軟堅(jiān)清脈顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

黃雨婷，胡鵬躍，李國(guó)文，史秀峰，謝燕

（上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203）

軟堅(jiān)清脈顆粒由垂盆草、蒲黃、豨薟草、海藻、煅牡蠣5味藥材配伍，具有軟堅(jiān)散結(jié)、祛瘀消腫功效，臨床用于治療肢體動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成引起的肢體血管狹窄、閉塞導(dǎo)致下肢慢性缺血的外周動(dòng)脈疾病等［1］。該制劑現(xiàn)行制備工藝規(guī)范性欠佳，且質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較低，不能滿足臨床需求。槲皮素、山柰素、異鼠李素為垂盆草主要成分，香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷為蒲黃主要成分，均具有多種藥理學(xué)活性［2-6］。本研究中采用薄層色譜（TLC）法鑒別該制劑中垂盆草、蒲黃、豨薟草，并建立了同時(shí)測(cè)定垂盆草中槲皮素、山柰素、異鼠李素及蒲黃中香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量的高效液相色譜（HPLC）法，以期為軟堅(jiān)清脈顆粒的質(zhì)量控制提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；CP225D型十萬(wàn)分之一分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器＜北京＞有限公司）；ATS4型薄層點(diǎn)樣儀、Visalient型薄層成像儀（瑞士CAMAG公司）；SK7200LHC型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

軟堅(jiān)清脈顆粒（上海練塘藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為210112，211001，211002，211003）。槲皮素對(duì)照品（批號(hào)為100081-201610，含量98%）、山柰素對(duì)照品（批號(hào)為110861-201611，含量98%）、異鼠李素對(duì)照品（批號(hào)為110860-201611，含量98%）、香蒲新苷對(duì)照品（批號(hào)為111573-201405，含量98%）、異鼠李素-3-O-新橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)為111571-201205，含量98%）、垂盆草對(duì)照藥材（批號(hào)為121434-201203）、蒲黃對(duì)照藥材（批號(hào)為121225-201804）、豨薟草對(duì)照藥材（批號(hào)為121572-201202），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；奇壬醇對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)為MUST-18051504，含量98%）；硅膠G薄層板（煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所，批號(hào)為20201107）；磷酸、乙腈、甲醇均為色譜純；三氯甲烷、乙酸乙酯、甲苯、甲酸、正丁醇、環(huán)己烷、乙醚均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

垂盆草：取樣品粉末10 g，加甲醇20 mL，超聲（功率250 W，頻率40 kHz；下同）處理30 min，濾過(guò)，蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，即得供試品溶液；取垂盆草對(duì)照藥材1 g，同法制得對(duì)照藥材溶液；按軟堅(jiān)清脈顆粒處方及工藝制備缺垂盆草的陰性樣品，同法制得陰性對(duì)照品溶液。取上述溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（15∶1，V/V）為展開劑，噴以5%磷鉬酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光燈下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見圖1 A。

蒲黃：取樣品粉末10 g，加水30 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，用乙醚萃取，棄去乙醚液，水浴揮去殘留乙醚，加水飽和的正丁醇萃取，取正丁醇層蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，即得供試品溶液。取香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，分別加甲醇溶解制成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的單一對(duì)照品溶液；取蒲黃對(duì)照藥材1 g，同法制得對(duì)照藥材溶液；按軟堅(jiān)清脈顆粒處方及工藝制備缺蒲黃的陰性樣品，同法制得陰性對(duì)照品溶液。取上述溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（4∶3∶1∶1，V/V/V/V）為展開劑，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，與對(duì)照藥材溶液、對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見圖1 B。

豨薟草：取樣品粉末10 g，加70%甲醇20 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，即得供試品溶液。取奇壬醇對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對(duì)照品溶液；取豨薟草對(duì)照藥材1 g，同法制得對(duì)照藥材溶液；按軟堅(jiān)清脈顆粒處方及工藝制備缺豨薟草的陰性樣品，同法制得陰性對(duì)照品溶液。取上述溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板，以三氯甲烷-甲醇（4∶1，V/V）為展開劑，噴以5%香草醛硫酸溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光燈下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液、對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見圖1 C。

圖1 薄層色譜圖1.Reference medicinal materials solution 2.Negative reference solution 3-5.Test solution 6.Typhaneoside reference solution 7.Isorhamnetin-3-O-neohesperidoside reference solution 8.Kirenol reference solution A.Sedi Herba B.Typhae Pollen C.Siegesbeckiae HerbaFig.1 TLC chromatograms

2.2 垂盆草有效成分含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸K溶液（44∶56，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL［7］。

2.2.2 溶液制備

取槲皮素、山柰素、異鼠李素對(duì)照品各適量，分別加甲醇制成單一對(duì)照品溶液；另取3種對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為15，5，5μg/mL的混合對(duì)照品溶液。取樣品粉末4 g，精密稱定，分別精密加入甲醇20 mL及20%鹽酸5 mL，精密稱定質(zhì)量，80℃回流45 min，冷卻至室溫，加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別吸取2.2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及2.1項(xiàng)下缺垂盆草的陰性對(duì)照品溶液各適量，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液與混合對(duì)照品溶液色譜分別于28，55，64 min時(shí)出現(xiàn)相應(yīng)色譜峰，且陰性對(duì)照無(wú)干擾；二極管陣列檢測(cè)器純度分析顯示，主峰的純度因子分別為989，998，999，均大于980，分離度均大于1.5，表明專屬性良好。詳見圖2。

圖2 垂盆草高效液相色譜圖1.Quercetin 2.Kaempferol 3.IsorhamnetinA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms of Sedi Herba

線性關(guān)系考察：分別取3種對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇稀釋，制成槲皮素質(zhì)量濃度分別為83.2，62.4，41.6，20.8，10.0μg/mL，山柰素分別為16.0，12.0，8.0，4.0，2.0μg/mL，異鼠李素分別為44.8，33.6，22.4，11.2，5.6μg/mL的系列單一對(duì)照品溶液。取10μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。分別以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y1=4 292.4X1-40.81（r=0.999 6）、Y2=3 835.6X2-11.34（r=0.999 3）、Y3=4 269.1X3-46.36（r=0.999 6）。結(jié)果表明，槲皮素、山柰素、異鼠李素質(zhì)量濃度分別在10.0～83.2μg/mL、2.0～16.0μg/mL、5.6～44.8μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

定量限和檢測(cè)限考察：取2.2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，用甲醇倍比稀釋，以信噪比（S/N）為10∶1和3∶1時(shí)的質(zhì)量濃度分別記為定量限和檢測(cè)限。結(jié)果槲皮素、山柰素、異鼠李素的定量限分別為9.40，21.36，21.08 ng，檢測(cè)限分別為2.81，6.41，6.30 ng。

精密度試驗(yàn)：取2.2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次。結(jié)果槲皮素、山柰素、異鼠李素峰面積的RSD分別為0.74%，0.57%，0.88%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2.2項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)為210112）適量，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，10，12，24 h時(shí)按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果槲皮素、山柰素、異鼠李素峰面積的RSD分別為3.29%，4.56%，3.94%（n=8），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取樣品粉末（批號(hào)為210112）適量，各6份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果槲皮素、山柰素、異鼠李素的平均含量分別為269.40，55.48，112.60μg/g，RSD分別為2.59%，1.21%，3.35%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量樣品粉末（批號(hào)為210112）2 g，精密稱定，各6份，分別加入2.2.2項(xiàng)下一定質(zhì)量濃度的單一對(duì)照品溶液，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 槲皮素、山柰素、異鼠李素的加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test of quercetin，kaempferol and isorhamnetin（n=6）

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取各批樣品適量，分別按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（±s，μg/g，n=3）Tab.2 Results of content determination of five components in the samples（±s，μg/g，n=3）

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（±s，μg/g，n=3）Tab.2 Results of content determination of five components in the samples（±s，μg/g，n=3）

批號(hào)210112 211001 211002 211003槲皮素269.40±2.49 430.36±1.59 419.37±2.36 437.72±15.02山柰素55.48±0.54 87.48±0.68 85.70±0.37 88.10±3.39異鼠李素112.60±0.95 159.31±0.41 155.61±0.36 167.59±8.20香蒲新苷140.89±4.60 179.92±2.03 178.73±2.49 181.91±1.84異鼠李素-3-O-新橙皮苷82.82±4.18 120.53±5.00 121.62±4.80 126.55±3.08

2.3 蒲黃有效成分含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸水溶液（14∶86，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL［2］。

2.3.2 溶液制備

取香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷對(duì)照品各適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度均為50μg/mL的混合對(duì)照品溶液。取樣品粉末4 g，加75%甲醇50 mL，精密稱定，超聲處理45 min，冷卻至室溫，加75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過(guò)，經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別吸取2.3.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及2.1項(xiàng)下缺蒲黃的陰性對(duì)照品溶液各適量，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液與混合對(duì)照品溶液色譜在28 min及42 min時(shí)出現(xiàn)相應(yīng)色譜峰，且陰性對(duì)照無(wú)干擾；二極管列陣檢測(cè)器純度分析顯示，主峰的純度因子分別為989，992，均大于980，分離度均大于1.5，表明專屬性良好。詳見圖3。

圖3 蒲黃高效液相色譜圖1.Typhaneoside 2.Isorhamnetin-3-O-neohesperidosideA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.3 HPLC chromatograms of Typhae Pollen

線性關(guān)系考察：取2種對(duì)照品各適量，精密稱定，分別用甲醇稀釋，制成香蒲新苷質(zhì)量濃度分別為41.2，33.0，24.7，16.5，8.2，4.1μg/mL，異鼠李素-3-O-新橙皮苷分別為42.4，33.9，25.4，17.0，8.5，4.2μg/mL的系列單一對(duì)照品溶液，取適量，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y4=1 455.1X4+16.16（r=0.999 8）、Y5=1 992.0X5+18.85（r=0.999 8）。結(jié)果表明，香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷質(zhì)量濃度分別在4.1～41.2μg/mL、4.2～42.4μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

定量限和檢測(cè)限考察：取2.3.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，用75%甲醇倍比稀釋，以S/N為10∶1，3∶1時(shí)的質(zhì)量濃度分別記為定量限和檢測(cè)限。結(jié)果香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷的定量限分別為20.24 ng，20.48 ng，檢測(cè)限分別為6.88 ng，6.96 ng。

精密度試驗(yàn)：取2.3.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次。結(jié)果香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷峰面積的RSD分別為0.41%，0.36%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.3.2項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)為210112）適量，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，10，12，24 h時(shí)按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷峰面積的RSD分別為2.11%，4.36%（n=8），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取樣品粉末（批號(hào)為210112）適量，各6份，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷的平均含量分別為140.89μg/g，82.82μg/g，RSD分別為1.44%，3.16%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量樣品粉末（批號(hào)為210112）2 g，各6份，分別加入一定質(zhì)量濃度的單一對(duì)照品溶液，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表3。

表3 香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷的加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test of typhaneoside and isorhamnetin-3-O-neohesperidin（n=6）

2.3.4 樣品含量測(cè)定

取樣品適量，分別按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果見表2。

3 討論

垂盆草TLC鑒別法建立初期將槲皮素、山柰素、異鼠李素作為鑒別指標(biāo)，但試驗(yàn)結(jié)果顯示相似條帶較多，且多為假陽(yáng)性，故最終選用垂盆草對(duì)照藥材進(jìn)行鑒別，其特征條帶明顯且無(wú)干擾、方法穩(wěn)定。蒲黃TLC鑒別方法條件嚴(yán)苛，需多次進(jìn)行純化處理。且由于藥材中黃酮類物質(zhì)較多，條帶模糊難辨，嘗試多種展開體系后仍效果欠佳，故對(duì)顯色劑進(jìn)行篩選，最終采用10%硫酸乙醇溶液顯色，色譜圖清晰美觀。豨薟草TLC鑒別方法對(duì)樣品提取溶劑進(jìn)行了考察，最終選用70%甲醇為提取溶劑，甲醇復(fù)溶處理過(guò)程樣品中析出大量多糖，避免了展開時(shí)的多糖拖尾現(xiàn)象。除上述3味草本藥材外，煅牡蠣、海藻兩味藥材主要成分為碳酸鈣和多糖［8-9］，鑒于藥材特殊性，未建立相關(guān)TLC研究?jī)?nèi)容。

以軟堅(jiān)清脈顆粒方為基礎(chǔ)，前期曾選取豨薟草中奇壬醇進(jìn)行含量測(cè)定，但其中奇壬醇含量極低，難以滿足質(zhì)控要求，故舍棄；煅牡蠣作為礦物類藥材，其中的鈣離子含量可作為質(zhì)量控制因素［10］，但由于顆粒顏色較深導(dǎo)致顯色反應(yīng)中顏色變化不明顯，難以確定是否存在陰性干擾，故舍棄；海藻主要成分為多糖，現(xiàn)有檢測(cè)方法暫無(wú)法對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析。因此，本研究中選用了垂盆草及蒲黃藥材中指標(biāo)成分進(jìn)行定量分析，且研究發(fā)現(xiàn)槲皮素、山柰素、異鼠李素均可通過(guò)不同路徑降低動(dòng)脈硬化程度［11-19］，香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷等黃酮苷類成分有抑制凝血、活血化瘀功效［6］。故本研究中以垂盆草、蒲黃的指標(biāo)成分作為定量分析成分具有一定的合理性。

與已有研究［20］相比，本研究中確定蒲黃提取時(shí)間為45 min，提取方式為超聲提??；垂盆草回流水解時(shí)間為45 min，鹽酸體積分?jǐn)?shù)為20%。本研究中皆選取了提取時(shí)間較短，操作簡(jiǎn)便的提取方式，不僅最大限度地保留了有效成分，還提高了工作效率；將蒲黃、垂盆草的指標(biāo)成分含量分開測(cè)定，分析時(shí)間較短，分離度良好，專屬性強(qiáng)，符合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)對(duì)中藥制劑質(zhì)量分析快速準(zhǔn)確的需求。