥狀重于阿昔莫司組，但輕于ATRA 組，并與模型組相近。

2.2 各組大鼠心肌損傷標(biāo)志物、血脂指標(biāo)、氧化應(yīng)激產(chǎn)物及炎癥因子的比較

與正常對照組相比，模型組大鼠血清CK、LDH、cTnI 水平升高，TC、HDL-C、LDL-C 水平降低，TG、FFA 水平升高，MDA、ROS、IL-6、TNF-α水平升高，P均＜0.05。與模型組相比，阿昔莫司組大鼠血清CK、LDH、cTnI 水平降低，TC、HDL-C、LDL-C 水平升高，MDA、ROS、IL-6、TNF-α 水平降低，P均＜0.05；ATRA 組大鼠血清CK、LDH、cTnI 水平升高，TC、HDL-C、LDL-C 水平進(jìn)一步降低，MDA、ROS、IL-6、TNF-α 水平進(jìn)一步升高，P均＜0.05。與阿昔莫司組相比，ATRA 組、阿昔莫司+ATRA 組血清CK、LDH、cTnI 水平升高，TC、HDL-C、LDL-C 水平降低，MDA、ROS、IL-6、TNF-α 水平升高，P均＜0.05。與ATRA 組相比，阿昔莫司+ATRA 組血清CK、LDH、cTnI 水平降低，而TC、HDL-C、LDL-C 水平升高，MDA、ROS、IL-6、TNF-α 水平降低，P均＜0.05，見表1。

表1 各組大鼠心肌損傷標(biāo)志物、血脂指標(biāo)、氧化應(yīng)激產(chǎn)物及炎癥因子水平及Nrf2 下游抗氧化、抗炎、脂質(zhì)代謝相關(guān)通路蛋白表達(dá)的比較（）

表1 各組大鼠心肌損傷標(biāo)志物、血脂指標(biāo)、氧化應(yīng)激產(chǎn)物及炎癥因子水平及Nrf2 下游抗氧化、抗炎、脂質(zhì)代謝相關(guān)通路蛋白表達(dá)的比較（）

注：Nrf2：核因子E2 相關(guān)因子2；ATRA：全反式維甲酸；CK：肌酸激酶；LDH：乳酸脫氫酶；cTnI：心肌肌鈣蛋白I；TC：總膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；TG：甘油三酯；FFA：游離脂肪酸；MDA：丙二醛；ROS：活性氧簇；IL-6：白細(xì)胞介素-6；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；HO-1：血紅素加氧酶-1；SOD2：超氧化物歧化酶2；CAT：過氧化氫酶；p-NF-κB：磷酸化NF-κB；NF-κB：核因子-κB；β-actin：β-肌動蛋白；LPL：脂蛋白脂肪酶；SR-A：A 類清道夫受體；PPARα：過氧化物酶體增殖物激活受體α。與正常對照組比*P＜0.05，與模型組比△P＜0.05，與阿昔莫司組比▲P＜0.05，與ATRA 組比◇P＜0.05

2.3 各組大鼠心肌損傷及心肌細(xì)胞凋亡情況（圖1）

圖1 各組大鼠心肌組織蘇木素-伊紅染色及TUNEL 染色圖（×400）

HE 染色可見，正常對照組大鼠心肌組織細(xì)胞排列整齊，橫紋清晰，結(jié)構(gòu)正常；模型組大鼠可見心肌纖維斷裂、間隔增寬、紅細(xì)胞滲出明顯。TUNEL 染色可見，正常對照組大鼠心肌細(xì)胞僅有少量被染成紅棕色，細(xì)胞凋亡較少；模型組大鼠可見細(xì)胞紅棕色染色加深，細(xì)胞凋亡增加。

與正常對照組相比，模型組大鼠心肌纖維斷裂、炎性細(xì)胞浸潤等病理損傷加重，心肌細(xì)胞凋亡率升高[（0.20±0.00）% vs.（1.69±0.25）%，P＜0.05]。與模型組相比，阿昔莫司組上述病理損傷緩解，心肌細(xì)胞凋亡率降低[（1.69±0.25）% vs.（1.09±0.45）%，P＜0.05]；ATRA 組心肌損傷進(jìn)一步加重，心肌細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高[（1.69±0.25）%vs.（2.66±0.51）%，P＜0.05]。與阿昔莫司組相比，ATRA 組[（1.09±0.45）% vs.（2.66±0.51）%]、阿昔莫司+ATRA 組[（1.09±0.45）% vs.（1.66±0.42）%]心肌細(xì)胞凋亡率升高（P均＜0.05），心肌損傷加重。與ATRA 組相比，阿昔莫司+ATRA 組心肌損傷減輕，心肌細(xì)胞凋亡率降低[（2.66±0.51）% vs.（1.66±0.42）%，P＜0.05]。

2.4 各組大鼠心肌組織的細(xì)胞核中Nrf2 表達(dá)（圖2）

圖2 各組大鼠心肌組織細(xì)胞Nrf2 免疫熒光染色圖（×400）

免疫熒光染色可見，Nrf2 在正常對照組大鼠心肌組織的細(xì)胞核中呈弱陽性表達(dá)，在模型組呈強陽性表達(dá)且高于正常對照組[（1.02±0.10）mm2vs.（0.26±0.01）mm2]，在阿昔莫司組陽性表達(dá)進(jìn)一步升高且高于模型組[（1.89±0.18）mm2vs.（1.02±0.10）mm2]，在ATRA 組陽性表達(dá)減弱并低于模型組[（0.42±0.04）mm2vs.（1.02±0.10）mm2]與阿昔莫司組[（0.42±0.04）mm2vs.（1.89±0.18）mm2]，在阿昔莫司+ATRA 組陽性表達(dá)也減弱且低于阿昔莫司組[（1.03±0.09）mm2vs.（1.89±0.18）mm2]，P均＜0.05。

2.5 各組大鼠心肌組織Nrf2 下游抗氧化、抗炎相關(guān)通路及脂質(zhì)代謝相關(guān)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)（圖3～4、表1）

圖3 各組大鼠心肌組織HO-1、SOD2、CAT、p-NF-κB、NF-κB 蛋白表達(dá)免疫印跡圖

與正常對照組相比，模型組大鼠心肌組織HO-1、SOD2、CAT、p-NF-κB/NF-κB 及LPL、SR-A、PPARα 的蛋白表達(dá)均升高（P均＜0.05）。與模型組相比，阿昔莫司組大鼠心肌組織中HO-1、SOD2、CAT 及SR-A、PPARα 的蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高（P均＜0.05），p-NF-κB/NF-κB、LPL 的蛋白表達(dá)降低（P均＜0.05）；ATRA 組大鼠心肌組織中HO-1、SOD2、CAT 及SR-A、PPARα 的蛋白表達(dá)降低（P均＜0.05），p-NF-κB/NF-κB、LPL的蛋白表達(dá)升高（P均＜0.05）。與阿昔莫司組相比，ATRA 組、阿昔莫司+ATRA 組大鼠心肌組織中HO-1、SOD2、CAT 及SR-A、PPARα 的蛋白表達(dá)降低（P均＜0.05），p-NF-κB/NF-κB、LPL 的蛋白表達(dá)升高（P均＜0.05）。與ATRA 組相比，阿昔莫司+ATRA 組大鼠心肌組織中HO-1、SOD2、CAT 及SR-A、PPARα 的蛋白表達(dá)升高（P均＜0.05），p-NF-κB/NF-κB、LPL 的蛋白表達(dá)降低（P均＜0.05）。

圖4 各組大鼠心肌組織LPL、SR-A、PPARα 蛋白表達(dá)免疫印跡圖

3 討論

研究證實，脂多糖刺激后，心肌組織發(fā)生氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)是膿毒癥的主要病理機制[11-13]。Wang 等[14]及李波等[15]通過體內(nèi)外實驗研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶系統(tǒng)激活，并促進(jìn)ROS 在心肌細(xì)胞內(nèi)釋放及積聚。本研究發(fā)現(xiàn)，模型大鼠心肌組織中發(fā)生氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)及細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。Wang等[16]認(rèn)為血脂水平的改變是引起膿毒癥全身炎癥反應(yīng)增加的潛在因素；許青宗等[17]認(rèn)為膽固醇下降可引起炎性反應(yīng)失控及組織損傷加重，進(jìn)而加劇膿毒癥病情惡化進(jìn)程。LPL 能夠水解細(xì)胞外TG釋放出FFA，使胞內(nèi)FFA 增加，而加劇心肌損傷。本研究結(jié)果提示膿毒癥心肌損傷大鼠出現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂現(xiàn)象。

鑒于膿毒癥心肌損傷大鼠存在脂質(zhì)代謝紊亂現(xiàn)象，推測阿昔莫司可能通過改善脂質(zhì)水平，緩解膿毒癥大鼠心肌損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，模型大鼠阿昔莫司干預(yù)治療后，心肌損傷及心肌細(xì)胞凋亡緩解，心肌組織氧化應(yīng)激產(chǎn)物及炎癥因子釋放減少，證實阿昔莫司或可用于膿毒癥心肌氧化應(yīng)激、炎癥、血脂水平異常的治療。

細(xì)菌、ROS 及炎癥因子等應(yīng)激刺激條件下，均可促進(jìn)Nrf2 與Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白Keap1解離并活化轉(zhuǎn)錄入核，啟動下游HO-1 轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)CAT、SOD2 等抗氧化物酶活性增加，而清除ROS積累并發(fā)揮抗氧化作用[18]。另外，NF-κB 通路中NF-κB 磷酸化入核活化與炎癥的發(fā)生密切相關(guān)，其可促進(jìn)炎癥發(fā)展，同時引起機體氧化應(yīng)激異常，而機體對炎癥和氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)可通過Nrf2 通路活化實現(xiàn)，活化的Nrf2 可促進(jìn)抗氧化酶HO-1 表達(dá)，而HO-1 參與調(diào)控促炎因子產(chǎn)生，HO-1 表達(dá)增加可阻斷NF-κB 磷酸化活化，從而發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激作用，抑制細(xì)胞損傷和凋亡[19-20]。Tao 等[21]及Li 等[22]發(fā)現(xiàn)，Nrf2/HO-1 通路活化緩解肝組織氧化應(yīng)激損傷的同時，還能上調(diào)脂肪酸激活的轉(zhuǎn)錄因子PPARα，啟動脂肪酸代謝相關(guān)基因SR-A 表達(dá)來抑制脂肪酸及TG 等引起的脂質(zhì)堆積，維持脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)，發(fā)揮組織保護作用，預(yù)示Nrf2/HO-1 通路激活，也可改善組織脂質(zhì)代謝異常，發(fā)揮抗組織損傷作用。本研究表明，脂多糖可能通過調(diào)控Nrf2/HO-1/NF-κB 通路誘導(dǎo)心肌組織氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)代謝異常，而此時Nrf2、HO-1、SOD2、CAT、SR-A、PPARα 表達(dá)增加可能是體內(nèi)應(yīng)對氧化應(yīng)激、炎癥和脂質(zhì)代謝異常刺激的一種代償反應(yīng)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，阿昔莫司作用于膿毒癥大鼠后，心肌組織中Nrf2/HO-1 通路進(jìn)一步活化，提示阿昔莫司發(fā)揮抗膿毒癥心肌氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、血脂水平異常的作用，可能與激活Nrf2/HO-1 通路有關(guān)。而用Nrf2 通路抑制劑ATRA 阻斷心肌組織中Nrf2 入核活化后，膿毒癥大鼠心肌組織中HO-1 表達(dá)降低，其下游抗氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)SOD2、CAT表達(dá)及脂質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)PPARα、SR-A 表達(dá)亦降低，而NF-κB 磷酸化水平升高，大鼠心肌組織損傷及細(xì)胞凋亡進(jìn)一步加重，炎癥因子、氧化應(yīng)激產(chǎn)物分泌增加，血脂水平及脂質(zhì)代謝異常也進(jìn)一步加重，大鼠死亡增加，提示阻斷Nrf2/HO-1 通路活化，可加重膿毒癥大鼠心肌氧化應(yīng)激、炎癥、血脂水平異常等反應(yīng)，從而加劇病情的發(fā)展。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，阿昔莫司+ATRA 組對膿毒癥大鼠的作用效果介于ATRA 組和阿昔莫司組之間，說明ATRA 一定程度上抵消了阿昔莫司對膿毒癥大鼠的作用，這也恰好證明了阿昔莫司發(fā)揮抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗凋亡和改善血脂水平異常，從而緩解脂多糖誘導(dǎo)膿毒癥大鼠心肌損傷的作用是通過激活Nrf2/HO-1 通路實現(xiàn)的。但本研究結(jié)果與Jia 等[23]研究發(fā)現(xiàn)的巨噬細(xì)胞中HO-1 的功能喪失可保護脂多糖誘導(dǎo)的心肌損傷結(jié)果貌似矛盾，原因可能是：HO-1 在不同細(xì)胞中發(fā)揮的功能可能略有差別，而本研究檢測的是整個心肌組織中HO-1 表達(dá)，而在脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥心肌損傷中，心肌組織中的多種細(xì)胞共同參與。

綜上所述，阿昔莫司能激活Nrf2/HO-1 通路介導(dǎo)的抗炎、抗氧化應(yīng)激及抗脂質(zhì)代謝異常等途徑，緩解脂多糖誘導(dǎo)建立的膿毒癥大鼠心肌氧化應(yīng)激、炎癥、脂質(zhì)堆積等引起的損傷。這可能為阿昔莫司在膿毒癥領(lǐng)域的應(yīng)用提供一定參考。但膿毒癥心肌損傷機制復(fù)雜，還涉及心血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、自噬等，膿毒癥脂質(zhì)代謝途徑涉及的通路也相對復(fù)雜，阿昔莫司在膿毒癥領(lǐng)域的應(yīng)用，還需進(jìn)一步探究及驗證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突