miR-125b-5p 調(diào)控HK2 抑制膽囊癌細(xì)胞增殖和糖酵解

張 瑋，王保全，雷喜鋒，王 旭，張 梁

（渭南市中心醫(yī)院普外科，陜西 渭南 714000）

膽囊癌是常見的膽道惡性腫瘤。由于早期表現(xiàn)為腹痛和不適等非特異性癥狀，患者多于晚期才被確診，錯(cuò)過了最佳的治療時(shí)間，預(yù)后較差。據(jù)報(bào)道，膽囊癌患者的5 a 生存率僅為4.1%[1]。因此，尋找膽囊癌的生物標(biāo)志物對(duì)其臨床診斷和治療十分關(guān)鍵。miRNA 是短鏈非編碼RNA，通過與靶基因結(jié)合，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)，進(jìn)而參與多種生物過程。例如：過表達(dá)miR-1 231 可促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞的多西紫杉醇敏感性，減輕膽囊癌的惡性進(jìn)展[2]。有氧糖酵解是腫瘤的標(biāo)志，與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為有關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 與有氧糖酵解密切相關(guān)[4-5]。mR-153 通過靶向抑制E3F3 抑制甲狀腺癌的糖酵解[6]。miR-142 可糖酵解，抑制結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移[7]。miR-125b-5p 被報(bào)道在包括乳腺癌[8]、食管鱗狀細(xì)胞癌[9]、肝細(xì)胞癌[10]在內(nèi)的多種腫瘤中表達(dá)降低。然而，關(guān)于miR-125b-5p 在膽囊癌中的研究鮮有報(bào)道。因此，本研究將探討miR-125b-5p 調(diào)控膽囊癌細(xì)胞增殖和糖酵解的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞人永生化膽囊上皮細(xì)胞（Human gallbladder epithelial cells，HGBEC，貨號(hào)：CL-416h）、人膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD（貨號(hào)：CL-365h）、NOZ（貨號(hào)：CL-315h）、HEK-293T（貨號(hào)：CL-209h）細(xì)胞購自武漢賽奧斯生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑DMEM 培養(yǎng)基（貨號(hào)：MED-1001）購自武漢賽奧斯生物科技有限公司。RPMI 1640（貨號(hào)：PM150110B）培養(yǎng)基購自武漢Pricella。NC mimic、miR-125b-5p mimic 和miR-125b-5p mimic+pcDNA-NC 和miR-125b-5p mimic+pcDNAHK2 引物序列是由廣州銳博生物科技有限公司合成。兔抗HK2、LDHA、PDK1、GAPDH 抗體以及山羊抗兔二抗購自Abcam。葡萄糖檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：ml095040）、乳酸含量試劑盒（貨號(hào)：ml077360）、ATP 含量試劑盒（貨號(hào)：ml092826）購自上海Mlbio。BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：PC0020）、CCK-8 試劑盒（貨號(hào)：CA1210）購自北京Solarbio。TRIzol 試劑（貨號(hào)：R0016）和RIPA試劑（貨號(hào)：P0013C）購自上海Beyotime。雙熒光素酶試劑盒購自美國普洛麥格。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)HGBEC 細(xì)胞培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基中，GBC-SD 細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、1%雙抗的RMPI 1 640，NOZ 細(xì)胞接種在DMEM 培養(yǎng)基（10%胎牛血清和1%雙抗）中。HEK-293T 細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、1% L-谷氨酰胺、1%NEAA 和1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染取對(duì)數(shù)生長期的GBC-SD 細(xì)胞，根據(jù)Lipofectamine 2000 試劑盒說明書，分別將NC mimic、miR-125b-5p mimic 和miR-125b-5p mimic+pcDNA-NC 和miR-125b-5p mimic+pcDNAHK2 轉(zhuǎn)染至GBC-SD 細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h 后，通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）和Western blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 RT-qPCRTRIzol 試劑用于提取細(xì)胞中的總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，SYBR?Green PCR Master Mix 用于qPCR 測(cè)定。反應(yīng)條件為：95 ℃ 15 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。U6 作為miR-125b-5p 的內(nèi)參，GAPDH作為HK2 的內(nèi)參。2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列，見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.4 Western blot收集各組中的細(xì)胞，通過RIPA 緩沖液裂解細(xì)胞，BCA 試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分離，隨后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，在5%脫脂牛奶溶液中封閉1 h。使用稀釋后的一抗（HK2（1∶2 000）、LDHA（1∶2 000）、PDK1（1∶2 000）、GAPDH（1∶2 500））4 ℃過夜孵育，洗滌后加入二抗（1∶5 000）在室溫中孵育1 h。ECL 化學(xué)發(fā)光試劑顯示蛋白條帶。化學(xué)發(fā)光信號(hào)凝膠成像儀采集圖像，Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。GAPDH 作為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參。

1.2.5 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）采用CCK-8 試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)的增殖活力。收集轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，以6×103個(gè)/孔的密度接種至96 孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間（0、24、48、72 h），并在對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)向每孔中加入CCK-8 試劑20 μL。孵育2 h 后通過酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處吸光度值。

1.2.6 葡萄糖攝取、乳酸生成以及ATP 水平檢測(cè)以1×105的密度將細(xì)胞接種至12 孔板中，過夜培養(yǎng)后棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS 洗滌細(xì)胞兩地。將細(xì)胞接種至37 ℃含74～148 kBq/mL18FFDG 的葡萄糖細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)1h，PBS 洗滌細(xì)胞2 次，并加入0.5 M NaOH 1mL 用于裂解細(xì)胞。γ 計(jì)數(shù)器用于檢測(cè)裂解物中的放射性。細(xì)胞內(nèi)18FFDG 攝取標(biāo)準(zhǔn)化為相應(yīng)細(xì)胞數(shù)的放射性讀數(shù)[11]。

通過乳酸含量試劑盒和ATP 含量試劑盒用于測(cè)定乳酸生成量和ATP 的水平。根據(jù)試劑盒說明書，收集細(xì)胞上清液用于乳酸濃度測(cè)定，下層細(xì)胞沉淀裂解后用于測(cè)量ATP 的含量。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)將與miR-125b-5p 具有結(jié)合序列的野生型HK2 和突變型HK2 克隆到pGL3-control 載體中。將細(xì)胞接種至24 孔板中，分別將NC mimic、miR-125b-5pmimic 和HK2-WT 或HK2-MUT 轉(zhuǎn)染至HEK-293T 細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞，利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒通過TD-20/20 發(fā)光計(jì)檢測(cè)雙熒光素酶活性，以海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 8.0 分析和作圖。數(shù)據(jù)表示為“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（）。2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次重復(fù)。P＜ 0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-125b-5p 在膽囊癌組織和細(xì)胞中表達(dá)降低

收集人膽囊上皮細(xì)胞HGBEC 和膽囊癌細(xì)胞GBC-SD、NOZ，分別提取RNA，通過RT-qPCR測(cè)定miR-125b-5p 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-125b-5p在GBC-SD 和NOZ 細(xì)胞中表達(dá)低于HGBEC 細(xì)胞（P＜ 0.000 1），見圖1A，且在GBC-SD 細(xì)胞中表達(dá)更低。進(jìn)一步通過TCGA 數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-125b-5p 在膽囊癌組織中的表達(dá)低于對(duì)應(yīng)的癌旁組織（P＜ 0.01），見圖1B。因此，推斷miR-125b-5p 的低表達(dá)與膽囊癌的發(fā)生密切相關(guān)，且選擇GBC-SD 細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞進(jìn)一步研究。

圖1 miR-125b-5p 在膽囊癌細(xì)胞和組織中表達(dá)降低Fig. 1 The expression of miR-125b-5p was decreased ingallbladder carcinoma cells and tissues

2.2 過表達(dá)miR-125b-5p 抑制GBC-SD 細(xì)胞增殖和有氧糖酵解

為進(jìn)一步探索miR-125b-5p 在膽囊癌中的調(diào)控作用，分別在GBC-SD 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染NC mimic和miR-125b-5p mimic，通過RT-qPCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NC mimic 組中miR-125b-5p 的表達(dá)與NC 組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞ 0.05），見圖2A。轉(zhuǎn)染miR-125b-5pmimic 組中miR-125b-5p 的表達(dá)明顯高于NC mimic 組（P＜ 0.01）。CCK-8 顯示，過表達(dá)miR-125b-5p 可明顯抑制細(xì)胞的增殖活力（P＜0.05），見圖2B。糖酵解相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)表明，過表達(dá)miR-125b-5p 組GBC-SD 細(xì)胞中乳酸生成量（P＜ 0.001），見圖2C、葡萄糖消耗量（P＜ 0.05），見圖2D 以及ATP 生成減少（P＜ 0.01），見圖2E，LDHA（P＜ 0.01），見圖2F 和G、PDK1（P＜ 0.001）和HK2（P＜ 0.000 1），見圖2F 和圖2G 蛋白表達(dá)降低。綜上可知，過表達(dá)miR-125b-5p 顯著抑制GBC-SD 細(xì)胞增殖以及有氧糖酵解。

圖2 過表達(dá)miR-125b-5p 抑制GBC-SD 細(xì)胞增殖和有氧糖酵解Fig. 2 Over-expression of miR-125b-5p inhibited the proliferation and aerobic glycolysis in GBC-SD cell

2.3 miR-125b-5p 靶向負(fù)調(diào)控HK2

通過starBase 數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)HK2 與miR-125b-5p 存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，見圖3A，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過表達(dá)miR-125b-5p 可顯著抑制HK2 野生型載體的熒光素酶活性（P＜ 0.01），見圖3B，而對(duì)突變型HK2 載體的熒光素酶活性無明顯作用（P＞ 0.05）。RT-qPCR 和Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HK2 mRNA（P＜ 0.000 1），見圖3C 和蛋白（P＜ 0.000 1），見圖3D 和圖3E，水平在膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD 和NOZ 中表達(dá)高于膽囊上皮細(xì)胞HGBEC，且過表達(dá)miR-125b-5p 顯著抑制HK2 mRNA（P＜ 0.01），見圖3F 和蛋白（P＜ 0.001），見圖3G 和圖3H 表達(dá)。由此說明miR-125b-5p靶向HK2，且負(fù)調(diào)控HK2 的表達(dá)。

圖3 miR-125b-5p 靶向負(fù)調(diào)控HK2Fig. 3 miR-125b-5p targeted and negatively regulated HK2

2.4 miR-125b-5p 靶向HK2 抑制GBC-SD 細(xì)胞增殖和有氧糖酵解

進(jìn)一步研究膽囊癌細(xì)胞中miR-125b-5p 對(duì)HK2 的調(diào)控機(jī)制，分別在GBC-SD 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染NC mimic、miR-125b-5p mimic、miR-125b-5p mimic+pcDNA-NC 以 及 miR-125b-5p mimic+pcDNA-HK2，RT-qPCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-125b-5p mimic+pcDNA-NC 組中HK2 mRNA 水平與miR-125b-5p mimic 組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），轉(zhuǎn)染miR-125b-5p mimic+pcDNAHK2 組中HK2 的表達(dá)高于miR-125b-5p mimic組（P＜ 0.05）。CCK-8 和糖酵解相關(guān)檢指標(biāo)測(cè)發(fā)現(xiàn)，同時(shí)過表達(dá)miR-125b-5p 和HK2 組中細(xì)胞增殖活力（P＜ 0.01），見圖4B、乳酸生成（P＜ 0.01），見圖4C、葡萄糖消耗（P＜ 0.05），見圖4D、ATP生成（P＜ 0.05），見圖4E，LDHA（P＜ 0.001），見圖4F 和 圖4G、PDK1（P＜ 0.001），見 圖4F 和圖4G，HK2（P＜ 0.000 1），見圖4F 和圖4G，蛋白表達(dá)顯著高于miR-125b-5p mimic+pcDNANC 組。綜上可知，過表達(dá)HK2 可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-125b-5p 對(duì)細(xì)胞增殖和有氧糖酵解的抑制作用。

圖4 miR-125b-5p 靶向HK2 抑制GBC-SD 細(xì)胞增殖和有氧糖酵解Fig. 4 miR-125b-5p inhibited theproliferationandaerobic glycolysis in GBC-SD cellby targeting HK2

3 討論

膽囊癌是常見的胃腸道癌癥，具有明顯的地域差異。在高發(fā)地區(qū)，女性的發(fā)病率明顯高于男性[12]。盡管診斷技術(shù)和治療管理方面取得了很大的進(jìn)步，但膽囊癌患者的預(yù)后仍然較差。研究可靠的生物標(biāo)志物對(duì)膽囊癌患者的臨床診斷和治療至關(guān)重要。有氧糖酵解增強(qiáng)是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)顯著特征。雖然有氧糖酵解在產(chǎn)生ATP 方面效率低于無氧糖酵解，但它能促進(jìn)增殖、抑制凋亡，產(chǎn)生信號(hào)代謝物，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞在分子壓力下的生存率。因此，研究膽囊癌中糖酵解的產(chǎn)生機(jī)制十分重要。

miRNA 在調(diào)節(jié)生長發(fā)育及其他重要的生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用。目前，大量miRNA 已被作為疾病的診斷生物標(biāo)志物、癌癥亞型的生物標(biāo)志物以及治療靶點(diǎn)進(jìn)行研究[13]。miR-125b-5p 已被報(bào)道參與多種疾病的調(diào)控。例如：Jin 等[14]報(bào)道，敲降miR-125b-5p 可抑制RYBP 的表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體來源的miR-125b-5p 通過靶向抑制缺血性急性腎損傷中腎小管上皮細(xì)胞的P53 表達(dá)，從而促進(jìn)腎小管修復(fù)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-125b-5p 在膽囊癌細(xì)胞中表達(dá)降低，過表達(dá)b 可顯著抑制膽囊癌細(xì)胞GBC-SD 的增殖、乳酸生成、葡萄糖消耗、ATP 生成以及LDHA、PDK1 和HK2 蛋白表達(dá)。這與Yang 等[16]報(bào)道的結(jié)果一致，同時(shí)，證明過表達(dá)miR-125b-5p 可增加順鉑處理后的膽囊癌細(xì)胞的死亡，促進(jìn)癌細(xì)胞的化療敏感性。

己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）是一種糖酵解酶，促進(jìn)細(xì)胞中葡萄糖代謝，進(jìn)而催化Warburg 效應(yīng)。已經(jīng)在多種癌癥中觀察到HK2 上調(diào)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥性[17-18]。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，上調(diào)HK2 可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的葡萄糖消耗和乳酸生成及癌細(xì)胞的耐藥性[19]。在卵巢癌中，抑制HK2 表達(dá)可拮抗卵巢癌細(xì)胞的Warburg 效應(yīng)，抑制卵巢癌發(fā)展進(jìn)程[20]。過表達(dá)miR-9-1 顯著降低HK2 蛋白水平，抑制了鼻咽癌細(xì)胞的增殖和糖酵解[21]。本研究中，發(fā)現(xiàn)HK2 是miR-125b-5p 的靶基因，且負(fù)調(diào)控HK2的表達(dá)。過表達(dá)HK2 可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-125b-5p對(duì)膽囊癌細(xì)胞增殖和糖酵解的抑制作用。此外，HK2 也被報(bào)道在膽囊癌細(xì)胞中作為miR-143 的靶基因，與lncRNA PVT1 共同競(jìng)爭(zhēng)和miR-143 的結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[22]。

綜上所述，膽囊癌組織和細(xì)胞中miR-125b-5p低表達(dá)，過表達(dá)miR-125b-5p 靶向抑制HK2 的表達(dá)，進(jìn)而抑制人膽囊癌細(xì)胞GBC-SD 的增殖和有氧糖酵解，miR-125b-5p/HK2 分子軸的調(diào)控作用可為膽囊癌的臨床診斷和治療提供新的理論依據(jù)。