大棚栽培和仿野生栽培鐵皮石斛正丁醇提取物體外生物活性比較*

廖嫻，梁芷韻，胡莉，黃月純，楊麗娥△

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006）

鐵皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo）為蘭科石斛屬多年生草本植物［1］，具有益胃生津、滋陰清熱功效，常用于熱病傷津、口干煩渴、病后虛熱不退等病癥［2］。由于其生長(zhǎng)條件苛刻，自然產(chǎn)量極少，加之長(zhǎng)期過度采挖，導(dǎo)致野生資源瀕臨絕種［3］。為解決野生鐵皮石斛資源短缺問題，規(guī)?；F皮石斛大棚栽培、人工仿野生栽培等方式作為資源可持續(xù)開發(fā)利用的新模式在國(guó)內(nèi)不斷發(fā)展成熟［4］。鐵皮石斛栽培于浙江、云南、廣西、廣東、福建、貴州、四川、江西等地，但由于產(chǎn)地和栽培技術(shù)的不同，導(dǎo)致各地藥材品質(zhì)差異較大。研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛最主要活性成分為多糖類成分，其在抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力、保肝和保護(hù)胃腸等方面具有明顯的藥理作用［4-5］。目前，對(duì)大棚栽培和仿野生栽培鐵皮石斛的研究側(cè)重于其化學(xué)成分的組成和含量分析，對(duì)不同栽培方式的生物活性研究則較少。因此，本研究中評(píng)價(jià)了大棚栽培和仿野生栽培兩種栽培方式下的鐵皮石斛正丁醇提取物體外抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤方面的生物活性，為后期其栽培方式的選擇提供理論參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細(xì)胞

儀器：CPA225D型分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；5424R型高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；OptiMair?型超凈工作臺(tái)（新加坡Esco公司）；DM2500型熒光倒置顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；UFE500型烘箱（德國(guó)Memmert公司）；MPR-440F型低溫冰箱（日本Panasonic公司）；Epoch型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；Forma 310型CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；Vi-CELL XR型細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Beckman公司）；AI 800型超靈敏多功能成像儀（美國(guó)GE公司）；SBS40型恒溫水浴搖床（英國(guó)Stuart公司）。

試藥：DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)為11965118）、RPMI-1640培養(yǎng)基（批號(hào)為11875119）、胎牛血清（批號(hào)為10100147）、0.25%胰蛋白酶（批號(hào)為25200056）、青霉素-鏈霉素（批號(hào)為15140122），均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；牛血清白蛋白（BSA，批號(hào)為A5611）、脂多糖（LPS，批號(hào)為L(zhǎng)4391）、磷酸（批號(hào)為438081）、磺胺（批號(hào)為1117990100）、維生素C（VC，批號(hào)為PHR1008）、維生素E（VE，批號(hào)為47783）、ABTS（批號(hào)為11557）、氯化三苯四氮唑（TPTZ，批號(hào)為T1253）、總抗氧化能力試劑盒（FRAP法，批號(hào)為MAK369）、三氯化鐵（FeCl3，批號(hào)為451649）、硫酸亞鐵七水合物（FeSO4·7H2O，批號(hào)為12354）、叔丁基過氧化氫（t-BHP，批號(hào)為458139）、5-氟尿嘧啶（5-FU，批號(hào)為343922），均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；一氧化氮（NO）含量測(cè)定試劑盒（批號(hào)為S0021S）、CCK-8測(cè)定試劑盒（批號(hào)為C0042），磷酸鹽緩沖液（PBS，批號(hào)為C0221A），雙蒸水（ddH2O，批號(hào)為ST876），均購(gòu)自上海碧云天公司；硫酸、苯酚、無水乙醇均為分析純。大棚栽培鐵皮石斛和仿野生栽培鐵皮石斛，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院黃月純主任中藥師鑒定為鐵皮石斛Dendrobium officinaleKimura et Migo的莖。

細(xì)胞：大鼠心肌細(xì)胞H9c2、巨噬細(xì)胞RAW264.7、人肺癌細(xì)胞HepG2，均購(gòu)自中國(guó)廣州吉妮歐生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 提取液制備

分別稱取仿野生和大棚栽培鐵皮石斛50.0 g，加70%乙醇800 mL回流提取2次，每次1 h，合并濾液；揮去乙醇液，水液用正丁醇提取2次，每次150 mL，合并濾液，揮干，即得正丁醇提取物。取適量，精密稱定，溶于DMEM培養(yǎng)基中制成質(zhì)量濃度為4 mg/mL的提取物母液，經(jīng)0.22μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。后續(xù)試驗(yàn)以DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需質(zhì)量濃度。

1.2.2抗氧化活性檢測(cè)

ABTS自由基清除能力［6］：移取質(zhì)量濃度為0.5，1.0，2.0，4.0 mg/mL的提取液各0.1 mL，置試管中，分別加3.9 mL ABTS工作液，渦旋混合10 s，室溫避光條件下反應(yīng)20 min，以酶標(biāo)儀測(cè)定730 nm波長(zhǎng)處的吸光度（OD）值。以水溶性維生素C（Trolox）為參照物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，提取液對(duì)ABTS自由基的清除效果以Trolox等效抗氧化能力（TEAC）值表示。分別以ddH2O和VC（終質(zhì)量濃度均為0.2 mg/mL）為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

FRAP總抗氧化能力［6］：移取質(zhì)量濃度為0.5，1.0，2.0，4.0 mg/mL的提取液各0.1 mL，置試管中，分別加新配的FRAP工作液0.9 mL，渦旋混合10 s，37℃避光條件下反應(yīng)2 h，以酶標(biāo)儀測(cè)定590 nm波長(zhǎng)處的OD值。以FeSO4繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將OD值轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的FRAP值。分別以ddH2O和VC（終質(zhì)量濃度均為0.2 mg/mL）為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.3 對(duì)H9c2細(xì)胞衰老的保護(hù)作用

采用CCK-8法［7］。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9c2細(xì)胞適量，用DMEM培養(yǎng)基配成1×105/mL的細(xì)胞混懸液，以每孔100μL接種于96孔板。細(xì)胞貼壁24 h后，吸出培養(yǎng)基，加入終質(zhì)量濃度分別為25，50，100，200μg/mL的提取液，孵育2 h，吸出提取液；加入100μL t-BHP（200μmol/L）溶液，處理2 h，吸出溶液；加入新鮮DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h。以酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的OD值，并計(jì)算H9c2細(xì)胞存活率。分別以PBS和VC（終質(zhì)量濃度均為0.5 mg/mL）為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.4 對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7的免疫調(diào)節(jié)作用

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞適量，用DMEM培養(yǎng)基配成5×105/mL的細(xì)胞混懸液，以每孔100μL接種于96孔板。細(xì)胞貼壁24 h后，吸出培養(yǎng)基，加入終質(zhì)量濃度分別為25，50，100，200μg/mL的提取液，孵育24 h，收集上清液，測(cè)定NO水平。分別以PBS和LPS（終質(zhì)量濃度均為10μg/mL）為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照［8］。

1.2.5 對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2增殖的抑制作用

采用CCK-8法［9］。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞適量，用RPMI-1640培養(yǎng)基配成1×105/mL的細(xì)胞混懸液，以每孔100μL接種于96孔板。細(xì)胞貼壁24 h后，吸出培養(yǎng)基，加入終質(zhì)量濃度分別為50，100，200，400μg/mL的提取液，孵育48 h。以酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的OD值，并計(jì)算HepG2細(xì)胞增殖抑制率。分別以PBS和5-FU（終質(zhì)量濃度均為50μg/mL）為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以±s表示，行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，行χ2檢驗(yàn)；利用GraphPad Prism 7.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件作圖。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外抗氧化活性

隨著提取液質(zhì)量濃度的升高，TEAC值及FRAP值均逐漸升高，且呈濃度依賴性。結(jié)果表明，大棚栽培來源與仿野生栽培來源的鐵皮石斛正丁醇提取物，在0.5～4.0 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，ABTS自由基清除能力及FRAP總抗氧化能力均相當(dāng)（P＞0.05）。詳見圖1。

圖1 抗氧化活性檢測(cè)情況A.ABTS radical scavenging capacity B.FRAP total antioxidant capacityFig.1 Results of antioxidant activity test

2.2 對(duì)H9c2細(xì)胞衰老的防護(hù)作用

隨著提取液質(zhì)量濃度的升高，H9c2細(xì)胞存活率逐漸升高，且呈一定的濃度依賴性。結(jié)果表明，在25～200μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，大棚栽培來源與仿野生栽培來源的鐵皮石斛正丁醇提取物對(duì)t-BHP誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞衰老的防護(hù)作用相當(dāng)（P＞0.05）。詳見圖2。

圖2 H9c2細(xì)胞存活情況Fig.2 Survival situation of H9c2 cells

2.3 對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7的免疫調(diào)節(jié)作用

隨著提取液質(zhì)量濃度的升高，RAW264.7細(xì)胞的NO釋放量也逐漸增加，且呈一定的濃度依賴性。結(jié)果表明，在質(zhì)量濃度分別為100μg/mL和200μg/mL時(shí)，仿野生栽培來源鐵皮石斛正丁醇提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO釋放的促進(jìn)作用顯著強(qiáng)于大棚栽培來源提取物（P＜0.05，P＜0.01）。詳見圖3。

圖3 巨噬細(xì)胞RAW264.7 NO釋放情況Note：*P＜0.05，**P＜0.01.Fig.3 NO release from RAW 264.7 macrophages

2.4 對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2增殖的抑制作用

在50～400μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，提取液均可一定程度抑制HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)，在相同質(zhì)量濃度下，大棚栽培來源與仿野生栽培來源的鐵皮石斛正丁醇提取物對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用相當(dāng)（P＞0.05）。詳見圖4。

圖4 肝癌細(xì)胞HepG2增殖抑制情況Fig.4 Inhibition of HepG2 cells proliferation

3 討論

通過比較不同種源鐵皮石斛的黃酮苷類成分特征圖譜及豐度的差異，可將其區(qū)分為丹霞鐵皮種、浙江本地種、云南廣南種及廣西鐵皮蘭種4種種源，且不同種源仿野生與大棚栽培的鐵皮石斛品質(zhì)也存在差異［10］。浙江本地種鐵皮石斛在仿野生栽培、大棚栽培、純野生栽培方式下的多糖、甘露糖、醇溶性浸出物等多種成分含量存在差異［11］。

ABTS自由基清除能力測(cè)試和FRAP法測(cè)定總抗氧化能力廣泛用于評(píng)價(jià)提取物、提取部位等的體外抗氧化活性［6］。本研究中基于上述兩種實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，初步推斷在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，大棚栽培和仿野生栽培來源的鐵皮石斛正丁醇提取物的體外抗氧化活性及效價(jià)相當(dāng)。t-BHP誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞衰老模型可評(píng)價(jià)提取物抗衰老活性［7］。本研究中基于該模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步推斷在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，大棚栽培和仿野生栽培來源的鐵皮石斛正丁醇提取物對(duì)t-BHP誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞衰老的保護(hù)作用及效價(jià)相當(dāng)。肝癌細(xì)胞HepG2可初步評(píng)價(jià)提取物的抗腫瘤活性［9］。本研究結(jié)果提示，大棚栽培和仿野生栽培來源受鐵皮石斛正丁醇提取物均具有一定的抑制HepG2細(xì)胞增殖的作用，且作用及效價(jià)相當(dāng)。鐵皮石斛可通過多途徑、多層面提高機(jī)體免疫功能［6］。巨噬細(xì)胞在免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)過程發(fā)揮關(guān)鍵作用，常被用于體外免疫活性的研究。巨噬細(xì)胞被激活后釋放信號(hào)傳導(dǎo)因子NO，進(jìn)而參與免疫調(diào)節(jié)過程［8，12］。本研究中與大棚栽培來源鐵皮石斛正丁醇提取物比較，仿野生栽培來源提取物可促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放更多的NO，故初步判斷仿野生栽培來源鐵皮石斛正丁醇提取物免疫調(diào)節(jié)作用相對(duì)較強(qiáng)。

綜上所述，大棚栽培來源和仿野生栽培來源鐵皮石斛正丁醇提取物體外抗氧化、抗衰老和抗腫瘤方面的活性相當(dāng)；后者免疫調(diào)節(jié)能力優(yōu)于前者。