哮喘患兒NR3C1及GLCCI1基因多態(tài)性的臨床預(yù)測價值*

楊艷，盧慧娜，陳霞△，馮靜，賀穎，張瓊瓊，王艦輝

（1.中國人民解放軍陸軍第九五八醫(yī)院兒科，重慶 400020；2.重慶市中醫(yī)院兒科，重慶 400021）

當(dāng)前，兒童哮喘的發(fā)病率逐年上升，雖然許多藥物［如吸入性糖皮質(zhì)激素（ICS）］臨床被批準(zhǔn)用于治療哮喘，但仍缺乏針對性。哮喘患者對ICS的反應(yīng)存在個體差異，因?yàn)镮CS應(yīng)答約70%的變異由目標(biāo)基因的遺傳特征決定。近年來全基因組關(guān)聯(lián)研究中發(fā)現(xiàn)的基因（如GLCCI1、FBXL7、T、ALLC、CMTR1）可能在哮喘診斷/治療反應(yīng)通路中發(fā)揮直接或間接作用。有研究提示，皮質(zhì)激素誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄物1（GLCCI1）通過IL-13/periostin/TGF-β1信號通路調(diào)節(jié)哮喘氣道重塑［1］，糖皮質(zhì)激素受體基因（NR3C1）的遺傳變異與哮喘患者對ICS的反應(yīng)密切相關(guān)［2］。為此，本研究中以重慶市兩家醫(yī)院兒科收治的哮喘患兒為研究對象，分析了NR3C1及GLCCI1基因多態(tài)性與ICS對患兒療效的相關(guān)性，為臨床醫(yī)師制訂個體化治療方案提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2016年中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》中診斷標(biāo)準(zhǔn)；臨床資料完整。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患兒家屬簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：近1周內(nèi)有呼吸道感染病史；自身免疫疾病、遺傳代謝性疾??；合并慢性腎功能衰竭等慢性疾病；精神發(fā)育遲滯，無法配合本研究。

病例選擇與分組：選取陸軍第九五八醫(yī)院和重慶市中醫(yī)院兒科2020年12月至2022年1月收治的哮喘患兒40例，作為觀察組；另選擇此兩家醫(yī)院同期未診斷哮喘患兒43例，作為對照組。

1.2 方法

觀察組患兒單次霧化吸入布地奈德混懸液（四川普銳特藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20213286，規(guī)格為每支2 mL∶1 mg）0.5～1 mg 4 h后，檢測第1秒用力呼氣容積（FEV1）；然后予丙酸氟替卡松吸入氣霧劑（Glaxo Wellcome S.A.，進(jìn)口藥品注冊證號H20130189，規(guī)格為每撳50μg或125μg）經(jīng)口吸入，每次1撳，每日2次，持續(xù)治療3個月后，檢測肺功能。對照組在相同時間點(diǎn)檢測FEV1。

1.3 多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）高通量測序（NGS）驗(yàn)證檢測

于治療前抽取患兒外周靜脈血2 mL，抗凝、離心、分離后提取基因組DNA，置-80℃凍存。GLCCI1基因rs37973位點(diǎn)上游引物：5-'TCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACCACGAGCAGACCAATTTGA-3'，下游引物：5'-AGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAATTTACCCCACAGTAAAG-3'；NR3C1基因rs42423247位點(diǎn)上游引物：5-'TCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACTTGCAGGAACATTTGAACG-3'，下游引物：5'-AGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGTGAACAGTGTACCAGAC-3'。

PCR反應(yīng)體系為20μL，內(nèi)含Ready Reaction Premix 1μL，BigDye sequencing Buffer 3.5μL，引物終濃度為0.1μmol/L，PCR產(chǎn)物20 ng，超純水定容至20μL。反應(yīng)條件為：96℃變性1 min，96℃10 s、50℃5 s、60℃4 min，循環(huán)25次。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，用基因測序儀測序。

1.4 觀察指標(biāo)

觀察患兒的臨床指標(biāo)；基因型、等位基因的分布；不同基因型患兒治療前后肺功能的改變情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 14.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析。計量資料以±s表示，行t檢驗(yàn)；計數(shù)資料以率（%）表示，行χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組患兒臨床指標(biāo)見表1；不同位點(diǎn)基因型分布無顯著差異（P＞0.05），見表2；吸入ICS 3個月后各基因型的肺功能比較見表3（MMEF75/25為最大呼氣中期流量，F(xiàn)VC為用力肺活量，F(xiàn)EF75為75%FVC水平的呼氣流量）。觀察組吸入ICS 4 h后FEV1明顯改善（改善率＞15%）患兒基因型分布見表4。

表1 兩組患兒臨床指標(biāo)比較Tab.1 Comparison of clinical characteristics between the two groups

表2 兩組患兒不同位點(diǎn)基因型分布Tab.2 Distribution of different loci genotypes in the two groups

表3 觀察組各基因型患兒肺功能比較（±s）Tab.3 Comparison of pulmonary function of children with different genotypes in the observation group（±s）

表3 觀察組各基因型患兒肺功能比較（±s）Tab.3 Comparison of pulmonary function of children with different genotypes in the observation group（±s）

注：與同位點(diǎn)同基因型治療前比較，*P＜0.01；與同位點(diǎn)C/C基因型比較，#P＜0.05，##P＜0.01。Note：Compared with the same locus genotype before treatment，*P＜0.01；Compared with C/C genotype at the same locus，#P＜0.05，##P＜0.01.

位點(diǎn)rs41423247 rs37973基因型G/G G/C+C/G C/C G/G G/A+A/G A/A FEV1/預(yù)計值%治療前68.77±4.53 66.98±5.09 76.33±3.65 64.42±3.94 68.91±4.53 70.76±9.97治療3個月后93.11±3.25*93.11±3.15*80.94±3.46 91.47±2.47*93.44±3.90*93.44±6.30*MMEF75/25/預(yù)計值%治療前74.38±3.40 74.12±4.22 75.84±1.77 72.26±3.95 74.78±3.90 73.77±2.32治療3個月后96.72±3.90*95.74±3.65*78.21±1.67 94.06±3.49*96.66±5.00*94.14±7.99*FEV1/FVC變化（%）15.11±4.96##16.74±5.46#1.51±1.20 17.92±16.92 15.19±4.78 11.17±5.66 FEF75變化（%）19.18±6.39##16.98±6.15#1.84±1.34 11.98±5.26 19.66±5.78 17.29±9.11

表4 觀察組吸入ICS 4 h后FEV1明顯改善患兒的基因型分布Tab.4 Distribution of genotypes in children with significantly improved FEV1 at 4 h after ICS inhalation in the observation group

3 討論

ICS是控制和管理哮喘的一線藥物，可提高哮喘患兒的FEV1，增加無癥狀天數(shù)，降低住院率及加重次數(shù)。但臨床發(fā)現(xiàn)哮喘患者對ICS反應(yīng)具有高度個體可重復(fù)性和個體差異性，且患者對ICS抵抗或不敏感是影響哮喘療效的關(guān)鍵因素。哮喘患兒對ICS治療反應(yīng)的差異性不僅與氣道炎癥的類型有關(guān)，更基于藥物基因組學(xué)的個體化差異，然而對哮喘藥物遺傳變異的分析仍存在較多難題。多種因素（如環(huán)境作用）和復(fù)雜的遺傳背景（包括易感表型異質(zhì)性）等使哮喘藥物基因?qū)W研究復(fù)雜化。不同地區(qū)、不同種族等的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNP）各基因型對藥物的敏感性均不同，這導(dǎo)致研究報道結(jié)果不一致，藥物基因組學(xué)研究也將成為個體化精準(zhǔn)用藥的重要參考依據(jù)［3］。本研究中立足于重慶市兩家醫(yī)院收治的哮喘患兒，探討與ICS作用機(jī)制密切相關(guān)的GLCCI1和NR3C1基因多態(tài)性對哮喘易感性及ICS療效的預(yù)測作用。

國內(nèi)外學(xué)者對多個影響哮喘患兒ICS反應(yīng)SNPs的研究，已證實(shí)GLCCI1是主要候選基因。GLCCI1編碼一種功能未知的蛋白，可表達(dá)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)蛋白水平并可能成為激素導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的早期標(biāo)記物。目前認(rèn)為，GLCCI1基因位于第7號染色體短臂2區(qū)1帶，內(nèi)有8個外顯子。既往對于rs37973位點(diǎn)的研究，初步確定G等位基因與治療反應(yīng)較差有關(guān)［4-5］。rs37973位點(diǎn)編碼一種功能未知的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致哮喘患者對ICS治療的反應(yīng)降低。該SNP與rs37973 SNP在同一基因上存在完全連鎖不平衡，從而影響GLCCI1基因的表達(dá)［1］。然而，另一項研究并未證實(shí)GLCCI1基因rs37973位點(diǎn)能預(yù)測對ICS治療的反應(yīng)［6］。TANTISIRA等［7］的研究表明，非西班牙裔白種rs37973純合子GG基因型哮喘患者應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療后FEV1的改善率僅為野生型的1/3［7］，而RIJAVEC等［8］對208例成年哮喘患者研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過3個月ICS治療后，GG基因型患者FEV1占預(yù)計值百分比明顯高于AA+AG基因型患者，且這種基因依賴型的不同主要存在于非吸煙和過敏患者。因此認(rèn)為，吸煙及過敏影響藥物基因檢測結(jié)果，而GG基因型患者可獲得更好的ICS療效。另外發(fā)現(xiàn)，GLCCI1基因變異可加速ICS治療后肺功能改善，同樣情況也發(fā)現(xiàn)在漢族人群［9-10］。HOSKING等［5］證實(shí)，GLCCI1基因rs37973位點(diǎn)不能作為白種哮喘患者ICS療效預(yù)測的指標(biāo)。郝珉等［11］研究發(fā)現(xiàn)，GLCCI1基因另一個SNP rs37972位點(diǎn)TT型患兒經(jīng)12周的ICS治療，F(xiàn)EV1和FEV1/FCV較治療前無明顯改善，說明該位點(diǎn)該基因型對ICS的療效差。本研究中發(fā)現(xiàn)，兩組GLCCI1基因rs37973位點(diǎn)3種基因型（GG，GA，AA）患兒發(fā)病率無明顯差異。觀察組經(jīng)ICS治療4 h后G/G基因型療 效 較G/A+A/G及A/A基因型差，而3個月后該組3種基因型比較無明顯差異。提示GLCCI1基因rs37973位點(diǎn)可能與兒童哮喘無明顯相關(guān)性，且ICS長期治療反應(yīng)與該位點(diǎn)基因型（GG，GA，AA）相關(guān)性不明顯。

糖皮質(zhì)激素受體（GR）編碼的基因NR3C1，位于5q31-32，包含8個內(nèi)含子和9個外顯子，編碼800個氨基酸。GR是調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）的關(guān)鍵作用點(diǎn)，而HPA軸亢進(jìn)與NR3C1表達(dá)下調(diào)有關(guān)。NR3C1位于染色體，包含一簇細(xì)胞因子和其他免疫相關(guān)基因，包括白細(xì)胞介素（IL）-4、IL-5、IL-9、IL-13、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、CD14、白三烯C4合酶（LTC4S）等。有研究表明，rs41423247為哮喘等炎性疾病的易感位點(diǎn)。KESKIN等［12］證實(shí)，攜帶rs41423247純合子G等位基因中重度哮喘患兒吸入高劑量ICS后FEV1可顯著改善。另有研究表明，rs41423247位點(diǎn)C等位基因與保護(hù)HPA有關(guān)，CC基因型與促腎上腺皮質(zhì)激素最高反應(yīng)相關(guān)［2，13］。本研究中發(fā)現(xiàn)，rs41423247位點(diǎn)與哮喘易感性無明顯相關(guān)，但觀察組rs41423247 SNP G/C+C/G基因型患兒吸入ICS 4 h后FEV1改善≥15%比例較G/G及C/C基因型患兒明顯降低。吸入ICS 3個月后rs41423247位點(diǎn)G/G及G/C+C/G基因型FEV1占預(yù)計值百分比、MMEF75/25占預(yù)計值百分比較治療前明顯改善，而等位基因C/C患兒吸入ICS 3個月后肺功能改善不顯著。rs41423247 SNP G/G及G/C+C/G基因型患兒FEV1/FVC變化率、FEF75變化率與C/C基因型比較有顯著差異（P＜0.05）。提示rs41423247 SNP G/C+C/G基因型吸入ICS短期療效較差，而C/C基因型對ICS長期治療不敏感。本研究中還測定了對照組各基因型吸入ICS 4 h后肺功能變化情況，因FEV1改善≥15%病例數(shù)較少而未進(jìn)一步統(tǒng)計。

綜上所述，GLCCI1基因rs37973位點(diǎn)并非兒童哮喘易感因素，SNP G/G基因型患兒吸入ICS 4 h后FEV1改善≥15%比例較G/A+A/G、A/A基因型明顯下降，而長期ICS治療反應(yīng)與基因型無明顯相關(guān)性。NR3C1基因rs41423247位點(diǎn)與哮喘易感性無明顯相關(guān)性，但G/C+C/G基因型患兒吸入ICS 4 h后FEV1改善≥15%比例較G/G及C/C基因型明顯降低，而C/C基因型吸入ICS 3個月后FEV1/FVC變化率、FEF75變化率較G/G及G/C+C/G基因型顯著降低。但本研究樣本量較小，以后研究中將擴(kuò)大樣本量，且ICS的長短期療效差異是否與基因型或環(huán)境因素（如抽煙、大氣污染等）相關(guān)，也需進(jìn)一步論證。