胎盤自噬與子癇前期

馮曉玲 姜天悅 張 楊*

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院(哈爾濱，150040)；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)

PE是指妊娠20周后出現(xiàn)高血壓伴蛋白尿的綜合征，有早發(fā)(34周前分娩)和晚發(fā)(34周后分娩)兩個(gè)亞型[1]，是孕產(chǎn)婦日后罹患心血管疾病、糖尿病、腎臟疾病、高血壓等慢性疾病的重要危險(xiǎn)因素[2]。目前學(xué)者認(rèn)為PE的核心病理機(jī)制是胎盤形成不良，血液灌注不足，使炎性因子和細(xì)胞碎片釋放入血，母體出現(xiàn)全身炎性反應(yīng)和內(nèi)皮功能障礙[3]?？梢?jiàn)胎盤功能在PE病理機(jī)制中占有核心地位。胎盤發(fā)育涉及滋養(yǎng)細(xì)胞分化、胎兒血管發(fā)育等關(guān)鍵事件[4]。胎盤內(nèi)部穩(wěn)態(tài)受到細(xì)胞自噬機(jī)制的調(diào)控。自噬活性失調(diào)會(huì)導(dǎo)致PE等妊娠并發(fā)癥[5]。本文關(guān)注細(xì)胞自噬在保持胎盤穩(wěn)態(tài)中的作用，側(cè)重胎盤自噬與滋養(yǎng)細(xì)胞功能、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、蛋白質(zhì)平衡、炎癥反應(yīng)等細(xì)胞活動(dòng)的關(guān)系，綜述胎盤自噬在PE發(fā)病機(jī)制中作用的研究進(jìn)展。

1 自噬概述

1.1 自噬定義、過(guò)程與功能

自噬是真核細(xì)胞高度保守的生物學(xué)行為，是在精細(xì)的調(diào)節(jié)機(jī)制下由溶酶體消化降解老化受損的生物大分子、細(xì)胞器及入侵病原體的過(guò)程。根據(jù)底物進(jìn)入溶酶體的途徑。自噬可分為：微自噬、分子伴侶介導(dǎo)自噬和巨自噬。其中巨自噬主要降解長(zhǎng)壽蛋白，是細(xì)胞清除受損細(xì)胞器和其他大分子的主要途徑[6]。本文中“自噬”指“巨自噬”。自噬是連續(xù)動(dòng)態(tài)的代謝過(guò)程，人類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物(ULK1)從雷帕霉素復(fù)合物1(mTORC1)中分離，被激活后介導(dǎo)吞噬體形成，之后在III型磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)復(fù)合物驅(qū)動(dòng)下，“C”狀囊泡包裹需要降解的細(xì)胞內(nèi)容物，在多種自噬相關(guān)基因(Atg)Atg3，Atg5，Atg7，Atg16L1和微管相關(guān)蛋白1A/1B輕鏈3B(MAP1LC3B/LC3)的調(diào)節(jié)下，吞噬體延伸形成封閉的雙膜結(jié)構(gòu)自噬體，自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，使體內(nèi)大分子物質(zhì)進(jìn)入溶酶體降解為小分子供再利用。自噬可被各種刺激激活，通過(guò)吞噬線粒體、炎性體和微生物成分，保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[7]。

1.2 自噬參與胎盤形成

研究顯示，自噬是保證胎盤正常生理功能的細(xì)胞活動(dòng)[8]。在生理性低氧的孕早期胎盤中觀察到自噬增強(qiáng)，以支持滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和血管重塑，保護(hù)滋養(yǎng)細(xì)胞免受缺氧或營(yíng)養(yǎng)缺乏引起的細(xì)胞死亡[9]。為確認(rèn)自噬在胎盤發(fā)育中的作用，研究人員利用慢病毒系統(tǒng)在滋養(yǎng)層各層刪除Atg7，發(fā)現(xiàn)胎盤迷路層中自噬的主要標(biāo)志物MAP1LC3B/LC3蛋白受到抑制，而自噬正常小鼠胎盤各層Atg7表達(dá)無(wú)差異。模型鼠胎盤海綿滋養(yǎng)層體量更小，胎盤總重量明顯低于對(duì)照組。通過(guò)計(jì)量蛻膜胎兒一側(cè)細(xì)胞角蛋白8(Keratin-8)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量，評(píng)估滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲蛻膜的能力，發(fā)現(xiàn)遷移入母體蛻膜的滋養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，同時(shí)螺旋動(dòng)脈管壁厚度與管徑面積之比顯著增大，提示滋養(yǎng)層浸潤(rùn)淺，血管重塑不足[10]。不僅如此，Daniel等[11]研究表明，受到嚴(yán)格調(diào)控的自噬參與了胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的合胞體化過(guò)程，負(fù)責(zé)降解細(xì)胞融合過(guò)程產(chǎn)生的多余細(xì)胞器，在應(yīng)激條件下提供額外能量促進(jìn)細(xì)胞存活?？梢?jiàn)，在生理妊娠中，自噬參與了胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞2個(gè)獨(dú)特的分化途徑-浸潤(rùn)分化與合胞體化。另外，Gao等研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖氧化酶過(guò)度激活自噬下調(diào)了妊娠早期絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(EVT)的侵襲能力[12]。因此，滋養(yǎng)細(xì)胞中適當(dāng)?shù)淖允烧{(diào)節(jié)對(duì)正常胎盤形成不可或缺。

2 胎盤自噬在PE病理中的作用

人類胎盤對(duì)多種環(huán)境應(yīng)激源敏感[13]。自噬作為維持胎盤內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要細(xì)胞機(jī)制，參與其能量調(diào)節(jié)、應(yīng)激防護(hù)、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化、增殖和死亡等細(xì)胞功能，保持組織動(dòng)態(tài)平衡。自噬失調(diào)會(huì)破壞胎盤穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致PE等并發(fā)癥[14]。

2.1 胎盤自噬與滋養(yǎng)細(xì)胞功能

目前，對(duì)子癇前期病因的研究，主要著眼于滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)過(guò)淺和螺旋動(dòng)脈重塑不良這一解剖學(xué)基礎(chǔ)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬是促進(jìn)EVT侵襲、與母胎界面內(nèi)皮細(xì)胞交叉對(duì)話的重要機(jī)制。低氧條件下，EVT在體內(nèi)(8%氧分壓)和體外(2%氧分壓)均可誘導(dǎo)自噬。自噬缺陷EVT與野生型相比，侵襲和血管重構(gòu)能力明顯減弱，提示胎盤自噬與滋養(yǎng)細(xì)胞功能密切相關(guān)[10]。低氧誘導(dǎo)因子(HIF)可激活氧傳遞、血管生成、細(xì)胞增殖、分化和代謝等基因，其表達(dá)波動(dòng)體現(xiàn)正常或病理?xiàng)l件下細(xì)胞(器官)的低氧應(yīng)激反應(yīng)[15]。巳知HIF也是EVT分化的主要調(diào)控因子，在正常胎盤發(fā)育中，生理性低氧使HIF1α表達(dá)增加，通過(guò)PI3K通路激活自噬，成為滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的能量來(lái)源，從而維持細(xì)胞內(nèi)部穩(wěn)態(tài)[15]。

為揭示自噬在滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)中的作用，研究人員采用氯化鈷(CoCl2)誘導(dǎo)HIF1α過(guò)表達(dá)，對(duì)自噬缺陷HTR8-ATG4BC74A細(xì)胞和對(duì)照HTR8- mStrawberry細(xì)胞進(jìn)行體外低氧細(xì)胞培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)侵襲測(cè)試、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)密度測(cè)量和三磷酸腺苷(ATP)濃度生物發(fā)光測(cè)量，發(fā)現(xiàn)HTR8-ATG4BC74A細(xì)胞MMP9水平明顯減低，發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)量顯著減少；細(xì)胞內(nèi)ATP表達(dá)水平降低，嘌呤受體P2X配體門控離子通道7 (P2RX7)補(bǔ)償性增加。而對(duì)照組的侵襲細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有變化，細(xì)胞內(nèi)ATP水平保持穩(wěn)定。補(bǔ)充ATP之后可恢復(fù)HTR8-ATG4BC74A細(xì)胞損失的侵襲能力，說(shuō)明自噬對(duì)EVT正常侵襲十分重要[15]。然而，在PE病例中，胎盤嚴(yán)重或持續(xù)缺氧加速了EVT中HIF1α的過(guò)表達(dá)，而PE母體血清和胎盤中高表達(dá)的可溶性內(nèi)皮因子(sENG)卻抑制了EVT自噬，使其侵襲能力因細(xì)胞能量缺乏受到限制[9]。與正常胎盤相比，重度PE胎盤的ATP水平顯著降低[16]，也印證了這一點(diǎn)。這些結(jié)果表明，自噬損傷使HIF1α介導(dǎo)的細(xì)胞能量消耗無(wú)法及時(shí)補(bǔ)償，影響了能量平衡，引發(fā)滋養(yǎng)細(xì)胞功能受損，且由“淺侵”引起的胎盤缺氧會(huì)進(jìn)一步增加sENG的生成，導(dǎo)致血管重塑不足[9]。

2.2 胎盤自噬與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

在真核細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)在蛋白質(zhì)合成、結(jié)構(gòu)修飾，膜蛋白正確折疊中發(fā)揮核心作用。生理水平的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)，可適度激活自噬，利于保持胎盤穩(wěn)態(tài)。幾種主要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白均與自噬存在互動(dòng)：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)跨膜蛋白需肌醇酶1α(IRE1α)，是未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)的調(diào)節(jié)因子，可通過(guò)c-Jun氨基末端激酶(JNK)途徑激活自噬，降低ER的蛋白負(fù)荷，增加細(xì)胞蛋白質(zhì)折疊和降解能力。激活轉(zhuǎn)錄因子(ATF)4和ATF6β通過(guò)降低胎盤生長(zhǎng)因子(PlGF)mRNA的表達(dá)，負(fù)調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞PlGF的分泌，以響應(yīng)ERS[17]。胎盤特異性Atg7敲除小鼠出現(xiàn)PlGF mRNA降低，提示自噬和ER通過(guò)PlGF的表達(dá)影響胎盤生長(zhǎng)發(fā)育[18]。另外，ER應(yīng)激精細(xì)調(diào)節(jié)自噬活性，可能是滋養(yǎng)細(xì)胞合胞體化過(guò)程中促進(jìn)細(xì)胞存活的適應(yīng)性機(jī)制[11]。

然而，胎盤過(guò)度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激成為導(dǎo)致PE病理生理的關(guān)鍵因素[17]。為了解其分子機(jī)制，研究人員分別使用布雷菲爾德菌素A(Brefeldin A)和衣霉素(Tunicamycin)誘導(dǎo)HchEpC1b滋養(yǎng)細(xì)胞過(guò)度ERS，與用DMSO處理的對(duì)照細(xì)胞相比，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中LC3-II(自噬體標(biāo)記)和p62(自噬底物)表達(dá)增加，確認(rèn)ERS可誘導(dǎo)EVT自噬。在用巴佛洛酶素A1(Baf，自噬體和溶酶體融合抑制劑)對(duì)3組細(xì)胞共處理后檢測(cè)自噬通量。對(duì)照組細(xì)胞中，Baf處理使LC3-II顯著增加；而2組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞在處理前后沒(méi)有顯著差異，并未改變ERS誘導(dǎo)的p62積累，提示過(guò)度ERS抑制了自噬通量。已知LC3-II和溶酶體相關(guān)膜蛋白(LAMP)1共定位可用于標(biāo)記自噬溶酶體，雙重免疫染色分析顯示，ERS實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中只有極少數(shù)LC3-II點(diǎn)與LAMP1共定位。過(guò)度ERS增加了自噬體的數(shù)量，但未增加自噬溶酶體的數(shù)量。后續(xù)實(shí)驗(yàn)表明，ERS的HchEpC1b細(xì)胞中LAMP1和LAMP2的水平顯著下調(diào)。PE血清樣本中LAMP1表達(dá)水平低于正常妊娠組。這些結(jié)果證明，過(guò)度的ERS可導(dǎo)致溶酶體生物合成減少，溶酶體與自噬體的融合受到抑制，降低了滋養(yǎng)細(xì)胞的自噬通量。由此，自噬抑制會(huì)降低滋養(yǎng)細(xì)胞中未折疊或長(zhǎng)壽蛋白的消化率，潛在增強(qiáng)ERS，減少PIGF生成。可見(jiàn)，過(guò)度ERS和受損的自噬相互作用，導(dǎo)致PE的病理生理過(guò)程出現(xiàn)惡性循環(huán)[19]。

2.3 胎盤自噬與蛋白質(zhì)平衡

細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)需通過(guò)平衡蛋白質(zhì)的合成與降解來(lái)維持。自噬可以發(fā)揮本體降解作用，防止因蛋白質(zhì)過(guò)度聚集導(dǎo)致的細(xì)胞功能失調(diào)[20]。PE患者的血清和尿液樣本中均檢測(cè)到蛋白質(zhì)聚集物，包括淀粉樣蛋白-β或甲狀腺素運(yùn)載蛋白[21]，并且在自噬缺陷細(xì)胞中以更高的頻率沉積。這種積累也在妊娠小鼠中誘發(fā)了類似PE表型[22]。

在探尋胎盤自噬上游分子機(jī)制的過(guò)程中，人們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子EB(TFEB)作為自噬溶酶體生成的主要調(diào)節(jié)因子，在自噬降解毒性聚集蛋白的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[23]。缺氧條件下，人原代滋養(yǎng)細(xì)胞和永生化EVT的TFEB表達(dá)降低，核轉(zhuǎn)位不良。由TFEB負(fù)責(zé)調(diào)控的溶酶體蛋白LAMP1、LAMP2和組織蛋白酶(CTSD)顯著減少，溶酶體生成超微結(jié)構(gòu)受損。同時(shí)，低氧暴露的滋養(yǎng)細(xì)胞顯示出PPP3/鈣調(diào)磷酸酶活性下降和XPO1/CRM1(輸出蛋白1)增加[24]。實(shí)驗(yàn)證明，自噬缺陷人類EVT顯示TFEB核轉(zhuǎn)位較差，溶酶體蛋白表達(dá)和功能降低，MTORC1活性增加。而且PE患者血清可誘導(dǎo)EVT的上述特征和蛋白聚集。不僅如此，滋養(yǎng)細(xì)胞特異性ATG7基因敲除小鼠表現(xiàn)出TFEB表達(dá)減少，胎盤中蛋白質(zhì)聚集物沉積增加。可見(jiàn)，細(xì)胞內(nèi)抑制劑MTORC1和XPO1/CRM1(輸出蛋白1)的激活，下調(diào)了TFEB的核轉(zhuǎn)位，減少了溶酶體生成，降低了自噬通量[25]。因此，自噬水平降低，蛋白質(zhì)合成與降解的失衡參與了PE的病理生理過(guò)程。毒性聚集蛋白在胎盤中積累可致胎盤發(fā)育不良，并引發(fā)抗血管生成因子、細(xì)胞外囊泡和警報(bào)素對(duì)維持妊娠的不良影響[22]。

2.4 胎盤自噬與炎性反應(yīng)

細(xì)胞自噬是先天免疫和獲得性免疫的重要調(diào)節(jié)因子，在生理妊娠中自噬參與母體免疫系統(tǒng)的組成和功能，不僅有助于捕獲和清除病原體，還影響免疫細(xì)胞亞群的平衡?？乖岢始?xì)胞中微生物組分通過(guò)自噬途徑降解，可使微生物抗原與細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合體2分子相結(jié)合，由T細(xì)胞誘導(dǎo)抗原獲得性免疫。自噬還可捕獲激活的炎癥小體，阻止其細(xì)胞焦亡促炎通路中IL-1β和IL-18的產(chǎn)生[26]。

炎性反應(yīng)是PE公認(rèn)的病因之一，且PE胎盤常伴有無(wú)菌炎癥。研究發(fā)現(xiàn)PE與滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生促炎特征的細(xì)胞焦亡有關(guān)[27]。在早發(fā)PE分娩的胎盤組織和正常人類滋養(yǎng)細(xì)胞(暴露于低氧、ER應(yīng)激源)，以及PE患者血清中，均顯示細(xì)胞焦亡相關(guān)炎癥標(biāo)記物半胱天冬酶-1(Caspase-1)，Gasdermin D蛋白(GSDMD)，白介素1β(IL-1β)和IL-18表達(dá)增加，表明早發(fā)PE胎盤發(fā)生細(xì)胞焦亡。實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)度UPR可通過(guò)硫氧化還原蛋白相互作用蛋白(TXNIP)促進(jìn)炎癥小體(NLRP3)促炎途徑的發(fā)展，導(dǎo)致無(wú)菌性炎癥和PE早期發(fā)病[28]。與此同時(shí)，過(guò)度激活的UPR也減少了自噬能量，降低了其抑制細(xì)胞焦亡的作用，使無(wú)菌炎性反應(yīng)增加，形成局部細(xì)胞毒性微環(huán)境。Cheng等[29]將自噬缺陷型滋養(yǎng)細(xì)胞暴露于早發(fā)PE或胎齡匹配的妊娠女性血清中，早發(fā)PE組血清顯著增加了GSDMD豐度，而且其定位與在PE胎盤組織中觀察到的信號(hào)相吻合。ASC和caspase-1免疫染色響應(yīng)早發(fā)PE血清作用顯著上調(diào)且共定位，表明滋養(yǎng)細(xì)胞自噬抑制誘導(dǎo)了GSDMD膜轉(zhuǎn)位和caspase-1活化。Mehto等[30]的研究解釋了自噬介導(dǎo)的另一種潛在防焦亡機(jī)制，免疫相關(guān)GTP酶M(GTPase M)通過(guò)與p62結(jié)合，可誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體選擇性降解。使用非類因醇激素-褪黑激素處理，可通過(guò)激活自噬和BECN1蛋白的產(chǎn)生，在缺氧條件下協(xié)助保護(hù)PE胎盤發(fā)育[31]。可見(jiàn)，胎盤自噬可以保護(hù)滋養(yǎng)細(xì)胞在應(yīng)激條件下免于焦亡，在促炎與抗炎的平衡中發(fā)揮作用。

3 結(jié)論與展望

子癇前期的病理生理受到氧化應(yīng)激、免疫反應(yīng)等多種機(jī)制失衡的影響，自噬功能失調(diào)導(dǎo)致的胎盤穩(wěn)態(tài)破壞無(wú)疑是其中重要的組成部分。然而，目前圍繞影響PE病理的胎盤自噬狀態(tài)還存在一些分歧。有部分研究認(rèn)為孕早期胎盤自噬過(guò)度激活，損害了滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和血管重塑[32]。與NP相比，PE胎盤中BECN1上調(diào)，細(xì)胞周期素E下調(diào)，自噬活性增加，但自噬相關(guān)蛋白p62水平更高[12]。因此，仍需深入開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步闡明PE的病理。同時(shí)，有專家提示，自噬在細(xì)胞生命活動(dòng)中發(fā)揮動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)作用，而且涉及多環(huán)節(jié)，由多分子參與，甚至在不同類型細(xì)胞中，反應(yīng)各不相同，應(yīng)謹(jǐn)慎評(píng)估其狀態(tài)。例如，PE胎盤和血清中自噬體數(shù)量(顯示為L(zhǎng)C3斑點(diǎn))增加常被作為自噬激活的標(biāo)志，但卻無(wú)法解釋自噬相關(guān)蛋白P62的積累。實(shí)際上，當(dāng)自噬通路的下游過(guò)程受阻時(shí)，自噬溶酶體調(diào)節(jié)異常，致使LC3降解失敗，同樣顯示自噬體增加。因此，評(píng)估自噬在子癇前期病理生理學(xué)中的作用，應(yīng)科學(xué)確定量化自噬的方法，并驗(yàn)證使用特定自噬反應(yīng)生物學(xué)標(biāo)記的有效性，以減少誤判[5]。未來(lái)，繼續(xù)探尋影響胎盤自噬的上游分子，明確相關(guān)因素在PE病理中產(chǎn)生影響的時(shí)間量程，有利于更準(zhǔn)確地開(kāi)展預(yù)防、診斷和臨床干預(yù)。