共聚焦顯微拉曼光譜鼻咽癌檢測(cè)中的研究進(jìn)展*

王 雪，王萌萌，張秀明 綜述,熊 丹，3△ 審校

1.深圳羅湖區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，廣東深圳518000；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東汕頭 515041； 3.上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海201500

鼻咽癌(NPC)是起源于鼻咽上皮的頭頸部惡性腫瘤，據(jù)2018年發(fā)布的最新數(shù)據(jù)顯示，全球NPC新發(fā)病例約 12.9 萬例，其中中國的新發(fā)病例占全球的一半以上，該病對(duì)華南等NPC高發(fā)地區(qū)人民的生命健康造成嚴(yán)重威脅[1]。早期NPC對(duì)放療非常敏感，早期患者經(jīng)放療及臨床綜合治療，5 年生存率可高達(dá) 95%。但NPC發(fā)病部位隱匿，大部分NPC患者確診時(shí)已處于中晚期，這是導(dǎo)致NPC患者生存率普遍偏低的主要原因[2]。我國作為NPC發(fā)病率最高的國家，提高NPC早期診斷、療效和預(yù)后評(píng)價(jià)體系對(duì)改善我國NPC防治效果有重要意義。目前，NPC的臨床檢測(cè)手段主要包括：(1)EB病毒(EBV)病原體檢測(cè)，包括EBV-DNA和EBV編碼的微小RNA(miRNA)及EBV血清學(xué)抗體檢測(cè)，是目前臨床使用的最廣泛的生物標(biāo)志物，但僅針對(duì)非角化型NPC患者，且靈敏度和特異度均不理想。(2)影像學(xué)檢測(cè)，包括CT、MRI、PET/CT等，在晚期NPC預(yù)后判斷中具有良好的效果，但影像改變往往滯后于疾病進(jìn)展。(3)鼻腔鏡活檢結(jié)合病理組織分期是目前診斷NPC的金標(biāo)準(zhǔn)，但是病理學(xué)檢查具有侵襲性，檢測(cè)依賴于病理醫(yī)師的經(jīng)驗(yàn)判斷，具有一定的主觀性，難以對(duì)早期腫瘤或微小病灶進(jìn)行準(zhǔn)確診斷。以上手段在NPC的早期診斷上均存在一定的局限性。

拉曼光譜是由印度物理學(xué)家拉曼(Raman)于1928年發(fā)現(xiàn)的一種散射光譜，拉曼光譜技術(shù)可對(duì)與入射光頻率不同的散射光譜進(jìn)行分析以得到分子振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)方面信息[3]。該技術(shù)能夠用于分析物質(zhì)分子化學(xué)成分、結(jié)構(gòu)等信息，且操作簡便，無創(chuàng)，水干擾小和分辨能力高，在生物醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域具有明顯的優(yōu)勢(shì)和廣泛的應(yīng)用。傳統(tǒng)的拉曼光譜以單點(diǎn)探測(cè)為主，對(duì)于復(fù)雜的生物組織結(jié)構(gòu)分析具有一定的局限性，難以獲得完整的組化信息。隨著當(dāng)代技術(shù)的發(fā)展，新的拉曼光譜分析方法不斷產(chǎn)生，諸如表面增強(qiáng)拉曼光譜、共振拉曼光譜、相干反斯托克斯拉曼光譜法、受激拉曼散射、空間位移拉曼光譜和共聚焦等拉曼光譜。上述諸多新興的拉曼光譜分析方法可對(duì)生物樣本實(shí)現(xiàn)定性、定量、定位的研究，近年來已被廣泛應(yīng)用于人體細(xì)胞組織、人體體液和生物標(biāo)志的檢測(cè)，其在腫瘤早期診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)也有巨大的潛能。例如，表面增強(qiáng)拉曼光譜可識(shí)別多種癌癥，包括乳腺癌[4-5]、卵巢癌[6]、皮膚癌[7-8]、前列腺癌[9-10]等，其在化療藥物監(jiān)測(cè)方面也有初步應(yīng)用[11]。表面增強(qiáng)拉曼光譜同樣應(yīng)用于NPC診療過程中，如組織的良惡性、NPC分期等[12]。NPC患者體液樣品分析[13]以及內(nèi)鏡檢查方面的開發(fā)[14]也被廣泛研究，該技術(shù)能夠檢測(cè)NPC癌前病變狀態(tài)下細(xì)胞、組織以及體液的相關(guān)分子改變。但是表面增強(qiáng)拉曼光譜存在操作復(fù)雜、重現(xiàn)性較差等弊端，限制了其在臨床上廣泛使用的進(jìn)程。共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)是將拉曼光譜技術(shù)與共聚焦顯微分析技術(shù)結(jié)合起來的一種光譜分析技術(shù)，不依賴于表面增強(qiáng)，能夠在無標(biāo)記、無增強(qiáng)的條件下，對(duì)NPC細(xì)胞、組織、體液等進(jìn)行檢測(cè)，在NPC早期診斷方面具有極大應(yīng)用潛力。據(jù)此，本文綜述了近幾年來共聚焦顯微拉曼光譜在NPC診斷中的研究進(jìn)展和應(yīng)用前景，旨在為共聚焦拉曼光譜在NPC臨床診斷應(yīng)用的發(fā)展提供參考。

1 共聚焦顯微拉曼光譜原理

共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)是將拉曼光譜技術(shù)與共聚焦顯微分析技術(shù)結(jié)合起來的顯微共聚焦拉曼光譜成像技術(shù)(CRMI)，采用了低功率激光器、高轉(zhuǎn)換效率的全息電荷耦合陣列檢測(cè)器，共聚焦顯微鏡將激發(fā)光的光斑聚焦到微米量級(jí),進(jìn)而在不受周圍物質(zhì)的干擾下對(duì)樣品的微區(qū)進(jìn)行精確激光照射分析,產(chǎn)生的拉曼散射可通過光譜儀的解析而獲得照射區(qū)域物質(zhì)的拉曼圖譜[15]。相較于傳統(tǒng)拉曼光譜，共聚焦顯微拉曼光譜具有更高的空間分辨率、工作頻率、運(yùn)行速度和靈敏度等，其不但能對(duì)規(guī)模小至 0.5～1.0 μm微量樣品進(jìn)行分析，而且能夠?qū)崿F(xiàn)光譜與三維圖像相結(jié)合的定性、定量與定位分析。由于待測(cè)樣本體積微小，檢測(cè)結(jié)果幾乎不受熒光干擾，因而適合臨床檢測(cè)及化學(xué)結(jié)構(gòu)分析[16]。目前，共聚焦顯微拉曼光譜在多領(lǐng)域均有應(yīng)用，如鑒定和區(qū)分細(xì)菌菌株[17]，在亞細(xì)胞水平上分析化學(xué)組成[18]。國內(nèi)外已有一些共聚焦顯微拉曼光譜在腫瘤檢測(cè)中應(yīng)用的報(bào)道[19-20]。在NPC相關(guān)研究中，共聚焦顯微拉曼光譜不僅能夠?qū)PC單細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)也能區(qū)分NPC和正常組織的化學(xué)組成及分子結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)對(duì)NPC的快速診斷。 除此之外，共聚焦顯微拉曼光譜還能監(jiān)測(cè)化療藥物濃度及預(yù)測(cè)細(xì)胞耐藥性?？偠灾?，早期診斷及精準(zhǔn)治療能夠明顯改善患者預(yù)后及提高生存期，這對(duì)NPC的防治具有重要意義。

2 共聚焦顯微拉曼光譜在NPC檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀

2.1共聚焦顯微拉曼光譜在NPC單細(xì)胞檢測(cè)中的應(yīng)用 廣泛應(yīng)用的細(xì)胞內(nèi)成像方法有電子顯微鏡、冷凍電鏡術(shù)和免疫熒光顯微鏡等，這些方法由于需要固定、冷凍或熒光標(biāo)記的特點(diǎn)，均有侵入性，對(duì)被測(cè)細(xì)胞具有破壞性。1990年，PUPPELS等[21]首次應(yīng)用共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)對(duì)單細(xì)胞內(nèi)的分子構(gòu)成進(jìn)行了研究，自此，該技術(shù)因其高靈敏度，抗水干擾性及非標(biāo)記、非侵入性被廣泛應(yīng)用于組織鑒別和單細(xì)胞生物學(xué)的相關(guān)研究中。由于共聚焦拉曼光譜在分選癌細(xì)胞和正常細(xì)胞中具有高度特異度，其有望成為廣泛應(yīng)用的無標(biāo)記細(xì)胞分選新技術(shù)。早期研究已成功將共聚焦拉曼光譜用于區(qū)分不同腫瘤的正常和惡性細(xì)胞系中，如皮膚癌[22]、黑色素瘤[23]、前列腺癌[24]、膠質(zhì)瘤[25]。YE等[26]采用共聚焦拉曼光譜發(fā)現(xiàn)NPC細(xì)胞和鼻炎上皮細(xì)胞在1 449、1 657 cm-1光譜區(qū)域存在差異，進(jìn)而成功區(qū)分NPC和正常細(xì)胞系，并對(duì)不同的NPC細(xì)胞系(C666和CNE2)進(jìn)行區(qū)分，特異度高達(dá)100%。LI等[27]應(yīng)用顯微拉曼光譜成功區(qū)分了3種不同的NPC細(xì)胞和正常細(xì)胞系(C666-1、CNE1、CNE2和NP69)，靈敏度和特異度均高于90%。這些研究結(jié)果表明共聚焦拉曼光譜具有分選腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的潛能，有望成為一種無標(biāo)記腫瘤細(xì)胞分選方法并區(qū)分不同類型的腫瘤細(xì)胞，為NPC的診斷治療提供參考。

2.2共聚焦顯微拉曼光譜在NPC患者體液中的研究 人體體液(血清、血漿、全血、唾液、尿液等)含有無機(jī)鹽、糖、維生素、核酸、蛋白質(zhì)、脂類等各種成分，這些分子的構(gòu)象、組成和腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及藥物的療效密切相關(guān)。共聚焦拉曼光譜可以通過監(jiān)測(cè)體液中分子變化從而實(shí)現(xiàn)腫瘤的診斷、治療效果以及預(yù)后評(píng)估。欒藝等[28]早期采用共聚焦拉曼檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)胃癌患者和非胃癌患者血清檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在1 003、1 155、1 446、1 517、1 655、2 873、2 932、3 059 cm-1位移處的8個(gè)峰值存在差異，通過合OPLS-DA的統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)共聚焦拉曼光譜技術(shù)可對(duì)胃癌、胃良性病變患者及健康者的血清做鑒別區(qū)分。潘建基等[29]采用共聚焦顯微拉曼光譜對(duì)NPC患者和健康者血清進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在900～1 000 cm-1、1 600～1 700 cm-1和1 200～1 400 cm-1波段，NPC患者和健康者血清譜峰存在明顯差異，診斷特異度達(dá)91.7%。以上研究表明，共聚焦拉曼光譜可通過體液區(qū)分NPC患者和健康人群，其有望成為NPC無創(chuàng)輔助診斷的新方法。

2.3共聚焦顯微拉曼光譜在NPC患者組織中的應(yīng)用研究 惡性腫瘤組織和正常組織的蛋白質(zhì)、核酸、脂肪等組成及結(jié)構(gòu)不同，共聚焦顯微拉曼光譜能從分子水平上反映組織化學(xué)組成和分子結(jié)構(gòu)上的差異。有研究報(bào)道顯示，共聚焦顯微拉曼光譜可通過從分子結(jié)構(gòu)區(qū)分不同的腫瘤病理組織類型，例如HSU等[30]通過共聚拉曼光譜與PCA-LAD結(jié)合區(qū)分胃腺癌的病理分型，如乳頭狀腺癌(PAC)、管狀腺癌(TAC)、黏液腺癌(MAC)和印戒細(xì)胞癌(SRC)。此外，整個(gè)監(jiān)測(cè)過程只需幾分鐘且無需免疫組化等組織預(yù)處理。LI等[31]將共聚焦顯微拉曼光譜與GA-LDA算法結(jié)合，通過792～805,867～880,996～1 009,1 086～1 099,1 288～1 304,1 663～1 670,和1 742～1 752 cm-1區(qū)域的光譜差異成功區(qū)分NPC組織和正常組織，特異度達(dá)100.0%。SUN等[32]使用共聚焦顯微拉曼光譜對(duì)NPC組織涂片進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析可對(duì)NPC和正常組織涂片進(jìn)行區(qū)分，診斷靈敏度和特異度分別為87.2%和85.7%。以上研究表明，共聚焦顯微拉曼光譜能夠快速準(zhǔn)確地探測(cè)組織化學(xué)組成和分子結(jié)構(gòu)，從而區(qū)分腫瘤組織與正常組織，這一優(yōu)點(diǎn)也有助于手術(shù)時(shí)區(qū)分良惡性組織的邊界以確保腫瘤組織的完整切除[33]。

2.4共聚焦顯微拉曼光譜在NPC治療藥物監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用 由于共聚焦顯微拉曼光譜能對(duì)單個(gè)活細(xì)胞的化學(xué)成分進(jìn)行特異度分析且無需標(biāo)記，不受熒光干擾，因此其不僅能對(duì)細(xì)胞內(nèi)存在的藥物進(jìn)行檢測(cè)，也能監(jiān)測(cè)藥物的療效，這將促進(jìn)體內(nèi)外細(xì)胞與藥物相互作用的相關(guān)研究[34]。近年來共聚焦顯微拉曼光譜已經(jīng)被廣泛用于研究化療藥物對(duì)真核細(xì)胞的影響[35]。HUANG等[36]通過共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)采集不同濃度順鉑處理后的NPC細(xì)胞指紋圖譜時(shí)發(fā)現(xiàn)，順鉑對(duì)NPC細(xì)胞基因組有降解作用。順鉑對(duì)癌細(xì)胞的作用機(jī)制也在肺腺癌中得到驗(yàn)證。NAWAZ等[37]使用共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)測(cè)定肺腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的反應(yīng)，并研究了96 h內(nèi)不同藥物濃度的療效。許元基[38]用共聚焦拉曼光譜對(duì)NPCCNE-2細(xì)胞系進(jìn)行了尼妥珠單抗增敏研究，發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增高，尼妥珠單抗的放射增敏作用越強(qiáng)。此外，有研究表明共聚焦顯微拉曼光譜可以檢測(cè)化療藥物在亞細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和積累途徑，并預(yù)先識(shí)別耐藥腫瘤細(xì)胞，從而優(yōu)化化療療效[39]。以上研究結(jié)果表明，共聚焦顯微拉曼光譜能夠定量分析體內(nèi)外細(xì)胞藥物的濃度，監(jiān)測(cè)細(xì)胞活力，在分子水平觀測(cè)抗腫瘤藥物對(duì)NPC細(xì)胞的療效，為臨床NPC化療藥物的個(gè)性化選擇提供參考。

3 共聚焦顯微拉曼光譜在NPC轉(zhuǎn)移代謝監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用前景

共聚焦顯微拉曼光譜不僅在腫瘤診斷治療方面具有很大的優(yōu)勢(shì)，它在腫瘤轉(zhuǎn)移監(jiān)測(cè)方面同樣具有很大的前景。共聚焦拉曼光譜能夠在單個(gè)細(xì)胞水平上成像細(xì)胞結(jié)構(gòu)并且能定量特定生物分子以此監(jiān)測(cè)腫瘤的代謝過程。有文獻(xiàn)報(bào)道[23]通過共聚焦顯微拉曼光譜對(duì)兩性細(xì)胞膜穿透肽(CPPs)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Tp)在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞系SK-Mel-2中的浸潤和生理效應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞硬度的增加是由Tp誘導(dǎo)細(xì)胞骨架改變引起的[23]。CHRISTINA等[40]利用共聚焦顯微拉曼光譜識(shí)別并量化了乳腺癌細(xì)胞中脂肪組織介導(dǎo)的脂滴形成和生化改變。PACIA等[41]研究表明，利用拉曼三維共聚焦成像結(jié)合AFM內(nèi)皮表面成像分析血管壁各層，證明腫瘤轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)的全身內(nèi)皮功能障礙導(dǎo)致主動(dòng)脈內(nèi)皮發(fā)生明顯的化學(xué)變化，如蛋白質(zhì)含量顯著增加(18.0%)和脂質(zhì)含量輕微降低(4.0%)，這些變化僅限于內(nèi)皮細(xì)胞，不發(fā)生在血管壁深層[41]。此外共聚焦顯微拉曼光譜還可以通過監(jiān)測(cè)循環(huán)腫瘤干細(xì)胞(CCSC)、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)等在單細(xì)胞水平上快速獲取細(xì)胞分子表型的重要信息，有助于揭示細(xì)胞和組織的代謝病理等機(jī)制與過程，預(yù)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[42]。以上研究表明共聚焦顯微拉曼光譜可用于識(shí)別生物樣本中的代謝變化，從而為包括NPC在內(nèi)的相關(guān)腫瘤的發(fā)病機(jī)制研究提供參考。

4 結(jié) 論

在過去的幾年中，大量的研究工作表明共聚焦顯微拉曼光譜作為一種新技術(shù)得到了越來越多的認(rèn)可。與傳統(tǒng)拉曼光譜技術(shù)相比，共聚焦拉曼光譜有信號(hào)強(qiáng)、靈敏度高、測(cè)量時(shí)間短、所需樣本量小等優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)在細(xì)胞、組織、體液等不同類型的樣本中的檢測(cè)及對(duì)體內(nèi)外藥物濃度及作用機(jī)制進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，因此在腫瘤的早期診斷及預(yù)后研究中具有良好的發(fā)展前景[43]。NPC由于其發(fā)病隱匿，臨床癥狀及影像學(xué)表現(xiàn)往往滯后于疾病進(jìn)展，早期診斷十分困難。共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)無需外源染色和標(biāo)記，僅通過檢測(cè)單個(gè)NPC活細(xì)胞內(nèi)化學(xué)成分結(jié)構(gòu)差異指紋圖譜即可獲得分子特異性信息，達(dá)到快速、無創(chuàng)的診斷。該技術(shù)不但可以輔助手術(shù)中癌組織的切除，而且能在免受熒光和抗體污染的情況下分選NPC細(xì)胞。此外，共聚焦拉曼光譜能對(duì)NPC藥物治療進(jìn)行監(jiān)測(cè)，且在NPC轉(zhuǎn)移代謝中有很大的應(yīng)用前景。

共聚焦顯微拉曼光譜雖然在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用，但在臨床應(yīng)用方面缺少相關(guān)經(jīng)驗(yàn)。共聚焦顯微拉曼光譜雖能對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行三維成像，但一次僅能檢測(cè)一個(gè)細(xì)胞，難以對(duì)大量的細(xì)胞進(jìn)行高通量檢測(cè)，故需結(jié)合其他已建立的顯微成像技術(shù)，如熒光和電子顯微鏡等。共聚焦顯微拉曼光譜與其他技術(shù)相結(jié)合能夠更廣泛地了解相關(guān)標(biāo)本特征，評(píng)估待測(cè)組織或細(xì)胞系的細(xì)胞分布，結(jié)合統(tǒng)計(jì)方法，設(shè)定獲得有意義結(jié)果所需測(cè)量的檢測(cè)限。正常組織和癌癥組織的拉曼光譜模式有時(shí)可能非常相似，因此，可開發(fā)自動(dòng)化的樣品捕獲和有效的診斷算法來解釋微小的光譜變化，此外，確立可靠的細(xì)胞組成分布的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)也是共聚焦拉曼技術(shù)普及應(yīng)用的重要前提。最后，共聚焦拉曼光譜用于體內(nèi)診斷時(shí)，也需要考慮組織熱損傷問題。綜上所述，隨著共聚焦拉曼光譜技術(shù)的不斷完善和互補(bǔ)技術(shù)的建立，它在NPC早期診斷、預(yù)后、治療轉(zhuǎn)移監(jiān)測(cè)等臨床診療領(lǐng)域?qū)?huì)有光明的前景。