LOXL2 及Snail 蛋白表達(dá)水平與膽管癌患者術(shù)后生存率的關(guān)系

鄒 垚，王梓瑜，李 皎，李興欣，申亞瓊，徐 敬，金 焰

（昆明理工大學(xué)附屬昆華醫(yī)院/云南省第一人民醫(yī)院肝膽外科，云南 昆明 650032）

膽管細(xì)胞癌（cholangiocarcinoma，CCA）是一種具有高度惡性的難治性肝膽系統(tǒng)腫瘤，起源于膽管上皮細(xì)胞，約占所有原發(fā)性肝膽腫瘤的15%[1]。盡管在大多數(shù)國(guó)家膽管癌被認(rèn)為是一種發(fā)病率 ＜6/100 000 的相對(duì)冷僻的疾病，但在全球范圍內(nèi)其發(fā)病率及死亡率不斷上升[2-4]。CCA 主要生物學(xué)特征是在癌癥早期就有淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的侵襲性行為，盡管通過近幾十年的研究，對(duì)于CCA 的認(rèn)識(shí)、診斷及治療有了很大程度提升，但在過去的10 a 中，患者的預(yù)后并沒有實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展，5 a 生存率（7%～20%）及術(shù)后復(fù)發(fā)率依然不盡人意[5-9]。近些年，在上皮起源的癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中，觀察到上皮細(xì)胞間連接、黏附的分解和細(xì)胞角蛋白絲的丟失，同時(shí)伴隨著遷移功能的獲得并產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)成分，轉(zhuǎn)化成間質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞就可以離開其在上皮中的原始定位，從而向其它區(qū)域擴(kuò)散，這一過程被命名為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn) 化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）[10]。其中Snail 作為EMT 過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在體內(nèi)通過抑制E-鈣黏蛋白表達(dá)誘導(dǎo)上皮細(xì)胞發(fā)生EMT 的表型變化，使腫瘤細(xì)胞在進(jìn)展期間獲得侵襲性和轉(zhuǎn)移性[11]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，LOXL2 參與了Snail 的基因表達(dá)及其所誘導(dǎo)的EMT 的調(diào)控，因此LOXL2 是Snail 的上游調(diào)節(jié)因子。

本實(shí)驗(yàn)研究旨在了解LOXL2 及Snail 在膽管癌中的表達(dá)關(guān)系以及臨床意義，分析LOXL2 及Snail 與臨床病理特征的關(guān)系，初步探討LOXL2及Snail 在膽管癌的研究意義，為進(jìn)一步在臨床前及臨床研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集云南省第一人民醫(yī)院于2014 年1 月至2021 年4 月肝膽外科收治并行根治性手術(shù)切除的膽管癌患者的病理組織標(biāo)本31 例。31 例患者年齡46～76 歲，平均年齡60.1 歲，其中男性16 例，女性15 例。同時(shí)收集記錄臨床病理參數(shù)，包括腫瘤部位、腫瘤大?。ㄒ阅[瘤最大直徑表示）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度、患者性別、年齡、術(shù)后生存時(shí)間。31 例患者在行根治性手術(shù)切除前均未接受放療、化療或其他輔助治療。所有病例均經(jīng)云南省第一人民醫(yī)院病理科確診為膽管癌。以癌旁正常膽管組織作對(duì)照。隨訪日期到2022 年3月1 日結(jié)束。

1.2 免疫組化

病理組織采用10%甲醛固定、脫水透明后石蠟包埋、制作3 μm 厚組織切片，67 ℃烤片40 min，二甲苯溶液浸泡2 次各15 min，依次不同濃度乙醇（100%、100%、95%、85%、75%）各2 min，抗原修復(fù)采用檸檬酸鈉緩沖液（福州邁新生物，0.01 M pH6.0）高火加熱3 min，后自然冷卻至室溫，3%過氧化氫（福州邁新生物）避光孵育15 min 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，5%牛血清蛋白（德國(guó)Biofroxx 公司）封閉非特異性抗原位點(diǎn)60 min，孵育一抗：?jiǎn)慰寺∈罂筍nail+SLUG 抗體（1∶500，英國(guó)Abcam 公司，貨號(hào)ab224731）4 ℃過夜；孵育一抗：多克隆兔抗LOXL2 抗體（1∶100，英國(guó)Abcam 公司，貨號(hào)ab96233）4 ℃過夜，孵育二抗（抗小鼠/兔IgG 聚合物，福州邁新生物，貨號(hào)KIT-9921）18 min，顯微鏡下控制DAB 顯色（北京中杉金橋公司），蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，溫水浸泡反藍(lán)，脫水，二甲苯透明，中性樹膠（福州邁新生物）封片，正置熒光顯微鏡（德國(guó)ZEISS公司）下鏡檢采集數(shù)據(jù)。

1.3 免疫組化結(jié)果判定

評(píng)分方法參考既往研究[12-14]所述，對(duì)染色結(jié)果使用Image pro plus 軟件進(jìn)行判定，綜合2 種蛋白的染色面積和強(qiáng)度分別進(jìn)行評(píng)分，隨后得分相加得到2 種蛋白此次免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。染色強(qiáng)度評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：棕褐色2 分，棕黃色1 分，淡黃色或無染色0 分。染色面積評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：棕色面積 ＜ 50%得分為0 分，棕色面積 ＞ 50%得分為1 分。染色結(jié)果分別交給2 名病理科醫(yī)師評(píng)估，染色面積和染色強(qiáng)度分值相加，總分≥2 分判定為高表達(dá)，＜ 2 分為低表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，2 種蛋白表達(dá)強(qiáng)度相關(guān)性分析采用Spearman 法，LOXL2、Snail 蛋白表達(dá)強(qiáng)度與臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析使用Fisher 確切概率法。繪制Kaplan-Meier 總體生存曲線，Log-rank 檢驗(yàn)分析總體生存率差異，采用Cox 回歸模型進(jìn)行多因素生存分析。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膽管癌病理組織中LOXL2 和Snail 表達(dá)及相關(guān)性

LOXL2 表達(dá)集中在胞質(zhì)和核周，以胞質(zhì)為主，見圖1；Snail 表達(dá)集中在胞質(zhì)及胞核，癌旁正常膽管組織未見2 種蛋白表達(dá)，見圖1。LOXL2 高表達(dá)有16 例，低表達(dá)有15 例；Snail 高表達(dá)有13 例，低表達(dá)有18 例。其中10 例樣本同時(shí)存在2 種蛋白的高表達(dá)，12 例同時(shí)存在2 種蛋白的低表達(dá)。LOXL2 蛋白的表達(dá)與Snail 蛋白的表達(dá)存在著一定的正相關(guān)關(guān)系（r=0.430，P=0.016），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見表1。

圖1 膽管癌病理組織和癌旁正常膽管組織LOXL2 和Snail 表達(dá)（×200）Fig. 1 Expression of LOXL2 and Snail in pathological tissues and adjacent normal bile duct tissues of cholangiocarcinoma（×200）

表1 膽管癌病理組織中LOXL2 和Snail 表達(dá)相關(guān)性（n）Tab.1 Correlation between LOXL2 and Snail expression in pathological tissues of cholangiocarcinoma（n）

2.2 膽管癌病理組織中LOXL2 和Snail 表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Snail 高表達(dá)與膽管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在密切聯(lián)系（P=0.025），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），與其余臨床病理參數(shù)均無顯著相關(guān)性（P＞ 0.05）；LOXL2 表達(dá)與腫瘤大小、腫瘤位置、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、患者性別、年齡等臨床病理特征均無顯著相關(guān)性（P＞ 0.05），見表2。

2.3 31 例膽管癌患者生存分析

LOXL2 與Snail 免疫組化染色結(jié)果與生存結(jié)果分析表明，Snail 高表達(dá)的病例術(shù)后總體生存率較低（LogRankP=0.032），見圖2，同時(shí)LOXL2 高表達(dá)的病例術(shù)后總體生存率較低（LogRankP=0.046），見圖3。單因素總體生存率分析結(jié)果表明Snail 高表達(dá)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與膽管癌患者更差的預(yù)后相關(guān)（P＜ 0.05）；多因素Cox 回歸模型分析結(jié)果表明淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能是影響膽管癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素（P=0.017），見表3。

表3 膽管癌患者總生存率預(yù)后因素的單因素和多因素分析Tab.3 Univariate and multivariate analysis of prognostic factors for overall survival of patients with cholangiocarcinoma

圖2 膽管癌患者術(shù)后總生存期與Snail 表達(dá)的關(guān)系Fig. 2 Association between postoperative overall survival and Snail expression in patients with cholangiocarcinoma

圖3 膽管癌患者術(shù)后總生存期與LOXL2 表達(dá)的關(guān)系Fig. 3 Association between postoperative overall survival and LOXL2 expression in patients with cholangiocarcinoma

3 討論

由于膽管癌早期就表現(xiàn)出侵襲性行為，導(dǎo)致手術(shù)相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)較大、根治性手術(shù)切除率低、術(shù)后復(fù)發(fā)率高以及較低的術(shù)后總生存率。因此了解膽管癌中導(dǎo)致侵襲性行為的相關(guān)機(jī)制是目前研究的一個(gè)重點(diǎn)，從而為預(yù)防癌癥進(jìn)展和復(fù)發(fā)提供一些新的治療靶點(diǎn)，進(jìn)而改善膽管癌的治療效果。

2003 年，G Akiri 等[15]首次證明LOXL2 可以促進(jìn)腫瘤纖維化并增強(qiáng)乳腺癌的侵襲性。自那時(shí)以來，LOXL2 因其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中復(fù)雜且關(guān)鍵作用而引起了越來越多的關(guān)注。在許多癌癥中觀察到LOXL2 異常高表達(dá)。以往的研究發(fā)現(xiàn)，在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌[16]、乳腺癌[17]、肺癌[18]、結(jié)腸癌[19]、胃癌[20]、宮頸癌[21]、肝癌[22]和食管癌[23]中，LOXL2 高表達(dá)與生存時(shí)間縮短和預(yù)后不良有關(guān)。LOXL2 促進(jìn)腫瘤的增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致癌癥的惡性進(jìn)展[24-25]。LOXL2 可以通過多種信號(hào)通路促進(jìn)EMT 并參與腫瘤微環(huán)境的組成，是腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的“幫兇”，其高表達(dá)是許多癌癥患者的風(fēng)險(xiǎn)因素[26]。同時(shí)，高應(yīng)鴻等[27]研究發(fā)現(xiàn)在48 例膽管癌患者中，LOXL2 的高表達(dá)與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。D Bergeat 等[28]通過對(duì)80例肝內(nèi)膽管癌患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，LOXL2 的高表達(dá)與不良預(yù)后有關(guān)，LOXL2 高表達(dá)是影響肝內(nèi)膽管癌患者總生存期和無病生存期的獨(dú)立預(yù)后因素，并提出LOXL2 有希望成為肝內(nèi)膽管癌新的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。在本研究中，LOXL2 在膽管癌病理組織中呈現(xiàn)異常表達(dá)，然而其高表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)無明顯相關(guān)性，這可能與本研究的樣本容量小、免疫組織化學(xué)染色半定量分析結(jié)果準(zhǔn)確性的差異有關(guān)，希望未來能有多中心、更大樣本量以及更精細(xì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行更深入的研究。對(duì)膽管癌患者術(shù)后生存的隨訪分析顯示，LOXL2高表達(dá)患者的術(shù)后生存率相對(duì)較低，提示在一定程度上LOXL2 的表達(dá)可以預(yù)測(cè)膽管癌患者的預(yù)后。

Snail 最早在黑腹果蠅中被發(fā)現(xiàn)[29]，并被證明對(duì)中胚層的形成至關(guān)重要[30]。EMT 可由不同的信號(hào)分子觸發(fā)，如WNTs、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、表皮生 長(zhǎng)因子（epidermal growth factor）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、轉(zhuǎn)化生 長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、Notch、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF），并且這些信號(hào)分子都已被證實(shí)可以在不同的細(xì)胞環(huán)境中誘導(dǎo)Snail，從而使得腫瘤細(xì)胞獲得侵襲性，向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。過往研究表明，Snail 在正常膽管細(xì)胞中不表達(dá)，但在膽管癌細(xì)胞中存在過表達(dá)情況，且其過表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)?？祻?qiáng)等[14]對(duì)55 例肝內(nèi)膽管癌患者病理組織標(biāo)本進(jìn)行Snail 蛋白免疫組織化學(xué)染色研究，結(jié)果提示肝內(nèi)膽管癌患者病理組織標(biāo)本Snail 高表達(dá)與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后有關(guān)，并認(rèn)為Snail可以預(yù)測(cè)肝內(nèi)膽管癌患者預(yù)后，同時(shí)也有望成為生物治療的作用靶點(diǎn)；X Y Huang 等[13]對(duì)140 例肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌病理組織標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)EMT 指標(biāo)的研究中，也得到了類似結(jié)果。在本次對(duì)31 例膽管癌病理組織樣本研究中，發(fā)現(xiàn)膽管癌患者病理組織中Snail 呈現(xiàn)異常表達(dá)，并且其表達(dá)與臨床病理參數(shù)相關(guān)。結(jié)果表明，Snail 的高表達(dá)與侵襲轉(zhuǎn)移性指標(biāo)有關(guān)。對(duì)膽管癌患者術(shù)后生存的隨訪分析顯示，Snail 高表達(dá)的膽管癌患者的術(shù)后生存率相對(duì)較低。對(duì)多種變量進(jìn)行膽管癌患者總生存期預(yù)后因素單因素和多因素分析的結(jié)果表明，Snail 和侵襲性指標(biāo)可作為預(yù)測(cè)膽管癌患者預(yù)后的指標(biāo)。結(jié)合以往的研究，猜測(cè)膽管癌中Snail 高表達(dá)可能會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EMT 過程的進(jìn)展，進(jìn)而提高侵襲和轉(zhuǎn)移能力。因此，筆者預(yù)測(cè)，對(duì)于Snail 高表達(dá)的膽管癌患者，可以對(duì)Snail 進(jìn)行靶向沉默，從而減緩患者腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，這為膽管癌靶向藥物的研究和開發(fā)提供了一個(gè)潛在位點(diǎn)。同時(shí)，對(duì)于膽管癌患者，術(shù)后對(duì)其病理組織常規(guī)行免疫組織化學(xué)染色，了解Snail 表達(dá)情況，可對(duì)膽管癌患預(yù)后進(jìn)行一定評(píng)估并為早期干預(yù)提供有力數(shù)據(jù)，對(duì)延長(zhǎng)術(shù)后總體生存時(shí)間具有重要意義。

Snail 在EMT 過程中主要抑制E-鈣黏蛋白的合成，其可通過Snail 和Gfi（SNAG）結(jié)構(gòu)域招募mSin3A 協(xié)同加壓復(fù)合物和組蛋白去乙?；福℉DAC），以抑制E-鈣粘蛋白的表達(dá)[31]，在這一過程中H Peinado 等[32]發(fā)現(xiàn)LOXL2 可以與SNAG結(jié)構(gòu)域相互作用與Snail 協(xié)同抑制E-鈣黏蛋白，同時(shí)Snail 介導(dǎo)的EMT 依賴于Snail 蛋白結(jié)構(gòu)中完整K98 和K137 兩個(gè)賴氨酸殘基，LOXL2 與K98和K137 殘基相互作用對(duì)維持Snail 穩(wěn)定性有著至關(guān)重要的作用。此外Snail 的穩(wěn)定性還受到GSK3β 依賴性磷酸化和泛素化的精細(xì)控制，GSK3β 以兩種不同的基序磷酸化Snail，誘導(dǎo)其核輸出并與β-Trcp 結(jié)合，從而導(dǎo)致Snail 降解，而LOXL2 可以抵消這一過程，從而使Snail 趨于穩(wěn)定[33]。在喉癌和乳腺癌中，觀察到LOXL2 的過度表達(dá)促進(jìn)其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的積累，并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中與熱休克蛋白5（HSPA5）相互作用，從而激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的IRE1-XBP1 信號(hào)通路。LOXL2依賴的IRE1-XBP1 信號(hào)通路進(jìn)而可以激活誘導(dǎo)幾種EMT 轉(zhuǎn)錄因子如Snail 和ZEB 的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而有利于這些腫瘤的高侵襲性和轉(zhuǎn)移[34]。在肝癌中發(fā)現(xiàn)LOXL2 能夠促進(jìn)腫瘤通過Snail-FBP1軸上調(diào)HIF-1α/VEGF 信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌的微血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移[35]。可以看出LOXL2 通過細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外多種通路調(diào)節(jié)Snail 蛋白的表達(dá)，然而在膽管癌中關(guān)于LOXL2 與Snail 表達(dá)相關(guān)性尚不明確，因此收集云南省第一人民醫(yī)院膽管癌患者病理組織標(biāo)本并對(duì)病理組織中LOXL2 及Snail 2 種蛋白表達(dá)進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。在31 例膽管癌病理組織標(biāo)本中，研究結(jié)果表明，在膽管癌病理組織樣本中LOXL2 與Snail 存在共表達(dá)情況，并且LOXL2 的表達(dá)與Snail 的表達(dá)存在一定的正相關(guān)關(guān)系，同時(shí)2 種蛋白表達(dá)對(duì)患者術(shù)后總生存期的影響具有一定的相似性，因此推測(cè)二者在膽管癌中具有一定的協(xié)同性，此結(jié)果與以往在惡性腫瘤中的研究具有一定的相似性。但對(duì)于膽管癌中LOXL2 與Snail 表達(dá)調(diào)節(jié)涉及的具體方式及信號(hào)通路有待通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探討和研究。

綜上所述，LOXL2 和Snail 在膽管癌中呈現(xiàn)過表達(dá)，Snail 過表達(dá)與膽管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，同時(shí)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響膽管癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。在膽管癌中LOXL2 和Snail 表達(dá)存在一定的正相關(guān)關(guān)系。LOXL2 和Snail 過表達(dá)的膽管癌患者術(shù)后生存率相對(duì)較低，提示LOXL2 和Snail 可能是膽管癌患者預(yù)后的影響因素，有望成為生物治療的新靶點(diǎn)。