葡萄胎免疫學研究進展

朱國華，杜美蓉，鹿欣

葡萄胎（hydatidiform mole）屬于妊娠滋養(yǎng)細胞疾?。╣estational trophoblastic disease，GTD），是與妊娠相關(guān)、來自胎盤滋養(yǎng)細胞異常增生的良性疾病。葡萄胎包括完全性葡萄胎（complete hydatidiform mole，CHM）、部分性葡萄胎（partial hydatidiform mole，PHM）兩種類別。另外，約5%PHM 及20%CHM 可進展為妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤（gestational trophoblastic neoplasia，GTN），約占GTN 來源的50%～60%[1-2]。正常妊娠時，妊娠滋養(yǎng)細胞分泌細胞因子招募、誘導免疫細胞富集于母胎局部[3]，同時滋養(yǎng)細胞分泌人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）誘導卵巢黃體酮持續(xù)分泌，繼而母體全身免疫狀態(tài)隨之發(fā)生改變。據(jù)報道妊娠后孕酮促進外周血自然殺傷（natural killer，NK）細胞表面T 細胞免疫球蛋白黏蛋白3（T-cell immunoglobulin mucin-3，Tim-3）表達升高，而Tim-3 是抑制性信號分子之一[4]。葡萄胎的病理進程類似于正常妊娠，但其以父系印跡基因主導的胚外滋養(yǎng)細胞過度增生為主要特點。目前，葡萄胎患者免疫系統(tǒng)如何改變尚無明確統(tǒng)一的觀點。

1 葡萄胎的分類及其依據(jù)

如前所述，葡萄胎分為CHM 和PHM。CHM 是更常見的類型，其妊娠物中不具有胎兒成分，而在PHM 的妊娠物中則存在變形的、不能存活的胎兒成分。就遺傳物質(zhì)組成而言，CHM 通常是二倍體，PHM則通常為三倍體[5]。在CHM 中，90%核型為46,XX，10%核型為46,XY。即一個去核卵被兩個精子或一個單倍體精子受精后再復制，因此CHM 只有父系DNA被表達[6]。在PHM 中，90%核型為三倍體，為69,XXX或69,XXY。即精子使單倍體卵重復受精或兩個精子使單倍體卵受精時，則出現(xiàn)這種核型。在PHM 中，父系和母系DNA 都被表達[5]。

因此，不論是CHM 或是PHM，過度表達的父源印跡基因是導致滋養(yǎng)細胞過度增生的遺傳學基礎。而母系染色體有或無的表達，則決定其呈現(xiàn)為CHM或PHM 的表型。就CHM 而言，對母體來說，妊娠物中全部遺傳物質(zhì)均屬于非己來源，其幾乎等同于同種異體移植物。但CHM 卻相較于PHM 更不易被機體清除，且在清宮術(shù)后，更易進展為GTN[7]，其中的免疫學機制值得探究。

2 正常妊娠中滋養(yǎng)細胞免疫學行為

正常妊娠時，單倍體精子與單倍體卵子結(jié)合發(fā)生受精反應，形成二倍體受精卵。接著其在輸卵管逐漸發(fā)育分化，移行至子宮，著床時已被覆滋養(yǎng)細胞，由滋養(yǎng)細胞作為胚胎與子宮內(nèi)膜接觸、交流的屏障[8]。正常妊娠的胎兒成分因其遺傳物質(zhì)組成常被類比為半同種異體移植物，但其滋養(yǎng)細胞并不表達Ⅰ類主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）分子人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA），而表達非經(jīng)典Ⅰ類MHC 分子，如HLA-E、HLA-G，且主要表達在絨毛外滋養(yǎng)細胞（extravillous trophoblast cells，EVT）中[9]。已有研究顯示，滋養(yǎng)細胞具有誘導母體面免疫細胞聚集、分化及耗竭的獨特免疫學功能[3]。滋養(yǎng)細胞通過趨化因子CXC 模體配體12（CX-C motif ligand 12，CXCL12）/CXC 模體受體4（CX-C motif receptor 4，CXCR4）軸優(yōu)先募集CD25+NK細胞，并訓導為蛻膜自然殺傷（decidual natural killer，dNK）細胞[10]；滋養(yǎng)細胞還可分泌趨化因子CXCL16誘導M2 型巨噬細胞極化，進一步減少白細胞介素15（interleukin-15，IL-15）分泌，使NK 細胞失活[11]。

在妊娠早期，dNK 細胞比例可高達70%，巨噬細胞比例約為20%，T 細胞比例約為10%～20%，其余免疫細胞如樹突狀細胞、B 細胞相對較少[12]。這些免疫細胞在胎盤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮不同功能。盡管同為滋養(yǎng)細胞，葡萄胎滋養(yǎng)細胞卻不能引起相似的免疫學改變。

3 葡萄胎免疫學進展

早期葡萄胎的免疫學研究集中在描述其滋養(yǎng)細胞的免疫原性及其誘導免疫耐受能力，比如發(fā)現(xiàn)葡萄胎滋養(yǎng)細胞表達經(jīng)典MHC 分子，組織囊泡液具有抑制免疫細胞增殖的能力[13-15]。進入21 世紀之后，相關(guān)研究集中于母胎界面的免疫細胞分布及表型，重點關(guān)注葡萄胎所引起的母體變化，探討母體免疫環(huán)境改變與葡萄胎預后的關(guān)系。

3.1 葡萄胎患者母胎界面具有復雜的免疫學調(diào)控網(wǎng)絡免疫細胞是包括NK 細胞、T 細胞和巨噬細胞等多種具有不同生物學功能的髓系來源細胞的總稱。不同功能的免疫細胞表型、數(shù)量及比例代表著局部不同的免疫反應。免疫組織化學技術(shù)是回顧性研究葡萄胎患者母胎界面免疫細胞組成的重要手段。21 世紀初，研究人員利用該技術(shù)發(fā)現(xiàn)CHM 患者蛻膜免疫細胞總數(shù)明顯高于正常妊娠女性[16-18]。細胞毒性T 細胞（cytotoxic T cell，Tc 細胞）增多，CD56+NK 細胞比例相對減少是葡萄胎母胎界面免疫的重要特征[17]。CHM 蛻膜植入部位中顆粒酶B 陽性的Tc 細胞和NK 細胞浸潤明顯高于正常妊娠蛻膜，且Tc 細胞浸潤與調(diào)節(jié)性T 細胞（regulatory T cell，Treg 細胞）浸潤呈正相關(guān)[18]。盡管研究揭示了葡萄胎能夠誘導母體面具有細胞毒性的免疫細胞聚集，但仍不能解釋約25%的葡萄胎進展為GTN 的原因。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，在術(shù)后需要化療的CHM 中，其巨噬細胞表面受體結(jié)合癌抗原1、HLA-G 及含V-set 結(jié)構(gòu)域T 細胞激活抑制因子1（V-set domain containing T cell activation inhibitor 1，VTCN1）的表達明顯更高[18]。HLA-G 是非經(jīng)典Ⅰ類MHC 分子，也被認為是免疫檢查點分子[19]，主要表達在正常妊娠時的EVT、葡萄胎及滋養(yǎng)細胞腫瘤的中間滋養(yǎng)細胞[9,20-21]。正常妊娠時，EVT 表達的HLA-G 可通過免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄本2（Ig-like transcript 2，ILT2）、ILT4 和殺傷性免疫球蛋白樣受體2DL4（killer immunoglobulin-like receptor 2DL4，KIR2DL4）調(diào)節(jié)免疫細胞[22]。其中KIR2DL4 的表達可明顯抑制dNK細胞對HLA-G+細胞殺傷毒性，復發(fā)性流產(chǎn)患者中可觀察到的KIR2DL4 表達下調(diào)，進一步強調(diào)HLA-G/KIR2DL4 通路可明顯抑制dNK 細胞毒性以逃避免疫殺傷。此外，表達HLA-G 的細胞外囊泡還可以在局部誘導形成免疫耐受微環(huán)境[23]。提示HLA-G 在抑制母體免疫細胞毒性、避免免疫殺傷及維持胎兒正常發(fā)育中發(fā)揮重要作用。然而在滋養(yǎng)細胞腫瘤中的研究發(fā)現(xiàn)，HLA-G 在絨毛膜癌單藥化療耐藥組的表達明顯下調(diào)，并且可作為預測絨毛膜癌單藥化療耐藥的生物標志物[24]。盡管不能排除表達HLA-G 的細胞具有更高的化療敏感性的可能，其也提示絨毛膜癌的HLA-G 表達具有某些特性。HLA-G 在葡萄胎滋養(yǎng)細胞中也有表達，但尚無其是否參與葡萄胎誘導母體免疫耐受的文獻報道。

相對于妊娠早期的正常絨毛，CHM 胎盤滋養(yǎng)細胞表現(xiàn)出明顯的免疫相關(guān)通路失調(diào)。基于高維全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的結(jié)果表明，CHM 胎盤滋養(yǎng)細胞具有較低胎盤特異性基因表達水平以及相對較高的免疫相關(guān)基因表達豐度，MHC Ⅰ類分子及Ⅱ類分子顯著上調(diào)；富集分析顯示約有17 條免疫相關(guān)通路失調(diào)，其中細胞因子-細胞因子受體相互作用通路最為顯著[25]。胎盤特異性基因表達的缺失揭示CHM 滋養(yǎng)細胞存在分化缺陷，免疫相關(guān)通路的失調(diào)表明CHM 滋養(yǎng)細胞在母胎界面局部發(fā)生了復雜的免疫調(diào)控事件，但葡萄胎滋養(yǎng)細胞是被動響應機體免疫反應而作出的受調(diào)控反應，還是主動調(diào)控部分細胞因子表達以調(diào)控母體免疫細胞還需要體外實驗驗證。

多重免疫組織化學技術(shù)是近年來新發(fā)展的可基于石蠟標本的多重免疫熒光染色的實驗技術(shù)[26]。Hoeijmakers 等[27]通過該技術(shù)對CHM 的蛻膜組織石蠟樣本實現(xiàn)涵蓋CD45RO、CD3、CD8、Foxp3、CD56及泛角蛋白等多分子共同染色，以分析CHM 蛻膜免疫細胞組成及其與預后的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)自發(fā)緩解的CHM 患者CD3+CD56+蛻膜自然殺傷T（natural killer T，NKT）細胞浸潤明顯高于疾病進展組，且浸潤程度低與良好預后有關(guān)。NKT 細胞與機體免疫的關(guān)系具體取決于其具體亞型：Ⅰ型NKT 細胞可促進抗腫瘤免疫，而Ⅱ型NKT 細胞抑制抗腫瘤免疫[28]。由于樣本及技術(shù)限制，該研究未進一步探究其具體亞型。CD56+NK 細胞仍然是CHM 免疫細胞中的主要亞群，但在進展為GTN 的分組中CD56+NK 細胞相對較少，雖然差異并不顯著，但這提示葡萄胎CD56+NK細胞可能具有細胞毒性，并且弱化的NK細胞殺傷效能可能與較差的CHM 清宮后預后有關(guān)。研究認為，正常妊娠的母胎界面dNK 細胞通?？煞譃? 種亞群（CD56brightCD16－、CD56superbrightCD16－和CD56dimCD16+）[29]，因此，盡管CD56+NK 細胞是dNK 細胞的主要亞群，僅憑借CD56 標志能否代表所有的NK 細胞需要進一步討論?？傊?，葡萄胎母胎界面微環(huán)境與正常妊娠的母胎界面微環(huán)境呈現(xiàn)差異，葡萄胎滋養(yǎng)細胞可能不具備誘導低毒性的CD56superbrightdNK 的能力。葡萄胎滋養(yǎng)細胞與母胎界面免疫細胞的相互作用在GTD的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。較強的免疫原性及誘導母胎界面產(chǎn)生足夠強度的免疫反應可能是葡萄胎的良好預后因素。

3.2 葡萄胎患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）可能呈現(xiàn)耗竭表型葡萄胎作為一種特殊的妊娠狀態(tài)，其外周血免疫微環(huán)境也可能繼發(fā)形成獨特的免疫環(huán)境。基于Nod樣受體家族含pyrin 結(jié)構(gòu)域蛋白7（Nod-like receptor family pyrin domain-containing protein 7，NLRP7）突變導致的家族性復發(fā)葡萄胎（familial recurrent hydatidiform mole，F(xiàn)RM）的研究表明，來自具有多個NLRP7 非同義變異（non-synonymous variations，NSVs）表型的FRM患者的PBMC在脂多糖（lipopolysacchatide，LPS）刺激后表現(xiàn)出較低的IL-1β、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）分泌能力[30]。進一步實驗證實，NLRP7 的NSVs 可影響IL-1β 的加工及運輸。研究表明，NLRP7 既可作為炎癥小體信號的負調(diào)節(jié)劑，也可作為巨噬細胞內(nèi)炎癥小體感知信號的傳感器，沉默NLRP7 可抑制IL-1β 及IL-18 的釋放[31]。IL-1β 被認為是急性炎癥反應以及激活抗腫瘤反應的細胞因子[32]。IL-1β 的低響應可能表明免疫抑制狀態(tài)與葡萄胎的發(fā)生、發(fā)展存在某種關(guān)聯(lián)，但由于NLRP7 在卵母細胞減數(shù)分裂過程參與細胞骨架形成，其可能與異常的卵子形成有關(guān)[33]，因此基于該研究結(jié)論尚不足以證實免疫抑制在葡萄胎發(fā)生、發(fā)展中的關(guān)鍵作用。2014 年潘丹等[34]研究指出，相對于正常妊娠，來自葡萄胎的PBMC 培養(yǎng)上清液在LPS 刺激前就有較高的IL-1β 水平，而在LPS 刺激后，其分泌量的變化并無顯著差異，但在正常妊娠組IL-1β分泌顯著增多。表明非FRM 的滋養(yǎng)細胞具有較高的免疫原性，導致PBMC 處于持續(xù)的炎癥刺激狀態(tài)，表現(xiàn)為IL-1β 的相對高水平，而儲備能力不足，對LPS刺激產(chǎn)生較弱的IL-1β 分泌反應，但也不排除葡萄胎患者存在其他機制引起PBMC 免疫應答減弱的可能。持續(xù)的免疫原刺激耗竭免疫細胞與基因突變導致的低效率的免疫細胞響應可能是葡萄胎持續(xù)進展的原因之一。

趨化因子對免疫細胞的遷移行為具有調(diào)控作用，CXCL10 是趨化因子家族重要成員，可通過CXCR3誘導向1 型輔助性T 細胞（T helper cell 1，Th1 細胞）方向極化激活免疫細胞。有研究報道CHM 患者的血清CXCL10 水平明顯高于PHM 患者及正常妊娠早期女性，預后分析顯示CXCL10 與葡萄胎惡變相關(guān)，因此研究認為CXCL10 可能是導致葡萄胎惡變的危險因素[35]。然而該研究中80 例葡萄胎患者中至少有25 例具有臨床高危因素，惡變率為16.25%，CXCL10是否是獨立預后因素未予說明，CXCL10 作為預后指標是否優(yōu)于hCG 及其他臨床高危因素也未進行進一步論述，因此其結(jié)果的臨床意義需要更多的臨床數(shù)據(jù)予以支持?；谔ケP樣本的免疫組織化學結(jié)果表明，葡萄胎惡變組CXCL10 的表達陽性率和免疫反應強度高于未惡變組，且在滋養(yǎng)細胞腫瘤中表達更高[36]。說明具有惡變傾向的葡萄胎滋養(yǎng)細胞具有較高的CXCL10 分泌能力，以誘導趨化PBMC 向母胎界面局部富集。這或許可以解釋上述葡萄胎患者母胎界面局部免疫細胞浸潤數(shù)量高于正常妊娠女性，也與上述來源于葡萄胎患者的PBMC 在LPS 誘導后具有較低的IL-1β 響應率相互印證。但仍需解釋的問題是：為何高表達趨化因子、具備招募更多活化淋巴細胞能力的葡萄胎患者具有更高的惡變率？具備惡變潛能的葡萄胎滋養(yǎng)細胞是否具有類似腫瘤的機制，誘導促炎型免疫細胞向抑炎型免疫細胞分化，形成免疫耐受的微環(huán)境，促進其進展為GTN？以及如何鑒別這種具有惡變潛能的葡萄胎滋養(yǎng)細胞？

4 結(jié)語與展望

葡萄胎滋養(yǎng)細胞具備趨化外周免疫細胞在母胎界面局部富集能力，并且誘導免疫細胞向具備細胞毒性的表型分化，如Tc 及具有殺傷能力的NK 細胞，但具體機制仍不清晰，需進一步研究。有惡變潛能的葡萄胎滋養(yǎng)細胞誘導的免疫反應和可自發(fā)緩解的滋養(yǎng)細胞誘導的免疫反應有何不同，如何鑒別這種惡變潛能的葡萄胎滋養(yǎng)細胞仍是需要解決的問題，也是進行臨床決策的重要問題。目前，由于診斷技術(shù)進步，診斷窗口提前，典型清宮術(shù)前診斷葡萄胎標本越來越少、原代葡萄胎細胞分離技術(shù)有限等困難限制了其基礎研究的發(fā)展。多重免疫組織化學以及空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的出現(xiàn)，給CHM、PHM 的免疫學研究提供了新的可能，有望利用石蠟標本回顧性解答上述問題。解決這些問題，不僅有助于對葡萄胎免疫學發(fā)生、發(fā)展的理解，也有助于理解GTN 的形成機制，指導臨床決策（清宮術(shù)后是否需要預防性化療），還有助于尋找滋養(yǎng)細胞腫瘤耐藥相關(guān)的免疫學機制。