異嗜性抗體對(duì)孕婦血清甲狀腺功能免疫測(cè)定值干擾的分析與處理*

錢 丹，劉 暢，楊聚豪，田 野，張立群

陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400037

免疫法是血清甲狀腺功能指標(biāo)測(cè)定的常用臨床檢驗(yàn)方法，其檢驗(yàn)結(jié)果受個(gè)體年齡、性別、藥物、電離輻射、基礎(chǔ)疾病以及標(biāo)本采集與保存等多種因素影響[1-3]，這些因素通常容易被識(shí)別，而機(jī)體內(nèi)的異嗜性抗體(HA)在一般人群中的檢測(cè)率不高，即使在高危人群中(寵物密切接觸者)中的檢出率也僅為30.00%～40.00%，同時(shí)其中極少數(shù)(0.05%～0.50%)會(huì)干擾免疫檢測(cè)結(jié)果[4-5]，因此HA對(duì)免疫法檢測(cè)結(jié)果的干擾現(xiàn)象往往不易被覺察，且未受臨床足夠的重視。HA是由已知或未知抗原物質(zhì)刺激人體產(chǎn)生的一類具有足夠滴度、能與多個(gè)物種的免疫球蛋白發(fā)生較弱結(jié)合的多重特異度的免疫球蛋白，寵物接觸是一般人群體內(nèi)HA產(chǎn)生的最常見原因[6-7]。目前HA干擾甲狀腺功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果已有少量個(gè)案報(bào)道[8-10]，隨寵物飼養(yǎng)家庭增加，尤其育齡期女性和孕婦等密切接觸者增加，HA干擾該類人群的甲狀腺功能指標(biāo)免疫法檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)而導(dǎo)致誤診和額外治療，應(yīng)引起臨床的高度重視。本文就1例飼養(yǎng)寵物的年輕孕期患者的甲狀腺功能指標(biāo)檢持續(xù)異常原因的分析及處理進(jìn)行報(bào)道，以期提醒同行注意寵物家庭來源的對(duì)象，若甲狀腺功能指標(biāo)異常(尤其與臨床表現(xiàn)不符合時(shí))，應(yīng)注意排除HA對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響以避免誤診。

1 資料與方法

1.1一般資料 患者，女，18歲，漢族，2016年4月16日因初孕到本院就診，甲狀腺功能多項(xiàng)血清免疫檢測(cè)指標(biāo)異常增高，包括游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)、三碘甲狀腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)、高靈敏血清促甲狀腺激素(TSH)、甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAB)、甲狀腺球蛋白(TG)、甲狀腺球蛋白抗體(TGAB)。2016年4月至2021年3月，患者于本院先后7次血清甲狀腺功能檢測(cè)結(jié)果均顯示FT3、FT4、TSH、TT3、TT4、TPO、TG、TGAB指標(biāo)均異常增高，其中TSH最高檢測(cè)值41.9 mIU/L(參考范圍：0.35～4.94 mIU/L)，最低檢測(cè)值為10.66 mIU/L。

但患者一直無明確心悸、怕熱、多汗、乏力、體質(zhì)量增加或減少等相應(yīng)臨床表現(xiàn)； MRI平掃見垂體體積增大，高度約為10 mm，中份略向上突，垂體內(nèi)(Se51 m5)似見結(jié)節(jié)灶(大小約7 mm)，垂體柄無偏移，鞍底骨質(zhì)未見異常改變，其他未見特殊；超聲顯示甲狀腺體回聲增粗不均質(zhì)，甲狀腺右側(cè)葉混合回聲結(jié)節(jié)，甲狀腺雙側(cè)葉不均質(zhì)回聲結(jié)節(jié)，考慮腺病并囊性變；右側(cè)頸部淋巴結(jié)稍大，左側(cè)頸部淋巴結(jié)可見。臨床醫(yī)生考慮中樞性甲狀腺亢進(jìn)及TSH瘤可能，但筆者考慮到臨床癥狀與檢測(cè)指標(biāo)存在明顯不符合，認(rèn)為存在某種干擾導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的假性升高可能，需要進(jìn)一步逐步排除干擾以確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果。

1.2儀器與試劑 甲狀腺功能檢測(cè)采用ARCHITECT i2000SR全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(美國(guó)雅培公司)及配套試劑(簡(jiǎn)稱i2000SR檢測(cè)系統(tǒng))；血清免疫球蛋白及類風(fēng)濕因子采用(美國(guó)貝克曼公司)及配套試劑(簡(jiǎn)稱IMMANGE800檢測(cè)系統(tǒng))；室內(nèi)質(zhì)控品購于雅培配套質(zhì)控，甲狀腺功能及免疫球蛋白質(zhì)控品購于伯樂。每次臨床樣本的檢測(cè)均在室內(nèi)質(zhì)控在控的情況下完成。

1.3干擾排除方法

1.3.1排除類風(fēng)濕因子(RF)、血清免疫球蛋白大分子蛋白質(zhì)對(duì)甲狀腺激素檢測(cè)結(jié)果的干擾 以1例健康者血清標(biāo)本作為對(duì)照標(biāo)本，與病例血清標(biāo)本同時(shí)采用貝克曼IMMANGE800進(jìn)行免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、RF、抗鏈球菌溶血素O(ASO)、補(bǔ)體C3(C3)、補(bǔ)體C4(C4)測(cè)定，若檢測(cè)值均在正常參考范圍內(nèi)，提示可排除這些常見大分子對(duì)甲狀腺激素檢測(cè)結(jié)果的影響。

1.3.2排除遺傳因素 經(jīng)患者知情同意，對(duì)其母親采集靜脈血通過ARCHITECT i2000SR全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定做FT3、FT4、TSH 的檢測(cè)。若檢測(cè)值均在正常參考范圍內(nèi)，提示可排除遺傳因素導(dǎo)致患者甲狀腺功能指標(biāo)異常。

1.3.3聚乙二醇(PEG)沉降法 PEG6000沉淀法：25 g PEG6000+60 mL蒸餾水/去離子水混勻15 min，然后加蒸餾水/去離子水到100 mL，配制成25%PEG 溶液儲(chǔ)存在20～25 ℃，穩(wěn)定期7 d，取180 μL標(biāo)本+180 μL 25% PEG6000溶液(1∶1)，旋轉(zhuǎn)振蕩器混勻10 s，3 000 r/min離心5 min，取上清液待測(cè)。將病例標(biāo)本與對(duì)照標(biāo)本做PEG處理，檢測(cè)甲狀腺激素水平，并計(jì)算PEG沉降回收率。PEG沉淀回收率(%)=PEG沉淀處理后的檢測(cè)結(jié)果×2/處理前檢測(cè)結(jié)果×100%。

1.3.4血清樣本倍比稀釋 對(duì)患者血清標(biāo)本進(jìn)行2、4和8倍比例稀釋，并采用雅培i2000SR上采用試劑配套稀釋液進(jìn)行檢測(cè)。偏差(%)=(稀釋后檢測(cè)值-原檢測(cè)值)/原檢測(cè)值 ×100%。

1.3.5特異性阻斷劑消除法 將本例患者的血清樣本500 μL與等量的異嗜性抗體阻斷劑(HBR)(美國(guó)Scantibodies Laboratory公司)均勻混合，以加入等量i2000SR檢測(cè)系統(tǒng)配套稀釋液的血清樣本作為對(duì)照，室溫作用1 h。隨后采用i2000SR檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)血清(TSH、FT4、FT3、TT3、TT4、TPO、TGAB)濃度，實(shí)際檢測(cè)結(jié)果=檢測(cè)值×2。

2 結(jié) 果

2.1排除RF、免疫球蛋白等大分子的干擾 健康對(duì)照和本例病例標(biāo)本中的RF、血清免疫球蛋白等大分子檢測(cè)結(jié)果均在參考范圍內(nèi)，提示可排除該類大分子物質(zhì)對(duì)甲狀腺功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果的干擾，見表1。

表1 患者與健康對(duì)照的類風(fēng)濕因子及免疫球蛋白測(cè)定結(jié)果

2.2排除遺傳因素 患者母親血清的FT3、FT4和TSH的檢測(cè)值均在正常值參考范圍內(nèi)，提示可排除遺傳因素導(dǎo)致患者甲狀腺功能指標(biāo)的異常升高。

2.3PEG沉淀 分別檢測(cè)病例標(biāo)本PEG處理前后的甲狀腺激素水平，計(jì)算PEG沉降回收率。其中TSH、TGAB、TPO回收率均<40.00%，說明存在其他大分子蛋白干擾。處理后TT3和TT4等下降不明顯，回收率均>60.00%,說明沒有大分子蛋白干擾。PEG稀釋處理對(duì)FT3、FT4檢測(cè)結(jié)果有影響，此回收率不做考慮。結(jié)果提示檢測(cè)結(jié)果受到大分子蛋白一定程度的干擾，見表2。

表2 患者PEG處理前后的甲狀腺功能指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果

2.4倍比稀釋 血清甲狀腺功能檢測(cè)，采用 i2000SR檢測(cè)系統(tǒng)配套的稀釋液同時(shí)對(duì)樣本進(jìn)行梯度稀釋。檢測(cè)結(jié)果不成線性，見表3。倍比稀釋對(duì)FT3、FT4檢測(cè)結(jié)果有影響，此處不做考慮?；厥章试节吔?00.00%，說明內(nèi)源性抗體干擾越小。結(jié)果提示可能存在內(nèi)源性抗體干擾。

表3 患者組血清樣本倍比稀釋實(shí)測(cè)值與檢測(cè)值的比較

2.5特異性阻斷劑消除 血清經(jīng)HBR阻斷處理后，甲狀腺功能各指標(biāo)檢測(cè)值與原值的比較，均在參考范圍以內(nèi)，見表4，結(jié)果提示異嗜性抗體對(duì)甲狀腺功能各指標(biāo)檢測(cè)值存在干擾。

表4 本例患者HBR處理后與處理前的檢測(cè)對(duì)比

3 討 論

甲狀腺功能指標(biāo)的免疫標(biāo)記法測(cè)定結(jié)果受到多種因素的影響[1-3]，準(zhǔn)確識(shí)別并排除相關(guān)因素的干擾以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)于支持臨床準(zhǔn)確診斷、指導(dǎo)治療和評(píng)估療效等有著重要作用。本例患者為1例年輕妊娠期婦女，甲狀腺功能多項(xiàng)指標(biāo)異常升高，結(jié)合臨床影像學(xué)結(jié)果，極易誤診為中樞性甲亢及TSH瘤，并據(jù)此進(jìn)行后續(xù)持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的周期治療，可能對(duì)患者身心及其胎兒造成較為嚴(yán)重的影響。筆者結(jié)合患者寵物飼養(yǎng)史和臨床表現(xiàn)(無明確心悸、怕熱、多汗、乏力、體質(zhì)量增加或減少等)，初步判斷可能存在相關(guān)因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，并通過PEG沉淀、倍比稀釋和使用阻斷試劑等多種方法對(duì)影響因素進(jìn)行分析及排除，最后確認(rèn)為HA干擾了甲狀腺功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果，避免了誤診及其帶來的后續(xù)危害，臨床檢驗(yàn)人員及醫(yī)生應(yīng)對(duì)類似患者保持警惕。

人類HA來源途徑廣泛，如進(jìn)食被污染的食品(包括消毒不好的鮮奶)、輸血、接種疫苗(動(dòng)物血清組織來源)和感染、過敏和血液透析等[11-12]，其中直接接觸寵物或?qū)嶒?yàn)室動(dòng)物小鼠是人體內(nèi)HA產(chǎn)生最常見的原因[13]；通常3%～15%的健康人群中可檢出HA[14]，長(zhǎng)期飼養(yǎng)動(dòng)物以及接受單克隆抗體或單克隆抗體耦聯(lián)的生物制劑治療者體內(nèi)檢測(cè)率可達(dá)80%[15]。 HA的相對(duì)分子質(zhì)量約為160×103，具有相對(duì)穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，能與多種動(dòng)物抗體結(jié)合。由于目前臨床常用的免疫試劑的抗體大多數(shù)來自于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，當(dāng)含有HA的患者在進(jìn)行血清免疫檢測(cè)時(shí)，HA通過與免疫試劑抗體的 Fc區(qū)表位或者F(ab′)2區(qū)域的結(jié)合以干擾免疫檢測(cè)結(jié)果，在夾心免疫測(cè)定法和競(jìng)爭(zhēng)免疫測(cè)定法中最易發(fā)生。之前已有來源于貓或綿羊抗血清的HA導(dǎo)致T3、T4、FT3和FT4假性升高的報(bào)道。

當(dāng)懷疑甲狀腺激素功能指標(biāo)的檢查結(jié)果受到干擾時(shí)，首先應(yīng)結(jié)合專業(yè)知識(shí)和患者病史、臨床表現(xiàn)等，確認(rèn)是否存在干擾，排除年齡/性別、合并疾病(包括遺傳)、藥物治療以及來自標(biāo)本采集與保存等常見原因，進(jìn)一步采用健康對(duì)照、PEG沉降法和倍比例稀釋法，排除患者體內(nèi)RF、IgG和IgA等常見大分子蛋白質(zhì)對(duì)甲狀腺激素檢測(cè)結(jié)果的干擾，并確認(rèn)存在內(nèi)源性物質(zhì)干擾，最后采用異嗜性抗體阻斷劑方法確認(rèn)HA對(duì)患者甲狀腺功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果的干擾，為臨床醫(yī)生提供準(zhǔn)確的參考數(shù)據(jù)。

本例患者甲狀腺功能指標(biāo)升高與臨床表現(xiàn)不符，研究者初步判斷檢測(cè)結(jié)果可能受到干擾；進(jìn)一步詢問得知，患者家中長(zhǎng)期養(yǎng)犬，在懷孕后停止飼養(yǎng)，研究者初步認(rèn)為檢測(cè)結(jié)果有可能受到寵物來源HA的干擾。本例患者體內(nèi)RF、IgG和IgA等常見大分子均在正常值范圍，提示該類大分子未對(duì)甲狀腺激素檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響；患者標(biāo)本經(jīng)過PEG處理后TT3、TT4下降不明顯，而TSH、TGAB和TPO的PEG沉降回收率均<40.00%，進(jìn)一步提示存在其他大分子蛋白的干擾；當(dāng)存在干擾時(shí)，干擾物的濃度、異質(zhì)性和位阻效應(yīng)將導(dǎo)致倍比稀釋的檢查結(jié)果呈現(xiàn)非線性改變，當(dāng)懷疑血液保內(nèi)源性抗體干擾免疫檢測(cè)時(shí)，采用連續(xù)倍比稀釋法后檢測(cè)結(jié)果呈非線性下降或升高，提示存在內(nèi)源性抗體的干擾。本例患者樣本進(jìn)行倍比稀釋后，其檢測(cè)結(jié)果與稀釋倍數(shù)不成線性，回收率均<60.00%，再次表明標(biāo)本中存在內(nèi)源性干擾物質(zhì)；研究者進(jìn)一步異嗜性抗體阻斷劑處理患者血清后，甲狀腺功能相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果均位于參考范圍，證實(shí)了由于異嗜性抗體的干擾導(dǎo)致了檢測(cè)結(jié)果假陽性的猜測(cè)。

盡管HA阻斷劑是明確是否存在HA干擾的最為客觀的證據(jù)，但因其價(jià)格昂貴，難以在臨床上推廣應(yīng)用。因此，發(fā)現(xiàn)患者的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)不一致時(shí)，檢驗(yàn)醫(yī)師應(yīng)積極排除和確認(rèn)常見的干擾因素，同時(shí)臨床醫(yī)師應(yīng)與檢驗(yàn)室加強(qiáng)溝通，避免假陽(陰)性結(jié)果導(dǎo)致不良后果。本例患者排除和確認(rèn)干擾因素的思路值得參考。